劉天波, 周志成, 彭曙光, 曾維愛, 唐前君

(1. 湖南省煙草科學研究所, 長沙 410004; 2. 湖南省煙草公司, 長沙 410004;3. 湖南省長沙市煙草公司, 長沙 410010; 4. 湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 長沙 410128)

基于全基因組編碼區(qū)序列的煙草花葉病毒分子進化分析

劉天波1,4, 周志成1, 彭曙光2, 曾維愛3, 唐前君4*

(1. 湖南省煙草科學研究所, 長沙 410004; 2. 湖南省煙草公司, 長沙 410004;3. 湖南省長沙市煙草公司, 長沙 410010; 4. 湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 長沙 410128)

為揭示煙草花葉病毒分子進化特征,從GenBank中下載已報道的煙草花葉病毒全基因組編碼區(qū)序列,進行重組、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳變異、種群結(jié)構(gòu)和基因漂流等分析。結(jié)果表明:突變和負選擇作用是驅(qū)動煙草花葉病毒進化的主要作用力,種群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,處于擴張趨勢中,基因變異程度低,重組在煙草花葉病毒分子進化中作用不明顯。煙草花葉病毒不同分離物形成3個有一定地理相關(guān)性的種群ChinaⅠ、China Ⅱ和Europe。歐洲分離物核苷酸序列多樣性比中國的差異大,Europe和ChinaⅠ種群可能受到遺傳漂變影響,Europe與China Ⅱ、ChinaⅠ與China Ⅱ之間存在發(fā)生基因交流的渠道。

煙草花葉病毒; 全基因組編碼序列; 系統(tǒng)發(fā)育; 分子進化

煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)是煙草花葉病毒屬Tobamovirus的代表成員,是危害最嚴重的病毒之一[1]。由TMV侵染引起的煙草花葉病在全世界煙草栽培地區(qū)普遍發(fā)生,已成為威脅中國煙葉生產(chǎn)的主要病害之一,且近年來呈日趨嚴重的趨勢[2]。TMV寄主范圍廣,可侵染30 個科、310 多種植物,地理分布廣泛,分布于中國、韓國、西班牙和美國等多個國家[3-6]。TMV具有較多的株系,目前沒有統(tǒng)一的劃分標準,主要株系有TMV-OM、TMV-U1、TMV-Vulgare、TMVRS、TMVC、TMVN、TMVY[7-8]。TMV是一種正單鏈RNA病毒,基因組全長6 395個核苷酸(nucleotide, nt),共編碼4 個開放閱讀框(open reading frame, ORF),ORF1編碼126 kD的蛋白質(zhì),其終止密碼子(UAG)是滲漏性的(leaky),產(chǎn)生了一個較大的183 kD的通讀蛋白ORF2,ORF2的末端5個密碼子與編碼30 kD蛋白質(zhì)的ORF3重疊,ORF3終止于ORF4的起始密碼子前兩個核苷酸的位置,ORF4編碼17.6 kD的外殼蛋白[9-10]。

目前,源于不同國家或地區(qū)、不同寄主病毒分離物的基因序列不斷被報道,通過生物信息學技術(shù)和方法對這些序列加以分析和研究,明確病毒不同分離物的起源、親緣關(guān)系、遺傳變異和分子進化,了解全球范圍內(nèi)或地域內(nèi)病毒的發(fā)展動態(tài)和趨勢,對監(jiān)測和防控病毒病具有重要意義。但是,這類分析是建立在一定數(shù)量的病毒株系(或分離物) 序列基礎(chǔ)上,部分病毒由于報道的全序列或編碼區(qū)序列數(shù)量有限,目前還無法全面分析其變異進化規(guī)律和株系間親緣關(guān)系特征,另外基于一個或多個基因進行分析,其結(jié)果往往帶有一定的片面性。賈琳等[11]對豬瘟病毒Classicalswinefevervirus(CSFV) 基因組全編碼區(qū)進行了選擇壓力及重組分析,發(fā)現(xiàn)重組改變了重組株所在的進化樹分支,影響了CSFV 的遺傳多樣性,針對宿主免疫系統(tǒng)的選擇壓力而產(chǎn)生的突變和重組推動了病毒編碼區(qū)基因的進化。張新珩等[12]對雞傳染性貧血病毒Chickenanemiavirus(CAV)全基因組編碼區(qū)進行變異點和分子進化分析,監(jiān)測了廣東省CAV序列變異情況及流行特點。這類基于基因組全編碼區(qū)的分子進化分析, 其分析結(jié)果更具參考價值。

TMV全基因組序列的報道不斷增加,研究多集中在單一序列的結(jié)構(gòu)分析上,如復(fù)制酶、移動蛋白 (movement protein, MP)、外殼蛋白(coat protein, CP)序列結(jié)構(gòu)分析[13-15]等。但對來自不同國家或地區(qū)、不同寄主上的TMV株系或分離物,其起源、變異或重組、種群結(jié)構(gòu)、進化機制等方面研究卻鮮有報道。本研究以目前已報道的TMV 全基因組編碼區(qū)序列為研究對象,進行重組、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳變異、基因交流和種群結(jié)構(gòu)分析,揭示TMV分子變異進化特征,為TMV的抗病育種和防治提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

從 NCBI 上下載目前已報道的所有的TMV 分離物全基因組序列(截至2016年10月31日),共獲得72條TMV分離物全基因序列,并選取2株近緣物種番茄花葉病毒Tomatomosaicvirus(ToMV)分離物作為外群。

1.2 方法

1.2.1 序列數(shù)據(jù)處理

用BioEdit[16]對所有的數(shù)據(jù)進行修正處理,去掉序列中存在的瑕疵并刪除終止密碼子。將整理后的序列用ClustralX2[17]比對,這種比對產(chǎn)生的結(jié)果可能存在部分 gap 不是 3 的倍數(shù),因此將核苷酸序列數(shù)據(jù)對應(yīng)的氨基酸序列再用 TransAlign[18]軟件比對,以保證經(jīng)過序列比對后得到的核苷酸序列能夠正確地編譯出氨基酸序列。TMV的分離物ORF3和ORF4之間一般存在基因間隔區(qū),經(jīng)過上述一系列的序列處理后,去掉基因間隔區(qū),然后將所有的ORF組裝在一起進行后續(xù)的分析。

1.2.2 重組分析

利用RDP4.0[19]軟件包中的 RDP、Geneconv、Bootscan、Maxchi、Chimaera、3Seq和 Siscan檢測可能存在的重組位點,利用SimPlot軟件進行檢測驗證重組位點存在的可能性。當某分離物出現(xiàn)4個軟件的檢測結(jié)果都是P<1.0×10-6時,則該分離物有可能的重組,否則沒有重組或不存在潛在重組[20]。使用軟件時采用系統(tǒng)默認值,設(shè)定置信值(P-value)為0.01。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

采用MEGA 5.0中的Clustral W[21]軟件進行序列比對,利用最大似然法(maximum likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,重復(fù)1 000次。在 ML 法分析中,數(shù)據(jù)最適的核苷酸替代模型用 jModelTest 0.1.1 軟件[22]計算,結(jié)果顯示TRG+I+G為最適的核苷酸替代模型;在 ML分析中采用自舉法,進行1 000倍模擬復(fù)制計算支長。

1.2.4 遺傳差異以及基因交流

種群之間的遺傳差異由 DnaSP 5.0[23]軟件計算,統(tǒng)計Ks,Z和Snn三個參數(shù)衡量[24-25]。如果Ks和Z統(tǒng)計值很小,P<0.05,則認為存在遺傳差異?；蚪涣饔肍st和Nm值來衡量,Fst的絕對值小于0.33,說明兩個種群之間存在基因交流,反之,交流不頻繁[26-27]。若Nm<1,則說明在種群間很容易發(fā)生基因漂變,是群體發(fā)生遺傳差異的主要原因;若Nm>1則說明種群間存在可以發(fā)生基因交流的渠道或者地緣關(guān)系較近。

1.2.5 選擇壓力分析

將分離物按寄主和地理來源分為不同的組,應(yīng)用 MEGA5.0 軟件中Pamilo-Bianchi-Li法分別計算非同義和同義突變之間的比值(dN/dS)[28]。若dN/dS=1則說明該組分離物存在中性選擇;若dN/dS<1則說明該組分離物存在負選擇或凈化;若dN/dS>1 則說明該組分離物存在正向選擇或多樣化選擇。

1.2.6 突變位點和保守區(qū)域分析

利用DnaSP 5.0軟件,對TMV編碼區(qū)基因序列5 937個位點進行突變位點和保守區(qū)域分析。

1.2.7 種群結(jié)構(gòu)分析

不同種群分離物的核苷酸多樣性與單體型多樣性采用 DnaSP 5.0軟件計算?；赥ajima’s D和Fu & Li’s D和F值進行中性檢驗分析,Tajima’s D和Fu & Li’s D和F均為負值,說明該種群多樣性較低,種群呈擴張趨勢;相反,種群穩(wěn)定選擇,種群數(shù)量正在減少[29-30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組分析

對處理后得到的72個分離物全基因組編碼區(qū)序列進行重組分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離物的P值皆大于1.0×10-6,沒有發(fā)現(xiàn)明顯的重組位點。為了進一步確認這一結(jié)果,運用SimPlot再次檢測依然沒有發(fā)現(xiàn)明顯的重組位點。因此,可以確認在TMV分離物中不存在重組體或者不明顯。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

對已報道的72個TMV全基因組編碼區(qū)序列進行分析,如圖1所示,TMV不同分離物形成3個種群,分別為ChinaⅠ、 China Ⅱ和 Europe, ChinaⅠ聚集了除云南外中國各地區(qū)分離物,China Ⅱ以云南分離物為主體,Europe除了少部分中國分離物以外,絕大部分來源于西班牙和美國,不同組間的分離物地理特征明顯。

2.3 遺傳差異以及基因交流

利用Ks、Z和Snn三個統(tǒng)計量對TMV全基因組編碼區(qū)序列的歐洲和中國(China Ⅰ、China Ⅱ)不同種群間的遺傳變異進行了分析,結(jié)果表明Ks和Z統(tǒng)計值很小,P<0.001(表1),TMV在不同群組間的遺傳變異明顯,同時中國不同地區(qū)間形成的種群遺傳差異也十分明顯。在基因流動分析中,TMV不同組間和中國不同地區(qū)種群間的Fst<0.33,表明TMV在不同種群間基因交流的頻率較高。TMV Europe和China Ⅰ種群Nm<1,表明種群可能受到遺傳漂變的影響,Europe和China Ⅱ,China Ⅰ和China Ⅱ之間的Nm>1,表明種群間存在可以發(fā)生基因交流的渠道。

表1TMV的基因流動和遺傳差異1)

Table1GeneflowandgeneticdifferentiationofTMV

譜系及序列數(shù)Lineageandnumberofsequences參數(shù) ParameterKs(P?valve)Z(P?valve)Snn(P?valve)FstNmEurope(n=18)vs．ChinaⅠ(n=35)4．09543(0．0000???)370．34408(0．0000???)0．97917(0．0000???)0．241850．78Europe(n=18)vs．ChinaⅡ(n=19)4．11881(0．0000???)272．17317(0．0000???)0．94054(0．0000???)0．165362．52ChinaⅠ(n=35)vs．ChinaⅡ(n=19)4．38052(0．0000???)711．91951(0．0000???)0．93220(0．0000???)0．129043．39

1)*, 0.01

2.4 選擇壓力分析

TMV所有分離物的dN/dS的比率均遠小于1(表2),突變?yōu)榉峭x突變,這表明TMV不同種群都處于較強的負選擇壓力下,受到自然界的純化選擇作用。

表2TMV選擇壓力分析1)

Table2SelectionpressureanalysisofTMV

譜系Lineage序列數(shù)Numberofsequences核苷酸多樣性 NucleotidediversitydNdSdN/dSEurope180．02038±0．001040．12667±0．005750．16089ChinaⅠ350．00369±0．000380．03845±0．002580．09597ChinaⅡ190．00397±0．000510．04066±0．002710．09763All720．00902±0．000510．07273±0．002730．12402

1) 表中數(shù)據(jù)為dN±標準差、dS±標準差。下同。 Data in the table aredN±SD,dS±SD. The same below.

圖1 基于TMV全基因組編碼區(qū)序列采用最大似然法(ML)構(gòu)建樹Fig.1 Maximum likelihood tree calculated based on the complete genomic coding sequences of TMV

2.5 種群結(jié)構(gòu)分析

在TMV分離物種群間的核苷酸序列差異介于0.013 45±0.000 74和 0.043 49±0.001 35之間,歐洲分離物核苷酸序列多樣性值比中國的差異大,單體型差異介于0.980±0.028和0.997±0.008之間,ChinaⅠ種群單體型差異更大(表3)。

表3TMV的核苷酸和單體型差異比較

Table3ComparisonofthenucleotideandhaplotypediversitiesofTMV

譜系Lineage序列數(shù)Thenumberofsequences差異值 Differences核苷酸多樣性Nucleotidediversity單體型多樣性HaplotypediversityEurope180．04349±0．001350．980±0．028ChinaⅠ350．01345±0．000740．997±0．008ChinaⅡ190．01457±0．000750．994±0．019All720．02560±0．000890．998±0．003

2.6 突變位點和保守區(qū)域分析

突變位點分析發(fā)現(xiàn)有可變位點1 423個,單突變位點604個,其中兩個變異型569個,三個變異型35個,簡約信息位點819個,其中兩個變異型643個,三個變異型168個,四個變異型8個。

保守區(qū)域分析發(fā)現(xiàn) TMV整個編碼區(qū)的保守性(Sequence conservation)高達0.76,基因編碼的氨基酸保守值(conservation threshold)高于0.85的保守區(qū)域共有6個(conserved regions)(表4)。由此可見,TMV基因編碼區(qū)突變率很低,比較保守。

表4TMV基因編碼區(qū)的保守區(qū)域

Table4ConservedregionsofthecodingsequencesofTMV

保守區(qū)域ConservedRegion位置Location保守性Sequenceconservation一致性ConsistencyP值P?value1814～9260．8760．9880．001522068～21890．8690．9890．002033569～36380．8710．9910．015743583～36520．8860．9940．006654609～47400．8790．9940．000464744～48540．8740．9930．0020

2.7 中性檢測分析

TMV不同組間的中性檢測統(tǒng)計值均為負值,說明TMV種群多態(tài)性較低,處于擴張趨勢(表5)?？傮w而言,在獨特的地理分組中進行3個中性平衡模型偏差分析,連同其高單體型多樣性及低核苷酸多樣性,揭示了TMV種群在擴張。

表5TMV的中性檢測

Table5NeutralitytestsofTMV

譜系Lineage序列數(shù)NumberofsequencesTajima’sDFu&Li’sDFu&Li’sFEurope18-1．95277-2．22788-2．46792ChinaⅠ35-1．92283-1．59870-2．03697ChinaⅡ19-1．23199-1．16993-1．39933All72-2．40321-4．59602-4．42311

3 結(jié)論與討論

關(guān)于TMV基因組的研究多集中在TMV分離物復(fù)制酶、MP、CP 序列結(jié)構(gòu)或比較分析方面,而對TMV分子變異進化報道很少。對TMV全基因組編碼區(qū)序列進行了重組、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳變異、基因交流和種群結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明TMV分離物沒有明顯的重組體,所有的分離物可以分為ChinaⅠ、China Ⅱ和Europe 3個種群,種群間具有比較明顯的地理相關(guān)性。在不同群組間的遺傳變異明顯,基因交流的頻率較高,Europe和ChinaⅠ種群可能受到遺傳漂變影響,Europe和China Ⅱ、ChinaⅠ和China Ⅱ之間存在可以發(fā)生基因交流的渠道。TMV歐洲分離物核苷酸序列多樣性值比中國的差異大,ChinaⅠ種群單體型差異較大,地緣關(guān)系較近的不同種群都處于較強的負選擇壓力下,并處于擴張趨勢中,負選擇和突變是潛在的驅(qū)動TMV分子進化的動力,自然選擇是TMV進化過程中的有效推動力。

在植物 RNA 病毒中,重組是遺傳多樣性的重要來源,也是促進進化的主要動力之一[31],如馬鈴薯 Y 病毒科Potyviridae中重組發(fā)生特別頻繁,對塑造PVY種群遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生很重要的影響[32]。重組不僅能幫助病毒適應(yīng)新寄主或擴大寄主范圍,也可使病毒的致病力發(fā)生改變從而更加適應(yīng)當?shù)氐沫h(huán)境。但在不同 RNA 病毒間重組率差異很大,對 TMV全基因組的編碼區(qū)進行重組分析中,并沒有發(fā)現(xiàn)重組現(xiàn)象。盡管由于分離物數(shù)量以及來源地比較單一等方面的限制,可能導(dǎo)致某些重組體未被發(fā)現(xiàn),但是相對于 PVY重組在驅(qū)動TMV進化方面,不能起到與其類似的作用[33]。中國TMV的發(fā)生率一直相對比較穩(wěn)定,可能與TMV不存在重組株系有一定的關(guān)系。

系統(tǒng)發(fā)育分析中,TMV分離物形成3個相對獨立的種群,種群間具有一定的地理特異性。ChinaⅠ聚集了除云南外中國各地區(qū)分離物,China Ⅱ以云南、貴州、四川分離物為主體,TMV 中國分離物在不同省份間形成兩個獨立的分支,遺傳變異明顯,可能不同種群獨立進化。Europe種群絕大部分來源于西班牙和美國,但也有個別中國分離物,表明TMV種群在中國與歐洲之間交流較頻繁。TMV 3個種群起源于何處?又是怎樣傳播的?什么因素導(dǎo)致云南分離物與中國其他地區(qū)分離物種群間有明顯遺傳差異?推測中國種群起源有可能與煙草傳入中國有關(guān),中國種群由美洲(美國)遷入歐洲(西班牙),再由歐洲進入中國,在中國又分為南北兩條途徑,可能由于地理阻隔等原因?qū)е赂髯元毩⑦M化,形成了云南和其他地區(qū)種群,因不同地區(qū)間煙草種苗交流傳播,使得兩個種群間既有遺傳差異,也有基因相互交流。對于這個推測,尚需要進一步的試驗驗證。

病毒在寄主體內(nèi)是以“突變云”或者“準種”形式存在,突變是驅(qū)動 TMV 進化的主要作用力之一。利用dN/dS的值,計算選擇壓力,大部分植物病毒處于強的負選擇壓力下。TMVdN/dS遠小于 1,表明 TMV 進化受到強的負選擇壓力的驅(qū)動,自然選擇是其進化的主要驅(qū)動力。變異分析發(fā)現(xiàn)TMV 的種群遺傳結(jié)構(gòu)相對比較穩(wěn)定,基因組序列變異較少,比較保守,這與宋麗云[34]的研究結(jié)果一致;而謝揚軍[35]解釋各分離物之間的差異,是由于TMV 主要以點突變的方式來適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境帶來的選擇壓力而造成的。

大量的研究表明,培育抗病毒品種是植物病毒病害防治經(jīng)濟有效的方法之一。但植物病毒一般具有廣泛的寄主和較強的地域適應(yīng)性,在與寄主植物互作過程中,易發(fā)生株系分化和變異,造成抗病品種抗性的減弱和喪失,使抗病毒育種工作難度加大。要減輕或者消除TMV對煙草等作物生長所帶來的不利影響,培育抗病毒品種,必須弄清病毒的遺傳變異機制,開展種群遺傳研究,追蹤病毒的起源、進化以及流行途徑,才能為抗病毒病育種提供指導(dǎo)。深入分析TMV的重組、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳變異、種群結(jié)構(gòu)等分子進化機制,結(jié)果表明TMV種群間不存在重組現(xiàn)象,種群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定,基因組序列變異少,因此培育抗病毒品種可能是防治TMV持久有效的方法之一。本研究開展的TMV 全基因組編碼區(qū)序列分子進化分析,深入揭示TMV分子變異進化特征,對TMV的抗病育種和病害防治具有重要意義。

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(責任編輯： 田 喆)

Completegenomiccodingsequence-basedmolecularevolutionaryanalysisofTobaccomosaicvirus

Liu Tianbo1,4, Zhou Zhicheng1, Peng Shuguang2, Zeng Wei’ai3, Tang Qianjun4

(1.TobaccoResearchInstituteofHunanProvince,Changsha410004,China; 2.TobaccoCompanyofHunan,Changsha410004,China; 3.TobaccoCompanyofChangsha,Hunan410010,China;4.CollegeofPlantProtection,HunanAgriculturalUniversity,Hunan410128,China)

To reveal the molecular evolution ofTobaccomosaicvirus(TMV), the complete genomic coding sequences of TMV from GenBank were subjected to molecular evolutionary analysis, including recombination, phylogeny, genetic variation, population structure, gene flow, etc. The results indicated that mutation and negative selection were the main driving forces for TMV evolution, rather than recombination. The TMV populations had stable structure, but were expanding, and the gene mutation was low. Three geographically correlative species of TMV named ChinaⅠ, China Ⅱand Europe were found. The Europe isolates exhibited greater nucleotide diversity than the China ones; Europe and ChinaⅠpopulations could be influenced by genetic drift, and there were gene exchange channels between Europe and China Ⅱ and between ChinaⅠand China Ⅱ.

Tobaccomosaicvirus; complete genomic coding sequence; phylogenetics; molecular evolution

S 435.72

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.013

2016-12-19

： 2017-01-23

中國煙草總公司湖南省公司科技項目專項(14-16ZDAa02);中國煙草總公司科技重點項目(110201502016)

* 通信作者 E-mail:78405158@qq.com