蘇美英，梅如冰，隋忠國，周茂金#

（1.泰安市中心醫(yī)院，山東泰安271000；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266003）

白藜蘆醇苷及其代謝物在Beagle犬體內(nèi)的排泄動(dòng)力學(xué)研究

蘇美英1＊，梅如冰1，隋忠國2，周茂金1#

（1.泰安市中心醫(yī)院，山東泰安271000；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266003）

目的：研究白藜蘆醇苷（TRG）及其代謝物在Beagle犬糞樣中的代謝與排泄情況，為TRG的新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：4只Beagle犬ig TRG 20%聚乙二醇400溶液50 mg/kg，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定TRG給藥后12～24 h糞樣中的代謝物，采用高效液相色譜法測定給藥后0～12、12～24、24～36、36～48、48～72、72～96 h TRG在糞樣中主要代謝物[其苷元白藜蘆醇（TR）]以及TR累積排泄率及排泄速率。結(jié)果：在犬糞中可測到TR及TR的2個(gè)硫酸結(jié)合物，其中TR為主要代謝物，未測到TRG。TR在犬糞中排泄速率于給藥后12～24 h時(shí)最大，達(dá)到9.65 mg/h；其累積排泄率為39.3%，相當(dāng)于TRG給藥劑量的67.2%。結(jié)論：犬ig TRG后，TRG主要以TR形式從糞中排出體外。

白藜蘆醇苷；白藜蘆醇；犬；糞便；代謝；排泄

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the metabolite and excretion of polydatin（Trans-resveratrol-3-O-glucoside，TRG） and its metabolites in Beagle dog feces，and provide experimental basis for the new drug development of TRG.METHODS：4 Beagle dogs were intragastrically administrated TRG 20%polyethylene glycol 400 solution 50 mg/kg.LC/MS was used to identify the metabolites of TRG in dog feces after 12-24 h of administration，and HPLC was adopted to determine the cumulative excretion rate and excretion speed rate of the major metabolite resveratrol（TR）in feces samples after 0-12，12-24，24-36，36-48，48-72，72-96 h of administration.RESULTS：TR and two sulfate conjugates of TR were found in dog feces，and TR was a major metabolite，while TRG was undetermined.The excretion speed rate of TR in dog feces was the rapidest after 12-24 h of administration，reaching 9.65 mg/h.Its cumulative excretion rate was 39.3%，equivalent to 67.2%of TRG.CONCLUSIONS：After TRG is intragastrically administrated to dogs，TRG was mainly excreted in the form of TR via dog feces.

KEYWORDSPolydatin；Resveratrol；Dogs；Feces；Metabolism；Excretion

白藜蘆醇苷（Trans-resveratrol-3-O-glucoside，TRG）屬于二苯乙烯苷類化合物，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤及心血管、神經(jīng)和肝肺保護(hù)作用[1-4]。該化合物廣泛存在于虎杖[5-6]等各種植物中，有望成為治療心腦血管疾病的候選藥物。為進(jìn)一步探討該化合物是否具有成藥性，筆者研究了TRG在Beagle犬體內(nèi)的代謝與排泄規(guī)律，為TRG的新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Hewlett-Packard 1100高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1322A四元梯度泵、G1314A紫外檢測器、G1316A柱溫箱、G1322A脫氣機(jī)、Rev.A.06.03色譜工作站（美國惠普公司）；LD5-2A離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；LCQ液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MSn）儀，配有電噴霧離子源（ESI）和XcaLibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Finnigan公司）。

1.2 藥品與試劑

TRG原料藥（批號：20030915，純度：99.5%）、白藜蘆醇（TR）對照品（批號：20030915，純度：98.5%）均由沈陽市萬嘉生物技術(shù)研究所提供；黃芩苷對照品（內(nèi)標(biāo)，中國食品藥品檢定研究院，批號：20030621，純度：99.6%）；甲醇、乙腈為色譜純。

1.3 動(dòng)物

Beagle犬4只，♂♀各半，體質(zhì)量（10.0～15.0）kg，由沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK（遼）2003-0011。

2 方法與結(jié)果

2.1 糞樣中TRG的代謝物鑒定與含量測定條件

2.1.1 色譜條件色譜柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃。代謝物含量測定中，流動(dòng)相：乙腈-0.25%甲酸（27∶73，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：320 nm；進(jìn)樣量：50 μL。代謝物鑒定中，流動(dòng)相：乙腈-10 mmol/L醋酸銨溶液（25∶75，V/V）；流速：0.5 mL/min；檢測波長：320 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用ESI，負(fù)離子方式檢測，離子源噴射電壓：4.25 kV；毛細(xì)管溫度：200℃；毛細(xì)管電壓：6.25 V；鞘氣流速：1.05 L/min；輔助氣流速：0.15 L/min；采用一級、二級和三級全掃描方式。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取TR 10 mg，乙腈溶解，制成質(zhì)量濃度為400 μg/mL的TR貯備液；精密量取TR貯備液適量，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.100、0.250、1.00、4.00、20.0、100 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取黃芩苷10.0 mg，乙腈溶解，制成質(zhì)量濃度為400 μg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液；精密量取內(nèi)標(biāo)貯備液適量，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為20.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 給藥與取樣

實(shí)驗(yàn)前犬禁食12 h，自由飲水，同時(shí)收集空白糞樣。犬ig TRG 20%聚乙二醇400溶液50 mg/kg 1次（給藥劑量為前期藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)所得劑量），給藥后4 h進(jìn)食。分別收集給藥后0～12、12～24、24～36、36～48、48～72、72～96 h各時(shí)間段糞樣，稱定質(zhì)量后，－20℃保存，待測。

2.4 糞樣預(yù)處理

2.4.1 代謝物鑒定 取給藥后12～24 h糞樣1.0 g，研磨均勻后加入甲醇2 mL，超聲（功率：1 000 W，頻率：30 kHz，下同）10 min，離心（離心半徑：10 cm，轉(zhuǎn)速：4 000 r/min，下同）10 min，取上清液20 μL行LC/MSn分析。

2.4.2 代謝物含量測定 將各時(shí)間段糞樣研磨均勻后加入甲醇2 mL，超聲15 min，離心10 min，制得50%（V/V）犬糞勻漿。取犬糞各時(shí)間段勻漿100 μL（其中0～12、12～24、24～36、36～48 h樣品用空白糞樣勻漿稀釋10倍，其余不稀釋），分別加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μL、0.5%甲酸100 μL、乙腈100 μL，搖勻，于40 ℃氮?dú)饬鞔蹈伞堅(jiān)粤鲃?dòng)相定容至100 μL，取50 μL進(jìn)樣測定。

TRG和TR遇光不穩(wěn)定，易發(fā)生異構(gòu)化，因此整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)避光操作。

2.5 糞樣中代謝物的鑒定

犬給藥后12～24 h糞樣的總離子流（TIC）圖和選擇離子（SIM）譜圖見圖1。

由圖1A可以看出，負(fù)離子模式下，選擇碎片離子m/z 389（TRG的質(zhì)荷比）檢測，結(jié)果未檢測出碎片離子，說明糞樣中未檢測到原型藥（TRG）；由圖1B可知，選擇性檢測碎片離子m/z 227，在保留時(shí)間43.5 min處發(fā)現(xiàn)1個(gè)色譜峰（M1），分子量比TRG少162 Da。對碎片離子m/z 227進(jìn)行二級全掃描質(zhì)譜分析，其脫去中性分子C2H2O（－42 Da），主要得到碎片離子為m/z 185，推測M1為TRG脫去葡萄糖后形成的TR。取“2.2”項(xiàng)下的TR貯備液行LC/MSn分析，所得的一級、二級全掃描質(zhì)譜圖及色譜保留時(shí)間與M1相同，由此確認(rèn)M1即為TR。TRG和TR的二級全掃描質(zhì)譜圖見圖2、圖3。由圖1C可知，選擇性檢測碎片離子m/z 307，在保留時(shí)間11.1、22.8 min處發(fā)現(xiàn)2個(gè)色譜峰（M2和M2’），但二者的質(zhì)譜斷裂規(guī)律一致，分子量均比TR多80 Da，推測二者為同分異構(gòu)體。對碎片離子m/z 307進(jìn)行二級全掃描質(zhì)譜分析，得到主要碎片離子均為m/z 227（－80 Da），選擇性對m/z 227進(jìn)行三級全掃描質(zhì)譜分析，得到的質(zhì)譜圖與TR的二級全掃描質(zhì)譜圖相同，結(jié)合文獻(xiàn)[7]推測M2和M2’為TR與硫酸結(jié)合后形成的2種硫酸結(jié)合物。M2和M2’的二級全掃描質(zhì)譜圖見圖4、圖5。

圖1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖Fig 1 LC/MS chromatograms

圖2 TRG的二級全掃描質(zhì)譜圖Fig 2 Mass spectrum of two-level full-scanning of TRG

圖3 M1（TR）的二級全掃描質(zhì)譜圖Fig 3 Mass spectrum of two-level full-scanning of M1（TR）

2.6 糞樣中TR分析方法學(xué)研究

2.6.1 方法的選擇性 取犬空白糞樣勻漿，按“2.4.2”項(xiàng)下方法處理（不加內(nèi)標(biāo)），獲得空白樣品；將TR標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.250 μg/mL）和內(nèi)標(biāo)溶液（20.0 μg/mL）分別加入犬空白糞樣勻漿中，按“2.4.2”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣測定，獲得相應(yīng)的色譜圖。結(jié)果，TR和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為18.1、15.9 min，犬糞樣勻漿樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾TR及內(nèi)標(biāo)的測定，詳見圖6。

圖4 M2的二級全掃描質(zhì)譜圖Fig 4 Mass spectrum of two-level full-scanning of M2

圖5 M2’的二級全掃描質(zhì)譜圖Fig 5 Mass spectrum of two-level full-scanning of M2’

圖6 高效液相色譜圖Fig 6 HPLC chromatograms

2.6.2 糞樣勻漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取犬空白糞樣勻漿100 μL，分別加入TR系列標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，配制質(zhì)量濃度為0.100、0.250、1.00、4.00、20.0、100 μg/mL的樣品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下方法操作，按“2.1.1”項(xiàng)下代謝物含量測定色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以TR質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、TR與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝0.071 2x+0.006 82（r＝0.998 1）。結(jié)果表明，犬糞樣勻漿中TR的檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.100～100 μg/mL，定量下限為0.100 μg/mL。

2.6.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按“2.6.2”項(xiàng)下方法分別制備含TR低、中、高濃度（0.250、4.00、80.0 μg/mL）的犬糞樣勻漿質(zhì)控樣品溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下方法操作，每個(gè)濃度樣品濃度進(jìn)樣6次，連續(xù)進(jìn)樣3 d。結(jié)果，低、中、高濃度樣品濃度日內(nèi)精密度的RSD分別為4.32%、5.84%、6.13%（n＝6），日間精密度的RSD分別為3.18%、7.90%、4.33%（n＝18），準(zhǔn)確度分別為－0.030%、－2.190%、－0.370%（n＝18）。

2.6.4 絕對回收率試驗(yàn) 取“2.6.3”項(xiàng)下低、中、高濃度質(zhì)控樣品溶液，各6份，進(jìn)樣測定，得相應(yīng)峰面積A；另用水代替糞樣勻漿，按“2.6.2”項(xiàng)下方法操作，制備相應(yīng)質(zhì)量濃度的樣品溶液，各6份，同法測定，得相應(yīng)峰面積，并計(jì)算平均值B；以A/B×100%計(jì)算絕對回收率。結(jié)果，低、中、高濃度樣品溶液的絕對回收率分別為91.8%、96.1%、93.5%（n＝6）。

2.6.5 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.6.3”項(xiàng)下低、中、高濃度質(zhì)控樣品溶液，各5份，分別考察－20℃反復(fù)凍融3次、－20℃冷凍30 d及室溫避光放置12 h的穩(wěn)定性。結(jié)果，低、中、高濃度質(zhì)控樣品溶液－20℃反復(fù)凍融3次的RSD分別為6.00%、4.50%、2.10%（n＝5）；－20℃冷凍30 d的RSD分別為6.20%、5.40%、4.40%（n＝5）；室溫避光放置12 h的RSD分別為6.80%、5.90%、4.80%（n＝5）。

2.7 TRG在犬糞中的排泄研究

計(jì)算糞樣TR的排泄量、累積排泄率（累積排泄量/給藥量×100%）及排泄速率，并繪制犬糞樣中TR的累積排泄率-時(shí)間曲線，結(jié)果見圖7。

圖7 累積排泄率-時(shí)間曲線Fig 7 Cumulative excretion curves rate-time

由圖7可知，犬ig TRG 50 mg/kg后，糞中TR的累積排泄率為39.3%，相當(dāng)于原型藥TRG給藥劑量的67.2%（39.3%×390/228，390和228分別是TRG和TR的物質(zhì)的量）。TR在犬糞中排泄率于給藥后12～24 h時(shí)最大，達(dá)到9.65 mg/h。由此可見，犬ig TRG后，主要以TR的形式從糞中排出體外。

3 討論

藥動(dòng)學(xué)研究是新藥研究與開發(fā)過程中不可缺少的重要環(huán)節(jié)，可為新藥研究的其他階段提供理論依據(jù)。藥物代謝過快可導(dǎo)致生物利用度下降，而代謝生成的代謝物是否具有活性和毒性都會(huì)影響到候選化合物是否具有成藥性。TRG在大鼠體內(nèi)的代謝[7]及藥動(dòng)學(xué)和組織分布[8-14]已有報(bào)道，在豬[15]和犬[16]體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)也有研究，但基于犬糞內(nèi)的代謝物與排泄的藥動(dòng)學(xué)研究至今尚未見報(bào)道。因此，本文對犬ig TRG后，對其在犬糞中的代謝物與排泄物進(jìn)行了研究。

Wang D等[8]研究表明，TRG與大鼠腸內(nèi)容物孵化后，在孵化液中可測到3種代謝物，一種是TRG的雙鍵還原代謝物，另一種是脫糖代謝物TR，TR的雙鍵又進(jìn)一步還原形成TR還原代謝物；大鼠ig TRG后，在尿中可檢測到4種代謝物，分別是TR、TR的單硫酸結(jié)合物、TRG的單硫酸結(jié)合物和TRG的單葡萄糖醛酸結(jié)合物。Du QH等[3]報(bào)道大鼠ig TRG后，98.4%的TRG在腸和肝內(nèi)代謝，尿中主要代謝產(chǎn)物為TR的單葡萄糖醛酸結(jié)合物，含量達(dá)到84.0%。但筆者曾在預(yù)實(shí)驗(yàn)中測得犬尿中除有原型藥TRG外，還有TRG的2個(gè)單葡萄糖醛酸結(jié)合物和TR，由于TRG及其代謝物的含量均很低，因此未進(jìn)行定量分析；在糞中可測到3種代謝物，分別是TR和TR的2個(gè)單硫酸結(jié)合物，而原型藥TRG未測到，其中TR為主要代謝物。這表明TRG在大鼠和犬體內(nèi)的代謝存在著種屬差異。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測TRG在犬尿中代謝途徑為：TRG水解脫去葡萄糖形成TR，或者直接與葡萄糖醛酸結(jié)合形成單葡萄糖醛酸結(jié)合物；在犬糞中代謝途徑為：TRG首先水解脫去葡萄糖形成TR，TR進(jìn)一步與硫酸結(jié)合形成2個(gè)單硫酸結(jié)合物。M2、M2’和2個(gè)TRG單葡萄糖醛酸結(jié)合物的結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

關(guān)于TRG在犬糞樣中的排泄研究，由于在糞樣中未測到原型藥TRG，且M2和M2’的含量較低，而TR為主要代謝物，因此筆者僅對TR進(jìn)行了定量分析。TRG結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)共軛苯環(huán)，在320 nm波長處具有最大吸收，因此筆者以320 nm為檢測波長，建立了犬糞樣中TR的HPLC檢測法。本法靈敏度高、操作簡單，定量下限為0.100 μg/mL，絕對回收率大于90.0%，可用于TR在犬糞樣中的排泄研究。

綜上所述，犬ig TRG 50 mg/kg后，糞中可測到3個(gè)代謝物，TR為主要代謝物，其累積排泄率為39.3%（相當(dāng)于TRG給藥劑量的67.2%）。在犬尿和糞中尚有其他未知代謝物未能測定，未知代謝物的結(jié)構(gòu)及累積排泄率尚需深入研究，這對TRG的新藥開發(fā)具有重要的意義。

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（編輯：劉明偉）

Study on the Excretion Pharmacokinetics of Polydatin and Its Metabolite in Beagle Dogs

SU Meiying1，MEI Rubing1，SUI Zhongguo2，ZHOU Maojin1
（1.Tai’an Central Hospital，Shandong Tai’an 271000，China；2.The Affiliated Hospital of Qingdao University，Shandong Qingdao 266003，China）

R917

A

1001-0408（2017）25-3514-04

2016-10-20

2017-06-29）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.16

＊副主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0538-6298258。E-mail：tasumeiying@163.com

#通信作者：主任藥師，博士。研究方向：藥動(dòng)學(xué)。電話：0538-6298258。E-mail：mjzhoutj@sina.com