齊 曉，閔學(xué)陽，張正社，孫啟忠，劉文獻(xiàn)

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2.全國畜牧總站 全國草品種審定委員會辦公室，北京 100125;3.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

紫花苜蓿響應(yīng)低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及表達(dá)分析

齊 曉1,2，閔學(xué)陽3，張正社3，孫啟忠1，劉文獻(xiàn)3

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2.全國畜牧總站 全國草品種審定委員會辦公室，北京 100125;3.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

研究證明，轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的生長發(fā)育過程并響應(yīng)多種生物/非生物脅迫信號途徑。低溫脅迫可導(dǎo)致紫花苜蓿(Medicaosativa)減產(chǎn)、越冬率降低以及生產(chǎn)年限縮短。利用新一代高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，本研究對4 ℃低溫脅迫下紫花苜蓿中響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行了鑒定，并對其表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序共獲得78 925條Unigene序列和3 448個(gè)差異表達(dá)基因。其中，從3 448個(gè)差異表達(dá)基因中共鑒定出43個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，共251個(gè)基因被顯著地誘導(dǎo)表達(dá)。不同轉(zhuǎn)錄因子家族基因受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)不同。本研究有助于在整體水平加深了解紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究這些響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄因子的功能提供參考。

紫花苜蓿；轉(zhuǎn)錄因子；低溫脅迫；Unigene；轉(zhuǎn)錄組

由于植物的相對固定和難移動(dòng)性，在面對諸多生物和非生物逆境脅迫(干旱、低溫、病蟲害等)時(shí)，無法像動(dòng)物一樣通過移動(dòng)來規(guī)避不利環(huán)境的影響。因此，在長期的演化過程中，植物進(jìn)化出了復(fù)雜多樣的防御體系來應(yīng)對極端環(huán)境的侵害[1-2]。在這些防御體系中，多種轉(zhuǎn)錄因子家族發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用，日益受到人們的關(guān)注[3-5]。

轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠與真核生物基因順式作用原件相互作用從而激活或抑制下游被調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的DNA 結(jié)合蛋白質(zhì)[6]。截至目前，已有至少64個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族得以鑒定和研究[7]。越來越多的研究也證明，轉(zhuǎn)錄因子通過自身以及與其它蛋白質(zhì)互作，進(jìn)一步調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而廣泛參與響應(yīng)植物干旱、高鹽、低溫、激素、病蟲害以及調(diào)控生長發(fā)育等生命過程[8-9]。因此，深入研究和鑒定參與響應(yīng)生物/非生物逆境脅迫轉(zhuǎn)錄因子的功能及其調(diào)控途徑，對提高植物抗逆性以及抗性育種具有重要的指導(dǎo)意義。

紫花苜蓿(Medicaosativa)是全球種植面積最大的豆科牧草，具有廣泛的生態(tài)適應(yīng)性、穩(wěn)定的生產(chǎn)力以及較高的營養(yǎng)價(jià)值，在我國農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)經(jīng)濟(jì)建設(shè)中發(fā)揮著巨大作用[10-11]。但研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫可導(dǎo)致紫花苜蓿減產(chǎn)、越冬率降低以及生產(chǎn)年限縮短，極大地限制了紫花苜蓿在高寒地區(qū)的種植和推廣[12-13]。模式植物研究結(jié)果證明，在深入解析植物響應(yīng)低溫脅迫分子調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)上，利用基因工程技術(shù)以及常規(guī)抗寒品種的選育是提高植物響應(yīng)低溫脅迫的有效途徑[14]。但截至目前，紫花苜蓿響應(yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制仍不清楚，迫切需要對其內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。因此，本研究利用轉(zhuǎn)錄組高通量測序和生物信息學(xué)技術(shù)，對紫花苜蓿中響應(yīng)低溫脅迫的不同轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行系統(tǒng)篩選和分析，以期為揭示紫花苜蓿響應(yīng)低溫逆境脅迫的分子機(jī)理以及苜蓿抗寒品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料和處理?xiàng)l件

試驗(yàn)材料采用美國紫花苜蓿冬季存活能力(winter survival)鑒定標(biāo)準(zhǔn)品種ZG9830(抗寒等級為一級，最抗寒)，種子由美國農(nóng)業(yè)部國家種質(zhì)資源庫(U.S. National Plant Germplasm System)提供。將種子置于營養(yǎng)土(土壤∶草炭∶蛭石=3∶2∶1)中育苗(育苗盆直徑8 cm、深10 cm，育苗30盆，每盆3～5株)，在位于農(nóng)業(yè)部全國草業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心的人工氣候室進(jìn)行(育苗條件為20 ℃恒溫，16 h/8 h，晝/夜)。待幼苗長至3-5葉期(約40 d齡)時(shí)，轉(zhuǎn)至德國RUMED-3401型低溫光照培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫脅迫(4 ℃，16 h/8 h，晝/夜，降溫速率為每分鐘1 ℃)，獲取低溫處理48 h的葉片樣品。以 20 ℃條件下生長的葉片樣品作為對照(CK)。降溫前，幼苗在低溫培養(yǎng)箱中(20 ℃恒溫，16 h/8 h，晝/夜)適應(yīng)48 h。取下的葉片經(jīng)液氮處理后保存于- 80 ℃?zhèn)溆?。各處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)重復(fù)由3～5株幼苗的8～10片三出復(fù)葉(不包括最頂端新葉和有明顯非低溫?fù)p傷的葉片)組成。取樣時(shí)均處于光照條件下。

1.2RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

分別利用TRIzol(Invitrogen,美國)和RNeasy Mini試劑盒(Invitrogen,美國)對樣品總RNA進(jìn)行提取和純化。分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100方法，檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性等，以保證使用合格的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。6個(gè)樣品獲取到4.6～17.9 μg的RNA進(jìn)行建庫，質(zhì)量均滿足建庫要求，總量均滿足3次及以上常規(guī)量建庫。北京百邁客生物科技有限公司利用Illumina HiSeq 4000高通量測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，測序讀長為PE150。

1.3測序數(shù)據(jù)的過濾、組裝和注釋分析

利用FASTX軟件(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)去除Raw Data中的接頭和低質(zhì)量序列后得到Clean Data，并利用Trinity程序?qū)M(jìn)行組裝最終獲得Unigene序列。

利用BLAST程序(E-value=10-5)將Unigene序列分別與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG以及KEGG數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，獲得Unigene的注釋信息。

1.4差異表達(dá)基因(differentiallyexpressedgenes,DEG)的篩選

采用Bowtie軟件[15]將各樣品測序得到的reads與Unigene庫進(jìn)行比對，根據(jù)比對結(jié)果，結(jié)合RSEM方法[16]進(jìn)行表達(dá)量評估，并利用每千堿基外顯子百萬片段數(shù)(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads, FPKM)方法[17]計(jì)算樣本間的基因表達(dá)差異。將低溫處理較之未處理樣品間表達(dá)量符合錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)≤ 0.01且|log2Ratio|≥1條件的基因定義為差異表達(dá)基因。

1.5轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

大豆(Glycinemax)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)及百脈根(Lotusjaponicus)轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)序列下載于豆科轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(legume transcription factor database, Legume TFDB)[18]。將3種豆科植物中的相同轉(zhuǎn)錄因子家族序列合并在一起，利用BLAST程序(E-value=10-10)與Unigene進(jìn)行比對，鑒定紫花苜蓿中潛在的轉(zhuǎn)錄因子基因。

2 結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組測序與組裝

對紫花苜蓿ZG9830低溫脅迫處理0和48 h的葉片轉(zhuǎn)錄組測序后共獲得78 925條Unigene序列。所有Unigene序列的N50值為1 329，表明本研究的轉(zhuǎn)錄組組裝完整性較高。Unigene的序列長度主要分布在300～3 000 nt之間，共有76 164條Unigene序列，占總序列的96.50%。Unigene序列長度大于3 000nt的序列有2 761條，占總序列的3.50%。由圖1可以看出，本研究所獲得Unigene序列數(shù)量隨著測序長度的增加呈逐漸減少的趨勢，表明測試樣品具有較好的測序質(zhì)量。

圖1 Unigene序列長度分布Fig. 1 Length distribution of Unigene sequences

2.2Unigene功能注釋

通過BLAST(E-value=10-5)比對分析，78 925條Unigene共有43 930個(gè)Unigene在6個(gè)公共數(shù)據(jù)庫中得到注釋，占總Unigene數(shù)的55.66%(表1)。其中，NR數(shù)據(jù)庫中注釋到的Unigene數(shù)目最多，達(dá)到41 223個(gè)，占93.84%；最少的為KEGG數(shù)據(jù)庫，注釋到的Unigene數(shù)目為12 760，占29.05%。

表1 Unigene功能注釋Table 1 The functional annotation of Unigene

2.3差異表達(dá)基因的鑒定

以FDR≤ 0.01和|log2Ratio|≥1作為DEG篩選條件，相比未低溫處理的對照樣本，低溫處理48 h后共得到3 448個(gè)DEG，占總Unigene的7.85%。其中，1 835個(gè)Unigene上調(diào)表達(dá)，占53.22%;1 613個(gè)Unigene下調(diào)表達(dá),占46.78%。

2.4轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定

將所有紫花苜蓿葉片Unigene序列與大豆、蒺藜苜蓿和百脈根轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行同源比對，得到59個(gè)潛在的紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄因子家族共1 730個(gè)基因。其中，預(yù)測得到的轉(zhuǎn)錄因子基因數(shù)目最多的10個(gè)家族分別為PHD、ABI3VP1、AP2_EREBP、bHLH、atypical_MYB、HB、(R1)R2R3_Myb、WRKY_Zn、bZIP和NAC(表2)。紫花苜蓿經(jīng)低溫處理后，3 448個(gè)DEG中共有43個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族共251個(gè)基因被顯著地誘導(dǎo)表達(dá)。其中，差異表達(dá)顯著且包含轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多的10個(gè)家族分別為PHD、AP2_EREBP、bHLH、atypical_MYB、WRKY_Zn、Myb_related、GRAS、NAC、HB和bZIP(表2)。

表2 紫花苜蓿全部及差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目Table 2 Number of total unigenes and differentially expressed transcription factors

Note: DEG, differentially expressed genes.2.5響應(yīng)低溫脅迫差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)分析

低溫脅迫誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多的10個(gè)家族的DEG的表達(dá)模式各不相同(圖2)。上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子共有84個(gè)，下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子共有60個(gè)。 其中，轉(zhuǎn)錄因子WRKY_Zn家族(11個(gè)基因)和NAC家族(10個(gè)基因)都為上調(diào)表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

低溫脅迫通過抑制植物生長發(fā)育從而制約植物的生態(tài)分布并直接影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，甚至造成絕收[19-20]。因此，對植物特別是重要農(nóng)作物耐寒性及其機(jī)理進(jìn)行研究具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)一些小RNA分子，例如microRNA以及siRNA分子也參與到植物對低溫脅迫的響應(yīng)過程中[14,21-22]。另外，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及應(yīng)答多種逆境脅迫過程中也發(fā)揮著重要的作用。可見，植物對低溫脅迫的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的基因表達(dá)過程，涉及到多種基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[23]。

圖2 紫花苜蓿響應(yīng)低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)Fig. 2 Expression of alfalfa transcription factors following low temperature stress

隨著后基因組時(shí)代的到來，高通量測序技術(shù)已被廣泛用于研究模式和非模式植物的生長發(fā)育以及對逆境脅迫響應(yīng)的機(jī)制研究中[24-25]。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，陳嘉貝等[26]在鹽脅迫下的兩個(gè)甜瓜(Cucumismelo)品種中鑒定出19個(gè)和20個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，預(yù)測這些受鹽脅迫調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子基因可能參與到甜瓜響應(yīng)鹽脅迫反應(yīng)途徑中。本研究通過對一個(gè)具有高抗寒級別的紫花苜蓿品種ZG9830進(jìn)行4 ℃低溫脅迫處理48 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共得到了78 925條Unigene序列和3 448個(gè)DEG。所有的Unigene序列中，有93.84%的序列得到了注釋(表1)。其余未被注釋的序列可能是紫花苜蓿所特有的基因序列，仍有待于進(jìn)一步的分析。本研究中相關(guān)大量數(shù)據(jù)的獲得有助于增加對苜?？购詸C(jī)理的認(rèn)識，并可為后續(xù)抗寒相關(guān)基因的克隆及功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

通過BLAST比對分析，從3 448個(gè)DEG中共鑒定出43個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族共251個(gè)基因被顯著地誘導(dǎo)表達(dá)(表2)。截至目前，已有多種轉(zhuǎn)錄因子家族，包括MYB、AP2_EREBP、NAC、bHLH等參與調(diào)控植物響應(yīng)低溫脅迫反應(yīng)[23]。例如，在擬南芥(Arabidopsisthalianna)中過表達(dá)水稻OsMYB3R-2基因后，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗寒性顯著提高[27]。NAC是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子。水稻OsNAC6轉(zhuǎn)錄因子受冷處理誘導(dǎo)表達(dá)，說明該轉(zhuǎn)錄因子參與水稻低溫誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[28]。水稻轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH1被證明參與了冷脅迫的基因應(yīng)答調(diào)控[29]。在本研究中，差異表達(dá)顯著且包含轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多的10個(gè)家族分別為PHD、AP2_EREBP、bHLH、atypical_MYB、WRKY_Zn、Myb_related、GRAS、NAC、HB和bZIP。其中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族15個(gè)基因中14個(gè)下調(diào)表達(dá)，1個(gè)上調(diào)表達(dá)。atypical_MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中3個(gè)上調(diào)表達(dá)，10個(gè)下調(diào)表，而NAC轉(zhuǎn)錄因子家族中的10個(gè)基因全部受低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)(圖2)。可見，這些轉(zhuǎn)錄因子也都參與了紫花苜蓿響應(yīng)低溫脅迫的調(diào)控途徑；而其它具有差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子家族如何參與調(diào)控紫花苜蓿低溫脅迫還有待于進(jìn)一步研究。

通過轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析，在紫花苜蓿中獲得了大量響應(yīng)低溫脅迫的差異表達(dá)基因，并在轉(zhuǎn)錄組水平鑒定和分析了參與調(diào)控紫花苜蓿低溫誘導(dǎo)反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族基因及其表達(dá)模式，從而有利于從整體水平加深了解紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究這些響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄因子的功能提供參考，也可為紫花苜蓿耐低溫功能研究提供新的基因資源。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Identificationandexpressionanalysisoftranscriptionfactorsinalfalfaunderlowtemperaturestress

Qi Xiao1,2, Min Xue-yang3, Zhang Zheng-she3, Sun Qi-zhong1, Liu Wen-xian3
(1.Grassland Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science, Huhhot 010010, China; 2.National Animal Husbandry Service, Office of the Chinese Herbage Cultivar Registration Board, Beijing 100125, China;3.State Key Laboratory of Grassland Argo-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China)

Numerous studies have shown that transcription factors are important in regulating plant development and responses to various biotic/abiotic stressors. Low temperature stress could result in lowered production, reduced overwintering rate and a decrease in sustainability. In the present study, the identification and gene expression model of the transcription factors in alfalfa under low temperature stress (4 ℃) were analysed by the high-through put RNA-Seq technology. The results showed that a total of 78 925 Unigene sequences and 3 448 differently expressed genes were produced in our study. There were 43 transcription factor families, and a total of 251 genes were identified from all differently expressed genes. The expression model of these differently expressed transcription factor genes was different. This study facilitates the understanding of the expression model and verifies the related function of these low temperature response transcription factor genes in alfalfa.

Medicagosativa; transcription factors; low temperature stress; Unigene; transcriptome

Sun Qi-zhong E-mail：sunqz@126.com

S816;S541+.103

：A

：1001-0629(2017)09-1824-06

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0552

齊曉,閔學(xué)陽,張正社,孫啟忠,劉文獻(xiàn).紫花苜蓿響應(yīng)低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及表達(dá)分析.草業(yè)科學(xué),2017,34(9)：1824-1829.

Qi X,Min X Y,Zhang Z S,Sun Q Z,Liu W X.Identification and expression analysis of transcription factors in alfalfa under low temperature stress.Pratacultural Science，2017,34(9)：1824-1829.

2016-11-01接受日期：2017-01-29

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金國家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-35)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程牧草栽培與加工利用團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(CAAS-ASTIP-IGR 2015-02)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(31502000)；蘭州大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(lzujbky-2016-8)；國家草品種區(qū)域試驗(yàn)項(xiàng)目(21301060001)；巴彥淖爾肉羊優(yōu)質(zhì)飼草高效生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)集成與研究應(yīng)用

齊曉(1982-),男,河北泊頭人,農(nóng)藝師,在讀博士生,主要從事草品種管理與推廣工作。E-mail：tq07mms@sina.com

共同第一作者：閔學(xué)陽(1991-),男,甘肅張掖人,在讀碩士生,主要從事牧草分子生物學(xué)研究。E-mail：minxy15@lzu.edu.cn

孫啟忠(1959-),男,內(nèi)蒙古五原人,研究員，博士，主要從事草地生態(tài)與牧草生產(chǎn)技術(shù)研究。E-mail：sunqz@126.com