張迪，邢宇，王楊，孔敏，李新莉

（大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，遼寧大連116044）

殼聚糖降解衍生物的抗氧化活性及對藥物性肝損傷纖維化的預(yù)防作用Δ

張迪＊，邢宇，王楊，孔敏，李新莉#

（大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系，遼寧大連116044）

目的：研究殼聚糖（CTS）降解衍生物的體外抗氧化活性及對藥物性肝損傷纖維化的預(yù)防作用。方法：采用酸水解法制備不同水解時(shí)間（3、6、8、10 h）的CTS降解衍生物CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10，測定CTS及其降解衍生物的黏均分子量和脫乙酰度，通過檢測其對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和超氧負(fù)離子（O2－）自由基的體外清除能力評價(jià)其抗氧化活性。以CTS-10進(jìn)行體內(nèi)肝損傷纖維化的預(yù)防實(shí)驗(yàn)，將小鼠隨機(jī)分為正常對照組（水）、模型組（水）和CTS-10高、中、低劑量組（100、50、25 mg/mL），每組8只，每天ig給藥0.2 mL，連續(xù)24 d后停藥；繼而連續(xù)ig鹽酸左氧氟沙星7 d建立藥物性肝損傷模型（正常對照組除外）。采用Western blot法檢測小鼠肝組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）和飾膠蛋白聚糖（Decorin）蛋白的表達(dá)。結(jié)果：CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10的黏均分子量分別為21.70×104、6.70×104、6.30×104、5.01×104、4.87×104，脫乙酰度分別為83.44%、74.62%、67.28%、64.83%、54.23%；對DPPH和O2－自由基均有一定的清除能力，其中CTS-10清除能力最強(qiáng)，分別為25.47%和56.31%。與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1和Decorin蛋白表達(dá)均增強(qiáng)（P＜0.05）；與模型組比較，CTS-10中、高劑量組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1和Decorin蛋白表達(dá)均減弱（P＜0.01）。結(jié)論：CTS降解衍生物中CST-10的黏均分子量和脫乙酰度較低，具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，對小鼠藥物性肝損傷纖維化有一定的預(yù)防作用。

殼聚糖；降解衍生物；抗氧化活性；藥物性肝損傷；肝纖維化；小鼠

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the in vitro antioxidant activity of chitosan（CTS）degradation derivatives and its preventive effects on drug-induced liver injury fibosis.METHODS：Acid hydrolysis method was used to prepare the CTS degradation derivatives CTS-3，CTS-6，CTS-8，CTS-10 for different hydrolysis time（3，6，8，10 h）.The viscosity-average relative molecular mass and deacetylation degree of CTS and its degradation derivatives were determined，and its antioxidant activity was evaluated by detecting its in vitro scavenging ability on 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine（DPPH）and superoxide anion（O2－）radicals.Using CTS-10 for in vivo liver injury fibosis prevention test，mice were randomly divided into normal control group（water），model group（water），CTS-10 high-dose，medium-dose，low-dose groups（100，50，25 mg/mL），8 in each group.Mice were intragastrically administrated 0.2 mL，then withdrawal after continuous 24 d.Then levofloxacin hydrochloride was intragastrically given for 7 d to establish drug-induced liver injury model（except for normal control group）.Western blot method was used to detect the expressions of tumor necrosis factor α（TNF-α），transforming growth factor β1（TGF-β1）and Decorin protein in liver tissue of mice.RESULTS：The viscosity-average relative molecular mass of CTS，CTS-3，CTS-6，CTS-8，CTS-10 were 21.70×104，6.70×104，6.30×104，5.01×104，4.87×104；and deacetylation degree were 83.44%，74.62%，67.28%，64.83%，54.23%，respectively.All of them had certain scavenging ability on DPPH and O2－，in which，CTS-10 was the strongest（25.47%and 56.31%）.Compared with normal control group，expressions of TNF-α，TGF-β1and Decorin protein in liver tissue in model group were enhanced（P＜0.05）.Compared with model group，expressions of TNF-α，TGF-β1and Decorin protein in liver tissue in CTS-10 medium-dose and high-dose groups were weakened（P＜0.01）.CONCLUSIONS：The viscosity-average relative molecular mass and deacetylation degree of CTS-10 in CTS degradation derivatives are lower with stronger antioxidant activity，and show certain preventive effects on drug-induced liver injury fibosis in mice.

KEYWORDSChitosan；Degradation derivatives；Antioxidant activity；Drug-induced liver injury；Liver fibosis；Mice

藥物性肝損傷（Drug-induced liver injury，DILI）是由藥物本身或其代謝產(chǎn)物所導(dǎo)致的肝臟損傷，是一種在中國乃至世界范圍內(nèi)常見的疾病，藥物停用后自行緩解。DILI臨床類型分為肝細(xì)胞型、膽汁淤積型、混合型3種，主要以肝細(xì)胞型肝損傷為主[1]。肝承擔(dān)著藥物清除、生物轉(zhuǎn)化等功能，幾乎所有藥物都會對肝造成負(fù)擔(dān)，引起肝損傷。中草藥、中成藥所致DILI比例占40%，然后依次是抗生素、抗腫瘤藥和抗結(jié)核藥以及抗心血管病藥物[2]。由于抗生素濫用情況嚴(yán)重，由其所致的DILI具有發(fā)生率高、病死率高、可預(yù)測性低等特點(diǎn)。其中，喹諾酮類抗生素如左氧氟沙星、環(huán)丙沙星等，都可能導(dǎo)致暫時(shí)性DILI[3]，當(dāng)其與一些藥物聯(lián)用時(shí)還可使毒性增加。

殼聚糖（Chitosan，CTS）化學(xué)名稱為聚合β-（1，4）-N-乙酰-D-葡萄糖胺，水解可生成水溶性殼聚糖（Water soluble chitosan，WCS）和低分子殼寡糖（Chitooligosaccharide，COS）。已有研究表明，CTS及其衍生物有抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能作用[4-5]，對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羥自由基有一定的清除能力[6]，可以抑制真菌、酵母菌、細(xì)菌等的生長[7]，還具有降脂[8]、調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)[9]等活性。本文研究了不同黏均分子量和脫乙酰度（DD）的CTS降解衍生物的體外抗氧化活性和對DILI纖維化的預(yù)防作用，初步探討了CTS降解衍生物的保肝護(hù)肝作用。

1 材料

1.1 儀器

奧氏黏度計(jì)（昆山廣測儀器設(shè)備有限公司）；UVS-1渦旋振蕩器（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)有限公司）；MV-Ⅱ垂直板電泳裝置、ST-Ⅰ半干式轉(zhuǎn)移電泳儀（大連競邁生物科技有限公司）；真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；全自動凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

CTS原料藥（濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司，批號：050112，DD：≥80%）；鹽酸左氧氟沙星膠囊（?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰荆枺篐20055533，規(guī)格：每粒0.2 g）；兔源β肌動蛋白（β-actin）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、飾膠蛋白聚糖（Decorin）抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；Pierce化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光（ECL）試劑盒（美國Thermo公司）；甲基橙、RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；DPPH（美國Sigma公司，批號：D9132-1G，純度：99%）；維生素C（天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，批號：XK13-2010344，分析純）；其他試劑均為市售分析純。

1.3 動物

SPF級KM小鼠，♀♂各半，體質(zhì)量18～22 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號為：SCXK（遼）2008-0002。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)大連醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過。

2 方法

2.1 CTS降解衍生物的制備

稱取2 g CTS 4份，分別裝于250 mL錐形瓶中，加入200 mL的1%醋酸溶液，充分溶解后，加入10 mL濃HCl，并用牛皮紙封口后放入80℃的恒溫水浴鍋中水解，4份溶液分別水解3、6、8、10 h。然后滴加1 mol/L的NaOH溶液中和，使CTS沉淀，4 000 r/min（離心半徑6 cm，下同）離心10 min，用蒸餾水清洗沉淀物2次，調(diào)pH至7左右；繼續(xù)4 000 r/min離心10 min，取沉淀物，冷凍干燥，得到CTS降解衍生物CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10。

2.2 黏均分子量的測定

將CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10各0.2 g分別溶于0.1 mol/L醋酸鈉-0.2 mol/L醋酸緩沖溶液中，于50 mL量瓶中定容制成樣品溶液。將奧氏黏度計(jì)固定在25℃的恒溫水浴中，吸取10 mL樣品溶液于奧氏黏度計(jì)中，平衡10 min，用秒表測定溶液的流出時(shí)間t，連續(xù)測3次，每次結(jié)果相差不得超過0.1 s。同時(shí)，測定空白溶劑（0.1 mol/L醋酸鈉-0.2 mol/L醋酸緩沖溶液）的流出時(shí)間t0。按一點(diǎn)法[10]計(jì)算各樣品的黏均分子量。

2.3 DD的測定

分別稱取約0.25 g 的CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10，加入20 mL 0.1 mol/L HCl溶液，室溫?cái)嚢? h至全部溶解，加入10 mL蒸餾水稀釋，再加入3滴1%甲基橙指示劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至溶液由黃色變?yōu)榧t色，重復(fù)3次，按文獻(xiàn)[11]計(jì)算各樣品的DD。

2.4 體外抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH自由基清除率的測定 稱取DPPH 1 mg溶于20 mL二甲基亞砜（DMSO）中，避光保存?zhèn)溆?。CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10分別用DMSO配制成質(zhì)量濃度為13.3、20.0、26.6、53.3、67.7 μg/mL的溶液，分別與DPPH溶液在室溫下避光反應(yīng)30 min，于519 nm波長處測定吸光度。以1 mg/mL維生素C為陽性對照，重復(fù)測定 3次，計(jì)算 CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10對DPPH自由基的清除率。

2.4.2 超氧負(fù)離子（O2－）自由基清除率的測定 將0.1 mol/L HCl-Tris緩沖液（pH 8.2）和鄰苯三酚溶液（用10 mmol/L HCl配制成50 mmol/L）在25℃水浴中保溫備用。取4.5 mL HCl-Tris緩沖液加入4.4 mL蒸餾水、0.1 mL鄰苯三酚溶液，搖勻后于325 nm波長處測定吸光度，記為 A0。CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10 分別用Hcl-Tris緩沖液配制成質(zhì)量濃度為14.43、16.89、18.87、18.95、22.57 μg/mL的溶液，分別加入0.1 mL鄰苯三酚溶液，搖勻，按上述方法測定吸光度，記為A1。以10 mmol/L HCl為空白對照、1 mg/mL維生素C為陽性對照，重復(fù)測定3次，計(jì)算CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10對O2－自由基的清除率。

2.5 對DILI纖維化的預(yù)防作用考察

2.5.1 分組與給藥 通過上述試驗(yàn)，篩選黏均分子量和DD較低且具有一定抗氧化活性的CTS-10進(jìn)行體內(nèi)DILI的預(yù)防作用研究。將CTS-10和鹽酸左氧氟沙星分別溶于無菌水中制成水溶性CTS-10高、中、低濃度溶液（100、50、25 mg/mL）[12]和鹽酸左氧氟沙星溶液（60mg/mL）[13]。取小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組和CTS-10高、中、低劑量組，每組8只。正常對照組和模型組小鼠每天ig水0.2 mL，各給藥組小鼠ig相應(yīng)藥物0.2 mL，24 d后停藥；除正常對照組外其余各組小鼠繼而ig鹽酸左氧氟沙星溶液7 d，每天0.2 mL以建立DILI模型。第8天處死小鼠，迅速剝離肝臟，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 肝組織蛋白質(zhì)提取 取各組小鼠肝組織50～100 mg，剪碎，用預(yù)冷的生理鹽水洗滌2次，加入0.5 mL預(yù)冷的蛋白裂解液[RIPA-甲苯基磺酰氟（100∶1，V/V）]，勻漿至95%的細(xì)胞破碎，在冰浴中放置30 min，4℃下12 000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，分裝，－80℃保存。電泳前，使用考馬斯亮藍(lán)法檢測其中蛋白質(zhì)濃度[14]。

2.5.3 Western blot法檢測肝組織中 TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達(dá) 取“2.5.2”項(xiàng)下肝組織蛋白，進(jìn)行常規(guī)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。蛋白上樣量為80μg，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，待預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品（Marker）充分被分開，停止電泳。用半干式電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉NC膜1 h，分別與兔源β-actin（1∶500稀釋）、TNF-α（1∶500稀釋）、TGF-β1（1∶500稀釋）、Decorin（1∶500稀釋）抗體結(jié)合，4℃過夜，TBST緩沖液洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體（1∶5 000稀釋）孵育2 h，ECL發(fā)光，凝膠成像。以β-actin為內(nèi)參，采用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行蛋白灰度值分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

2.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)計(jì)量指標(biāo)采用x±s表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黏均分子量和DD

CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10的黏均分子量分別為 21.70×104、6.70×104、6.30×104、5.01×104、4.87×104，DD 分別為 83.44%、74.62%、67.28%、64.83%、54.23%。結(jié)果表明，隨著水解時(shí)間的延長，CTS降解衍生物的黏均分子量減小，DD也相應(yīng)減小。由于DD高的CTS分子內(nèi)氨基和羥基含量較多，易形成較強(qiáng)的氫鍵，不溶于水；且由于氫鍵的存在，CTS分子具有一定規(guī)整性，易形成結(jié)晶區(qū)，也使其難溶于水[15]。因此，當(dāng)DD為50%時(shí)CTS具有水溶性，DD＞60%時(shí)CTS則不溶于水。綜上，CST-10的DD為54.23%，黏均分子量為4.87×104，具有較好的水溶性；其他CTS降解衍生物的水溶性均相對較差。

3.2 抗氧化活性

維生素C對DPPH自由基和O2－自由基的清除能力很強(qiáng)，清除率分別為93.89%和100%。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，CTS、CTS-3、CTS-6、CTS-8、CTS-10對DPPH自由基和O2－自由基均有一定的清除能力，但相對于維生素C，其清除能力低很多，其中67.7 μg/mL的CTS-10對DPPH自由基的清除率為25.47%，22.57 μg/mL的CTS-10對O2－自由基的清除率為56.31%，表明CTS-10具有一定的抗氧化活性。6種樣品對DPPH和O2－自由基的清除率-質(zhì)量濃度曲線見圖1。

圖1 6種樣品對DPPH和O2－自由基的清除率-質(zhì)量濃度曲線Fig 1 Scavenging rate-mass concentration curves ofsix samples on DPPH and O2－radicals

3.3 肝組織中TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達(dá)

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；與模型組比較，CTS-10中、高劑量組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達(dá)均明顯減弱（P＜0.01）。各組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，測定結(jié)果見圖3。

圖2 各組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 2 Electrophoresis chart of expressions of TNF-α，TGF-β1，Decorin protein in liver tissue of mice in each group

圖3 各組小鼠肝組織中TNF-α、TGF-β1、Decorin蛋白表達(dá)的測定結(jié)果Fig 3 Determination results of expressions of TNF-α，TGF-β1，Decorin protein in liver tissue of mice in each group

4 討論

藥物具有二重性，一方面其能夠防病治病，另一方面其也可危害機(jī)體，引起生理、生化功能的紊亂和組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變。抗生素是臨床治療感染性疾病的主要藥物，但長期大量使用抗生素會導(dǎo)致胃腸道反應(yīng)、過敏反應(yīng)、多器官損傷等[16]。鹽酸左氧氟沙星主要用于治療革蘭氏陰性菌引起的炎癥感染，臨床應(yīng)用較廣。自2001年Karim A等[17]報(bào)道首例由左氧氟沙星致肺損傷的病例之后，陸續(xù)有類似病例出現(xiàn)。

在肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中，肝細(xì)胞線粒體和肝細(xì)胞膜被損傷，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)并激活TNF-α和TGF-β1，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞分泌眾多細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM），導(dǎo)致了肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。Decorin作為ECM的一個主要組分，在正常肝臟中是微量的，其含量隨纖維化進(jìn)展而穩(wěn)定增加，具有突出的抑制膠原纖維合成以及調(diào)控TGF-β1活性的功能，在TGF-β1功能調(diào)節(jié)中起重要作用。

CTS為甲殼素完全或部分脫乙?；a(chǎn)物，是一種有生物相容性、生物降解性、生物活性且無毒的高聚物，具有廣泛的開發(fā)前景[18]。但是較大黏均分子量的CTS導(dǎo)致其溶解度較低，限制了其在醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此，低黏均分子量CTS的制備引起了人們的關(guān)注。

本研究結(jié)果表明，隨著水解時(shí)間的加長，CTS水解產(chǎn)物的黏均分子量減小，DD也相應(yīng)減小。其中CTS-10的黏均分子量和DD較低，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對小鼠DILI纖維化有一定的預(yù)防作用。

綜上推測，CTS降解衍生物對DILI纖維化的預(yù)防作用機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，抑制TNF-α、TGF-β1和Decorin蛋白的表達(dá)有關(guān)。由于腸道與肝之間有著重要聯(lián)系[19]，腸血液回流到門靜脈，腸道菌群的組成會影響肝功能；反之，肝通過膽汁分泌也可影響腸道菌群功能，因此后續(xù)將開展腸道菌群與肝損傷的相關(guān)研究。

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Antioxidant Activity and Preventive Effects of Chitosan Degradation Derivatives on Drug-induced Liver Injury Fibosis

ZHANG Di，XING Yu，WANG Yang，KONG Min，LI Xinli
（Dept.of Biotechnology，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 116044，China）

R285.5

A

1001-0408（2017）25-3498-04

2016-11-09

2017-01-19）

（編輯：鄒麗娟）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.12

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（No.L2016004）

＊本科生。研究方向：生物制藥。電話：0411-86110296。E-mail：2711395747@qq.com

#通信作者：講師。研究方向：藥物與腸道微生態(tài)。電話：0411-86110296。E-mail：lixinlibio@163.com