張麗勍, 段 可, 鄒小花, 何成勇, 高清華

(上海市農業(yè)科學院林木果樹研究所, 上海 201403)

草莓膠孢炭疽菌CFEM候選效應子的生物信息學鑒定及其侵染過程中的轉錄分析

張麗勍, 段 可, 鄒小花, 何成勇, 高清華*

(上海市農業(yè)科學院林木果樹研究所, 上海 201403)

病原真菌通常分泌效應子到寄主組織中調控寄主的生理過程,從而有利于其侵染。CFEM(common in several fungal extracellular membrane)蛋白是真菌所獨有的,且與致病性密切相關。本研究利用Pfam數(shù)據(jù)庫對草莓膠孢炭疽菌全基因組進行搜索,鑒定獲得22個CFEM蛋白。對CFEM蛋白的信號肽、跨膜結構域和亞細胞定位進行分析,結果表明僅有8個CFEM蛋白為分泌蛋白。對CFEM分泌蛋白在不同侵染階段的轉錄情況進行轉錄組學及RT-PCR分析,結果顯示8個CFEM蛋白在侵染后不同時期均有表達。其中,1個CFEM分泌蛋白于附著胞形成期特異表達,2個于活體寄生階段特異表達,2個于死體寄生階段特異表達。綜合上述分析結果,預測這8個分泌蛋白可能為草莓膠孢炭疽菌的效應子。本研究為深入解析植物病原真菌CFEM效應子提供了理論依據(jù)。

膠孢炭疽菌; 效應子; CFEM蛋白

由炭疽菌屬Colletotrichum真菌引起的草莓炭疽病是草莓上的一種重要病害。草莓炭疽病危害嚴重年份草莓死苗率達80%,草莓減產達50%以上[1]。膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides是草莓炭疽病的主要病原之一,為半活體營養(yǎng)型真菌。

在植物病原真菌與寄主植物共進化的過程中,病原真菌的致病性與寄主的抗性之間一直發(fā)生著相互作用[2]。病原真菌通過分泌一系列的效應子來調控寄主植物的抗性[3]。效應子是一類分泌蛋白,必須被分泌并轉運到寄主細胞的特定部位才能發(fā)揮其功能。真菌的效應子具有以下特點: 序列特異性高,不同物種間序列相似性小;氨基酸序列短,一般不超過300 個氨基酸殘基;含有信號肽,同時不含跨膜區(qū); 富含半胱氨酸[4]。效應子依據(jù)其功能不同可以分為兩類,一類效應子通過抑制植物的抗性來促進病原真菌的侵染(稱為效應子誘發(fā)的感病性);另一類效應子則能夠間接或直接地被寄主植物識別,導致效應子觸發(fā)的免疫。2006年,一篇關于卵菌(oomycete)全基因組的文獻中提出了一個概念,即真菌類生物或真菌本身可能有成百上千種效應子。自此開始,大量的真菌全基因組數(shù)據(jù)被發(fā)掘,各種不同的生物信息學手段被用于精確的分析和定義效應子[5]。

2013年,膠孢炭疽菌的全基因組測序工作完成。Gan等[6]對膠孢炭疽菌基因組的分泌蛋白進行了生物信息學分析,預測其含有2 042個分泌蛋白,其中755個為少于300個氨基酸的小分泌蛋白(small secretory proteins,SSP)。汪倩等[7]利用生物信息學手段發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌基因組中存在稻瘟菌效應子BASP2的同源蛋白CgBASP2。對該蛋白編碼基因進行功能研究發(fā)現(xiàn),與野生型相比CgBASP2基因缺失突變株不能對寄主產生致病性,說明其在致病過程中發(fā)揮著重要的作用。何芬[8]對利用生物信息學篩選到的膠孢炭疽菌LysMs (Lysin Motifs)型候選效應子CgLysM,進行了亞細胞定位,發(fā)現(xiàn)CgLysM在分生孢子萌發(fā)過程中有向芽管頂端(或附著胞)富集的傾向。這些報道表明,高通量測序和生物信息學手段結合功能學試驗能夠有效預測并鑒定出真菌效應子。隨著高通量測序技術的革新、生物信息學的快速發(fā)展以及膠孢炭疽菌全基因組信息的公布,膠孢炭疽菌-草莓的互作研究工作將被極大地推動。

CFEM(common in several fungal extracellular membrane)是真菌獨有的一種蛋白結構域,含有8個半胱氨酸[9]。CFEM蛋白結構域最初是在稻瘟病菌Magnaporthegrisea中發(fā)現(xiàn)的,含有該結構域的ACI1蛋白在稻瘟病菌致病過程中起著至關重要的作用。此外,在白假絲酵母Candidaalbicans中發(fā)現(xiàn)的含CFEM結構域的CSA1和稻瘟病菌中的Pth11蛋白均與致病性相關[10]。目前在膠孢炭疽菌中尚未見CFEM效應子的相關報道。本研究利用NCBI網站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的膠孢炭疽菌基因組數(shù)據(jù)和注釋信息,從全基因組水平上鑒定膠孢炭疽菌中含有CFEM蛋白結構域的成員,采用生物信息學手段進行分析,并結合轉錄組學數(shù)據(jù)及RT-PCR分析結果,預測膠孢炭疽菌CFEM的候選效應子,為進一步研究CFEM效應子的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

膠孢炭疽菌C.gloeosporioides的全基因組蛋白質數(shù)據(jù)來自NCBI網站。試驗所用草莓為栽培草莓品種‘久香’,取自上海市農業(yè)科學院林木果樹研究所草莓種質資源圃。

1.2 方法

1.2.1 CFEM 蛋白的生物信息學分析

利用蛋白質家族數(shù)據(jù)庫Pfam (http:∥pfam.xfam.org/family/)對膠孢炭疽菌基因組編碼的CFEM蛋白進行分析,E-value 設為0.001。

通過SignalP 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測各CFEM蛋白的N端信號肽;通過TMHMM Server v. 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測各CFEM蛋白的跨膜結構域;通過TargetP 1.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預測各CFEM蛋白的亞細胞定位。

1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

通過ClustalX 軟件對炭疽屬真菌蛋白CFEM氨基酸序列進行多重序列比對,利用MEGA 6.0中的鄰近法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,bootstrap值設置為1 000。

1.2.3 CFEM蛋白在膠孢炭疽菌侵染草莓葉片不同階段中的轉錄組學分析

取生長健壯、長勢一致的草莓植株于人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)。試驗設置處理組和對照組,每組5株草莓植株,設3次重復。處理組采用孢子濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液噴霧法接種草莓葉片,對照組采用純培養(yǎng)膠孢炭疽菌。將對照組及接種后三個階段:附著胞形成階段(inplantaappressoria)、活體營養(yǎng)階段(biotrophic phase)及死體營養(yǎng)階段(necrotrophic phase)的葉片分別取樣[9],提取RNA。RNA提取方法參見OMEGA Plant RNA Kit試劑盒使用說明。提取的RNA樣本經瓊脂糖凝膠電泳及 Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度計檢測。檢測合格的 RNA 樣品送上海瀚宇生物技術有限公司進行轉錄組測序。

1.2.4 基因編碼CFEM蛋白的轉錄分析

對這三個階段受侵染的草莓葉片和陰性對照(接種等量無菌水的草莓葉片)分別提取RNA,反轉錄為cDNA。反轉錄參見PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒使用說明。擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RT-PCR方法擴增得到侵染時期三個不同階段的編碼CFEM蛋白基因。CFEM蛋白基因克隆片段均構建至pMD18-T(購自寶生物工程有限公司)并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結果與CFEM蛋白基因序列完全一致。

2 結果與分析

2.1 草莓膠孢炭疽菌CFEM 蛋白的鑒定

Pfam數(shù)據(jù)庫是一個包含了大量多重序列校準,以及“隱藏式馬爾科夫模型”的巨大集合,涵蓋了許多蛋白質家族。草莓膠孢炭疽菌基因組基因共編碼15 381個蛋白,利用蛋白質家族數(shù)據(jù)庫Pfam (http:∥pfam.xfam.org/)對膠孢炭疽菌基因組編碼的CFEM蛋白進行分析,共獲得22個CFEM蛋白(表1)。

表1草莓膠孢炭疽菌CFEM蛋白

Table1TheinformationofCFEMproteinsinColletotrichumgloeosporioidesonstrawberry

2.2 草莓膠孢炭疽菌CFEM 蛋白信號肽分析

效應子由真菌分泌到胞外后,由信號肽引導其進行跨膜轉運。因此,本文首先對膠孢炭疽菌中所有的CFEM 蛋白信號肽預測,初步確定草莓膠孢炭疽菌CFEM分泌蛋白的組成。由SignalP 4.1 Server在線軟件對CFEM蛋白進行信號肽預測分析的結果顯示,22個CFEM蛋白中有21個CFEM蛋白N端氨基酸序列具有信號肽,其信號肽序列為N 端16～25個氨基酸(表2)。一些內在膜蛋白、膜結合蛋白和各種胞內的細胞器蛋白同樣含有信號肽,但不是效應子。因此,需進一步對CFEM蛋白進行亞細胞定位分析,以排除上述蛋白。

表2草莓膠孢炭疽菌各CFEM蛋白信號肽分析1)

Table2BioinformaticanalysisofsignalpeptidesofCFEMproteinsinColletotrichumgloeosporioides

蛋白序列號ProteinID信號肽Signalpeptide信號肽切割位點Cleavagesite蛋白序列號ProteinID信號肽Signalpeptide信號肽切割位點CleavagesiteCGGC5＿2461．1 +21/22CGGC5＿1173．1-CGGC5＿13949．1+19/20CGGC5＿10073．1+20/21CGGC5＿1956．1 +17/18CGGC5＿9409．1+24/25CGGC5＿13478．1+18/19CGGC5＿5966．1+22/23CGGC5＿13200．1+16/17CGGC5＿5833．1+16/17CGGC5＿11628．1+19/20CGGC5＿621．1 +26/27CGGC5＿1525．1 +19/20CGGC5＿7948．1+20/21CGGC5＿11293．1+22/23CGGC5＿908．1 +19/20CGGC5＿11153．1+20/21CGGC5＿9429．1+21/22CGGC5＿11062．1+16/17CGGC5＿1574．1+19/20CGGC5＿10469．1+20/21CGGC5＿15026．1+21/22

1) “+” 表示該蛋白具有信號肽;“-”表示該蛋白不具有信號肽。 “+” indicates the protein with signal peptide sequences; “-” indicates the protein without signal peptide sequences.

2.3 草莓膠孢炭疽菌CFEM蛋白亞細胞定位分析

本文利用TargetP軟件對21個具有信號肽的CFEM蛋白進行亞細胞定位分析。分析結果表明,21個CFEM蛋白通過分泌途徑分泌至胞外的得分值≥0.677。其中,除CGGC5_11628.1、CGGC5_11293.1和CGGC5_15026.1定位可信度略低(RC=3)外,其余18個CFEM蛋白的定位預測可信度皆較高(RC≤2)。因此,21個具有信號肽的CFEM均為分泌蛋白,可通過草莓膠孢炭疽菌分泌途徑分泌至胞外(表3)。

表314個具信號肽的CFEM蛋白的亞細胞定位分析1)

Table3SubcellularlocalizationpredictionofCFEMproteinsinColletotrichumgloeosporioides

蛋白序列號ProteinID細胞器定位得分值SubcellularlocalizationpredictionvaluemTPSPOtherLocRC蛋白序列號ProteinID細胞器定位得分值SubcellularlocalizationpredictionvaluemTPSPOtherLocRCCGGC5＿2461．10．0510．9670．026S1CGGC5＿10073．10．0450．9170．057S1CGGC5＿13949．10．0950．9180．027S1CGGC5＿9409．10．0780．9200．022S1CGGC5＿1956．10．0230．9650．080S1CGGC5＿5966．10．0330．9560．029S1CGGC5＿13478．10．0210．9470．130S1CGGC5＿5833．10．0650．8830．087S2CGGC5＿13200．10．0250．9520．070S1CGGC5＿621．10．0600．9640．014S1CGGC5＿11628．10．2540．8400．017S3CGGC5＿7948．10．1120．8950．062S2CGGC5＿1525．10．0220．9890．017S1CGGC5＿908．10．0400．9650．022S1CGGC5＿11293．10．1550．6770．119S3CGGC5＿9429．10．0710．9390．021S1CGGC5＿11153．10．0330．8670．095S2CGGC5＿1574．10．0160．9700．058S1CGGC5＿11062．10．0480．8470．155S2CGGC5＿15026．10．2440．8050．011S3CGGC5＿10469．10．0320．8460．091S2

1) mTP:線粒體定位;S:分泌途徑;SP:該蛋白含有信號肽,可通過分泌途徑分泌至胞外,為分泌蛋白;Other:其他定位;Loc:預測定位結果。RC:可信度等級從1～5,估算亞細胞定位預測最大值和次值之間的差距(diff)。1:diff≥0.800;2:0.800>diff≥0.600;3:0.600>diff≥0.400;4:0.400>diff≥0.200;5:diff<0.200。RC值越低,定位越準確,RC=1定位預測最可靠。 mTP: Mitochondrion localization; S: Secretion pathway; SP: Signal peptide; Other: Any other localization; Loc: Prediction of localization.RC: Reliability class, from 1 to 5, where 1 indicates the strongest prediction.RCis a measure of the size of the difference (diff) between the highest (winning) and the second highest output scores. There are 5 reliability classes, defined as follows: 1:diff≥0.800; 2: 0.800>diff≥0.600; 3: 0.600>diff≥0.400; 4: 0.400>diff≥0.200; 5:diff<0.200. Thus, the lower the value ofRC, the safer the prediction.

2.4 草莓膠孢炭疽菌CFEM分泌蛋白跨膜結構域分析

由于分泌蛋白和跨膜蛋白均含有疏水區(qū)域,因此很難將兩者區(qū)分開來。因此,為了避免跨膜蛋白和分泌蛋白相混淆,選用TMHMM軟件對21個含信號肽的CFEM蛋白進行跨膜結構域的預測,剔除跨膜結構域>1的蛋白。結果表明21個含信號肽的CFEM蛋白中有13個CEFM蛋白均含有跨膜結構域,說明其為跨膜蛋白。而其余8個CEFM蛋白不含有跨膜結構域,說明它們屬于CFEM分泌蛋白(表4)。

表4草莓膠孢炭疽菌CFEM蛋白跨膜結構域分析

Table4BioinformaticanalysisoftransmembraneofCFEMproteinsinColletotrichumgloeosporioides

蛋白序列號ProteinID跨膜結構域數(shù)目NumberofpredictedTMHs跨膜結構域位置PositionoftransmembranedomainTM1TM2TM3TM4TM5TM6TM7TM8CGGC5＿2461．16113～132152～174187～209219～241262～284299～321CGGC5＿13949．187～29 104～126139～161181～203215～237265～287300～322342～364CGGC5＿1956．10CGGC5＿13478．10CGGC5＿13200．10CGGC5＿11628．17103～120135～157177～199209～231252～274294～316329～351CGGC5＿1525．17100～122135～157179～201214～236260～282295～317337～359CGGC5＿11293．10CGGC5＿11153．10CGGC5＿11062．10CGGC5＿10469．10CGGC5＿10073．12101～123187～206

續(xù)表4Table4(Continued)

蛋白序列號ProteinID跨膜結構域數(shù)目NumberofpredictedTMHs跨膜結構域位置PositionoftransmembranedomainTM1TM2TM3TM4TM5TM6TM7TM8CGGC5＿9409．187～24110～128141～163183～205218～240265～287300～322342～364CGGC5＿5966．175～22102～119139～156171～193219～241256～278290～312CGGC5＿5833．10CGGC5＿621．16149～171191～213233～255270～292305～327342～364CGGC5＿7948．17108～130143～162186～208220～242266～288301～323343～365CGGC5＿908．182～2195～117130～152172～194214～236256～275288～310325～347CGGC5＿9429．1599～118131～153173～195208～230290～308CGGC5＿1574．1793～115128～147172～194207～229253～275288～306321～343CGGC5＿15026．174～2134～5379～101114～136159～181193～215235～257

2.5 炭疽菌屬CFEM蛋白系統(tǒng)進化分析

MEGA建樹結果表明,盡管以8個CFEM為靶標蛋白繪制的進化樹總體來說有較高的相似性,但各自之間仍存在差異。進化樹大體上分為2個大分支,其中分支一由C.simmondsii、C.fioriniae、C.nymphaeae、C.salicis和本研究中的C.gloeosporioides組成,分支二由C.tofieldiae、C.incanum、C.higginsianum、C.sublineola和C.graminicola組成。有趣的是,在分支一中,C.simmondsii、C.fioriniae、C.nymphaeae和C.salicis同源性較高,被劃分到一個小分支;而本研究中的C.gloeosporioides則與上述4種炭疽菌同源性相對較低,被獨立分到另一小分支。

圖1 CFEM蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree of CFEM proteins

2.6 CFEM基因在膠孢炭疽菌侵染草莓葉片不同階段中的轉錄組學分析

效應子由病原真菌在侵染過程中泌出,因此,在侵染階段表達的分泌蛋白更有可能與病菌的致病性密切相關,為此,本研究以純培養(yǎng)和在植物組織內侵染的3個不同階段的膠孢炭疽菌為研究對象,利用轉錄組學技術進行分析,比較8個CFEM分泌蛋白編碼基因在不同環(huán)境下的差異表達。圖2為轉錄組測序各樣本總RNA 的提取質量檢測:28S rRNA和18S rRNA條帶較清晰,滿足測序需要。轉錄組測序結果表明,8個CFEM蛋白編碼基因中,CGGC5_13478.1和CGGC5_11153.1在侵染后3個階段均上調表達,其中CGGC5_13478.1在侵染后3個時間點上調均大于80倍。CGGC5_13200.1在附著胞形成階段表達顯著上調,在活體營養(yǎng)階段和死體營養(yǎng)階段表達量則有一定程度下調。相較之下,CGGC5_11293.1和CGGC5_10469.1在活體和死體營養(yǎng)階段均有表達。在活體營養(yǎng)階段特異性上調表達的基因有CGGC5_11602.1和CGGC5_5833.1,其中CGGC5_5833.1上調倍數(shù)達90倍。而僅有一個CFEM蛋白編碼基因,CGGC5_1956.1,在死體營養(yǎng)階段上調表達,與對照組相比上調約34倍(圖3)。這些結果說明,盡管8個CFEM蛋白編碼基因在膠孢炭疽菌侵染均有上調表達,但表達的時間點和程度有較大差異,說明這些CFEM分泌蛋白在膠孢炭疽菌侵染過程中發(fā)揮不同的作用。

圖2 轉錄組測序RNA樣本瓊脂糖凝膠檢測Fig.2 Agarose gel electrophoresis of total RNA

圖3 CFEM分泌蛋白編碼基因差異表達熱圖Fig.3 Heat map showing expression levels of CFEM protein-coding genes

2.7 草莓膠孢炭疽菌CFEM分泌蛋白的RT-PCR分析

采用RT-PCR方法對8個CFEM分泌蛋白在膠孢炭疽菌在不同侵染階段的表達情況進行進一步驗證,結果顯示,8個CFEM分泌蛋白在侵染的3個不同階段均有表達(表5)。其中,CGGC5_13200.1在附著胞形成階段特異表達;CGGC5_11602.1和CGGC5_5833.1在活體營養(yǎng)階段特異表達,在此階段,膠孢炭疽菌在寄主體內形成初級菌絲;CGGC5_1956.1在死體營養(yǎng)階段特異表達,此階段,次級侵染菌絲形成并誘導寄主細胞死亡。CGGC5_13478.1和CGGC5_11153.1在3個階段均有表達。CGGC5_11293.1和CGGC5_10469.1在活體和死體營養(yǎng)階段均有表達,與轉錄組測序結果一致。因此,8個CFEM分泌蛋白皆可在膠孢炭疽菌侵染階段表達,預測其均為膠孢炭疽菌CFEM效應子。

表5CFEM分泌蛋白的轉錄分析1)

Table5TranscriptionalanalysisofColletotrichumgloeosporioidessecretoryproteins

蛋白序列號ProteinID3個侵染階段Allthreephases附著胞形成階段Inplantaappressoriumphase活體營養(yǎng)階段Biotrophicphase死體營養(yǎng)階段Necrotrophicphase陰性對照NegativecontrolCGGC5＿1956．1+CGGC5＿13478．1+CGGC5＿13200．1+CGGC5＿11293．1++CGGC5＿11153．1+CGGC5＿11062．1+CGGC5＿10469．1++CGGC5＿5833．1+

1) “+” 表示CFEM候選效應子在該階段表達。 “+” indicates that this CFEM candidate effector is expressed in this phase.

3 討論

目前有關半活體營養(yǎng)型真菌如何應對寄主植物的免疫反應及其如何調控活的寄主植物細胞的機制尚不明確[13]。然而近年來的研究發(fā)現(xiàn),與植物和動物致病細菌一樣,植物病原真菌也能夠產生和分泌效應子。這些效應子能夠與寄主植物互作且在病原真菌致病的過程中起著至關重要的作用[14-15]。

自從在粗球孢子菌Coccidioidesimmitis中首次發(fā)現(xiàn)CFEM蛋白以來,一些新的CFEM蛋白也從不同的真菌中鑒定出來。這些含有CFEM蛋白的真菌分別為稻瘟病菌Magnaporthegrisea、白假絲酵母C.albicans、近平滑假絲酵母C.parapsilosis、煙曲霉Aspergillusfumigatus和尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum[9,17-19]。對CFEM蛋白的功能研究發(fā)現(xiàn),這類蛋白在真菌的某些生理過程中起作用,可能與致病性相關。Ling等[20]將尖孢鐮刀菌F.oxysporum中12個不同的?；瓦M行了分析,發(fā)現(xiàn)每個?；推骄?6個CFEM蛋白,其中某些CFEM蛋白含有DR基序。包含DR基序的CFEM蛋白(CFEM_DR蛋白)在尖孢鐮刀菌菌株間非常保守,相比其他真菌,CFEM_DR蛋白的數(shù)量在尖孢鐮刀菌中更多。對CMEF_DR蛋白的表達分析發(fā)現(xiàn),編碼CMEF_DR蛋白基因在孢子和菌絲階段表達量明顯高于其他階段,且在接種寄主3 d后,表達量顯著升高。由此說明CMEF_DR蛋白在定殖和侵染寄主過程中發(fā)揮著重要的作用。井忠英等[9]對禾谷炭疽菌C.graminicola中的CFEM蛋白進行了生物信息及轉錄分析。結果表明,禾谷炭疽菌含有32個CFEM蛋白,且其中22個為分泌蛋白。這22個分泌蛋白在病菌侵染時期的3個階段均有表達。預測這22個CFEM分泌蛋白為禾谷炭疽菌致病相關的效應子。

高通量測序技術的快速發(fā)展及全基因組測序真菌數(shù)量的大幅增加,為在病原真菌中鑒定效應子提供了有力的保障。有關草莓膠孢炭疽菌效應子的報道十分有限[21],其尚無CFEM效應子的相關研究。由于缺乏一致的序列特征或結構折疊,真菌的效應子預測是一個難題。

本文利用Pfam數(shù)據(jù)庫,對膠孢炭疽菌的基因組進行分析,獲得22個含有CFEM結構域的蛋白。效應子通常經內質網或高爾基體分泌,由此需要疏水的N末端信號肽[22]。迄今為止,經研究證實的真菌效應子均含有該信號肽[23]。本文采用SignalP、TargetP及TMHMM軟件對22個CFEM蛋白進行了分析,綜合結果分析預測,8個CFEM蛋白為膠孢炭疽菌的分泌蛋白。對其利用MEGA進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建,結果表明,膠孢炭疽菌CFEM蛋白不屬于分支二,在分支一中又單獨成一支,與已報道的禾谷炭疽菌中的CFEM分泌蛋白親緣關系相對較遠。說明與其他炭疽菌相比,膠孢炭疽菌CFEM蛋白有其自身的特點。由于效應子與病原真菌侵染相關,因此,本文采用轉錄組測序和RT-PCR技術對8個CFEM分泌蛋白在3個不同侵染時期的轉錄表達進行了研究,結果表明,8個CFEM分泌蛋白均在膠孢炭疽菌的侵染階段表達,但表達的階段和程度有較大差異。其中CGGC5_13478.1在侵染后3個時間點上調均大于80倍,說明其可能在膠孢炭疽菌整個侵染過程中都發(fā)揮重要作用。除此之外,CGGC5_5833.1在活體營養(yǎng)階段上調表達高達90倍,說明其可能在活體營養(yǎng)階段發(fā)揮重要作用。除此之外,其他CFEM基因在不同時間點均有上調表達。綜合以上結果預測,8個CFEM分泌蛋白有可能是膠孢炭疽菌的效應子。本實驗室將在后續(xù)試驗中,對這些推測加以求證,明確CFEM蛋白效應子的功能,為抗病育種奠定堅實基礎。

[1] Liu Xie, Zhang Jingze, Wan Yao, et al. Identification ofColletotrichumspp. isolated from strawberry in Zhejiang Province and Shanghai City, China [J]. Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology), 2010, 11(1):61-70.

[2] Hadwiger L A, George N. Agrios, Plant Pathology [M]. 5th ed. Amsterdam: Elsevier Academic Press, 2005.

[3] Stergiopoulos I, Wit P J G M D. Fungal effector proteins [J]. Annual Review of Phytopathology, 2009, 47(1):233-263.

[4] Jones J D G, Dangl J L. The plant immune system [J]. Nature, 2006, 444(7117):323-329.

[5] Kamoun S. A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes [J]. Annual Review of Phytopathology, 2006, 44(1):41-60.

[6] Gan P, Ikeda K, Irieda H, et al. Comparative genomic and transcriptomic analyses reveal the hemibiotrophic stage shift ofColletotrichum, fungi [J]. New Phytologist, 2013, 197(4):1236-1249.

[7] 汪倩, 何朝族, 羅紅麗. 橡膠樹膠孢炭疽病菌CgBASP2基因敲除突變體構建及其致病力分析[J]. 熱帶生物學報, 2015, 6(1): 41-46.

[8] 何芬. 橡膠樹炭疽病菌效應蛋白基因CgLysM的RNAi突變體構建及其蛋白的亞細胞定位[D]. ?？?海南大學, 2014.

[9] Kulkarni R D, Kelkar H S, Dean R A. An eight-cysteine-containing CFEM domain unique to a group of fungal membrane proteins[J]. Trends in Biochemical Sciences, 2003, 28(3):118-121.

[10] Zhang Zhenna, Wu Qinyi, Zhang Guizhi, et al. Systematic analyses reveal uniqueness and origin of the CFEM domain in fungi [J]. Scientific Reports, 2015, 5：13032.

[11] 井忠英, 王國梁, 劉文德. 禾谷炭疽菌CFEM效應子的生物信息學鑒定與轉錄分析[J]. 植物保護, 2016, 42(1): 81-86.

[12] Mendgen K, Hahn M. Plant infection and the establishment of fungal biotrophy[J]. Trends in Plant Science, 2002, 7(8): 352-356.

[13] Horbach R, Navarro-Quesada A R, Knogge W, et al. When and how to kill a plant cell: Infection strategies of plant pathogenic fungi [J]. Journal of Plant Physiology, 2011, 168(1): 51-62.

[14] Koeck M, Hardham A R, Dodds P N. The role of effectors of biotrophic and hemibiotrophic fungi in infection [J]. Cellular Microbiology, 2011, 13(12): 1849-1857.

[15] Dodds P N, Rafiqi M, Gan P H P, et al. Effectors of biotrophic fungi and oomycetes: pathogenicity factors and triggers of host resistance [J]. New Phytologist, 2009, 183(4): 993-1000.

[16] Kamoun S. The secretome of plant-associated fungi and oomycetes [M]∥ Deising H B.Plant relationships. Berlin: Springer, 2009:173-180.

[17] Vleeshouwers V G, Oliver R P. Effectors as tools in disease resistance breeding against biotrophic, hemibiotrophic, and necrotrophic plant pathogens [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI, 2014, 27(3): 196-206.

[18] Weissman Z, Kornitzer D. A family of Candida cell surface haem-binding proteins involved in haemin and haemoglobin-iron utilization[J]. Molecular Microbiology, 2004, 53(4): 1209-1220.

[19] Vaknin Y, Shadkchan Y, Levdansky E, et al. The threeAspergillusfumigatus, CFEM-domain GPI-anchored proteins (CfmA-C) affect cell-wall stability but do not play a role in fungal virulence [J]. Fungal Genetics & Biology, 2014, 63(1): 55-64.

[20] Ling Jian, Zeng Feng, Cao Yuexia, et al. Identification of a class of CFEM proteins containing a new conserved motif inFusariumoxysporum[J]. Physiological & Molecular Plant Pathology, 2015, 89: 41-48.

[21] Stephenson S A, Hatfield J, Rusu A G, et al. CgDN3: An essential pathogenicity gene ofColletotrichumgloeosporioidesnecessary to avert a hypersensitive-like response in the hostStylosanthesguianensis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2000, 13(9):929-941.

[22] Heijne G V. The signal peptide [J]. Journal of Membrane Biology, 1990, 115(3): 195-201.

[23] Presti L L, Lanver D, Schweizer G, et al. Fungal effectors and plant susceptibility[J]. Annual Review of Plant Biology, 2015, 66: 513-545.

(責任編輯： 田 喆)

BioinformaticidentificationandtranscriptionalanalysisofColletotrichumgloeosporioidescandidateCFEMeffectorproteins

Zhang Liqing, Duan Ke, Zou Xiaohua, He Chengyong, Gao Qinghua

(ResearchInstituteofForestryandFruitTrees,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201403,China)

Plant pathogens secrete effector proteins into host tissues to regulate host physiological processes and promote its infection. Common in several fungal extracellular membrane (CFEM) proteins is unique to fungi and plays an important role in pathogenesis. In our study, we obtained 22 CFEM proteins ofColletotrichumgloeosporioidesby searching Pfam database. Then, we conducted a bioinformatics analysis on signal peptide, transmembrane domain and protein subcellular localization of these 22 CFEM proteins. The results showed that only 8 of them were secreted proteins. The transcriptome and RT-PCR analysis of these 8 CFEM proteins at different stages of infection were performed. Among them, one protein was expressed ininplantaappressorium stage, two were expressed in biotrophic stage and one was expressed in necrotrophic stage. Collectively, the 8 CFEM proteins were predicted to be the candidate effectors ofC.gloeosporioides. Our findings provide a theoretical basis for in-depth analysis for the function of CFEM effectors in plant pathogenic fungi.

Colletotrichumgloeosporioides; effector; CFEM protein

S 436.639

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.006

2016-10-08

： 2017-01-05

國家自然科學基金青年基金(31501592);上海市科委自然科學基金項目(14ZR1436800);上海市科委現(xiàn)代農業(yè)領域重點科技項目(16391901400);上海市科委基礎研究重點項目(14JC1405400);上海市瓜果產業(yè)技術體系(滬農科產字(2017)第1號)

* 通信作者 E-mail: qhgao20338@sina.com