江瑞，周妮，王瓊，方杰，楊培仙

(中國人民解放軍第105醫(yī)院血液科，安徽合肥230031)

急慢性再生障礙性貧血患者骨髓組織VEGF-C的表達及意義

江瑞，周妮，王瓊，方杰，楊培仙

(中國人民解放軍第105醫(yī)院血液科，安徽合肥230031)

目的探討急慢性再生障礙性貧血(AA)患者骨髓血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)表達的異同及其意義。方法采用原位雜交法檢測63例解放軍第105醫(yī)院2012年5月至2015年5月收治的急性和慢性AA患者免疫抑制劑與激素治療前后骨髓小粒中VEGF-C的表達情況，其中急性AA 38例，慢性AA 25例，并與20例健康人作對照比較。結(jié)果VEGF-C主要表達于骨髓基質(zhì)細胞，陽性表達率為20.63%。治療后急慢性再生障礙性貧血患者骨髓血管內(nèi)皮生長因子-C[(139.45±24.39)pg/mL、(134.78±25.24)pg/mL]的表達明顯高于治療前[(73.12±20.18)pg/mL、(66.23±21.86)p g/mL]，且低于對照組[(170.51±29.64)pg/mL]，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。但急慢性再生障礙性貧血患者骨髓血管內(nèi)皮生長因子-C(139.45±24.39)pg/mL、(134.78±25.24)pg/mL]比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)論急慢性AA治療前VEGF-C表達降低，治療后VEGF-C表達上調(diào)，VEGF-C在疾病治療轉(zhuǎn)歸中可起到重要作用。

再生障礙性貧血；急性；慢性；血管內(nèi)皮生長因子-C；骨髓

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)為獲得性骨髓造血功能異常，主要由貧血、出血、感染引起，我國發(fā)病率高[1-2]。急性AA病程較長且病情進展迅速，死亡率高，慢性AA病程遷延，病情進展緩慢，生存期不等。治療以免疫抑制或糖皮質(zhì)激素為主，可緩解病情，臨床具有一定的療效，但部分患者效果差甚至死亡，且復發(fā)率高，AA的治療成為臨床難題[3-4]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是高度特異的血管內(nèi)皮細胞分裂原，可通過自分泌調(diào)節(jié)、加速骨髓造血，可誘導血管新生，維持血管密度和生理性造血[5-6]。VEGF-C作為骨髓組織促血管生成因子，其表達水平與骨髓基質(zhì)損傷及恢復密切相關(guān)[7]。本研究采用原位雜交法檢測急慢性骨髓VEGF-C表達，為AA開拓新的治療途徑，建立診斷及判斷指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2012年5月至2015年5月解放軍第105醫(yī)院收治63例門診及住院AA患者為研究對象，均經(jīng)骨髓細胞學檢查符合《血液病診斷及療效標準》[8]，并排除心肝腎嚴重疾病。其中急性AA患者38例，男性23例，女性15例；年齡16～49歲，平均(34.2±5.6)歲。慢性AA患者25例，男性15例，女性10例；年齡13～49歲，平均(33.2±5.8)歲。選擇同時期20例健康志愿者為對照組，其中男性12例，女性8例；年齡18～45歲，平均(35.1±6.2)歲。急性和慢性AA患者和健康志愿者的性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 治療方法急性AA患者采用常規(guī)治療，口服康力龍，2～4 mg/次，3次/d；靜脈滴注兔抗人T細胞球蛋白3 mg·kg-1·d-1；口服環(huán)孢霉素軟膠囊，5 mg·kg-1·d-1。慢性AA患者給予口服康力龍和環(huán)孢霉素軟膠囊。3個月為一個療程，共治療2個療程。

1.3 檢測方法常規(guī)取髂后上棘骨髓0.3 mL，制成涂片標木送檢，常規(guī)HE染色。采用原位雜交法檢測VEGF-C，步驟為：切片置烤箱烘烤使切片緊密粘附；常規(guī)二甲苯脫蠟固定，和梯度酒精水化后；切片于，EDTA抗原修復液中進行抗原修復；過氧化氫溶液，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；滴加BSA封閉液進行封閉；滴加兔抗人VEGF多克隆抗體；生物素化山羊抗兔IgG抗體；鏈霉親和親、素生物素-過氧化物酶復合物；DAB室溫顯色，并嚴格控制反應時間；復染后，脫水，透明，封片，進行觀察。先在低倍鏡下觀察，陽性VEGF棕黃色者為陽性細胞陽性，表達部位在于細胞漿。隨機選取5個視野，計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞百分率。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，組間比較行配對t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C細胞表達VEGF-C陽性表達于骨髓基質(zhì)細胞胞漿，呈棕黃色顆粒。血竇內(nèi)皮周圍細胞表達較高，造血細胞也可見表達。見圖1、2、3。再生障礙性貧血VEGF-C主要表達于骨髓基質(zhì)細胞。急慢性再生障礙性貧血VEGF陽性13例，陽性表達率為20.63%。

圖1 VEGF-C治療前急性AA骨髓組織表達(×200)

圖2 VEGF-C治療后急性AA骨髓組織表達(×200)

圖3 VEGF-C正常骨髓組織表達(×200)

2.2 急慢性AA患者治療前后的骨髓VEGF比較治療后急慢性AA患者骨髓VEGF的表達較治療前明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；但治療前后急性與慢性AA患者兩組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 急慢性AA患者治療前后骨髓VEGF比較(pg/mL，x-±s)

2.3 急慢性AA患者骨髓VEGF表達與健康人比較急慢性再生障礙性貧血患者骨髓血管內(nèi)皮生長因子-C治療前[(139.45±24.39)pg/mL、(134.78±25.24)pg/mL]和治療后[(73.12±20.18)pg/mL、(66.23±21.86)pg/mL]均顯著低于對照組[(170.51±29.64)pg/mL]，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

AA為獲得性骨髓造血功能異常，表現(xiàn)為骨髓造血細胞增生，外周血全血細胞減少，主要由貧血、出血、感染引起，AA病情進展迅速，死亡率高且易復發(fā)，嚴重威脅生命健康。AA發(fā)病機制復雜，可能與物理、化學、生物等因素有關(guān)，人體骨髓造血干細胞損傷、造血微環(huán)境及免疫調(diào)節(jié)改變等也可導致AA，造成血管密度減低，骨髓造血功能衰竭等系列病理改變，發(fā)生進行性貧血、出血等AA綜合征。骨髓造血微環(huán)境改變可能是AA主要機制，包括神經(jīng)體液、骨髓微血管等[9-10]。VEGF與AA有一定的相關(guān)性，AA患者血清中血管內(nèi)皮細胞生長因子的表達與健康志愿者存在一定的差異[11]。因此本研究采用原位雜交法探討骨髓VEGF-C在AA中的表達及意義。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，再生障礙性貧血VEGF-C主要表達于骨髓基質(zhì)細胞，急慢性AA患者VEGF陽性13例，陽性表達率為20.63%。AA患者骨髓VEGF-C的表達明顯低于健康志愿者，治療后AA患者骨髓VEGF-C的表達較治療前上調(diào)。說明骨髓VEGF-C的表達與AA患者的發(fā)病急慢程度無關(guān)，而與疾病發(fā)病機制和治療有關(guān)。由于VEGF具有提高血管通透性、誘導內(nèi)皮細胞增殖、促進血管形成的作用，骨髓VEGF-C的表達下調(diào)，說明AA患者的發(fā)病機制可能與血管通透性和內(nèi)皮細胞有關(guān)[12-13]。通過治療后，AA患者骨髓VEGF-C表達上調(diào)，可能是由于VEGF旁分泌對血管內(nèi)皮細胞受體F1t-1和KDR的調(diào)節(jié)作用，促使微血管通透性增加，形成纖維凝膠支持新生血管的生長，促進新生血管生成[14-15]。AA患者骨髓VEGF低表達，導致骨髓血管生成減少，影響骨髓局部血液供應，減少骨髓造血細胞的營養(yǎng)供給，進而影響骨髓正常造血，導致AA。

綜上所述，AA患者骨髓VEGF-C的表達低于健康志愿者，陽性率較低，常規(guī)治療后VEGF-C的表達上升。因此，采用原位雜交法檢測骨髓VEGF-C對AA的診斷、發(fā)病機制及治療具有重要意義。

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Expression of vascular endothelial growth factor-C in patients with aplastic anemia.

JIANG Rui,ZHOU Ni,WANGQiong,FANG Jie,YANG Pei-xian.Department of Hematology,the 105thHospital of Chinese PLA,Hefei 230031,Anhui,CHINA

ObjectiveTo study the expression vascular endothelial growth factor-C(VEGF-C)in marrow of patients with acute and chronic aplastic anemia.MethodsThe expression levels of VEGF-C in marrow of patients with acute(38 cases)and chronic(25 cases)aplastic anemia who were treated in the 105thHospital of Chinese PLA from May 2012 to May 2015 was detected by in situ hybridization,and then compared with those of healthy volunteers(20 cases)ResultsThe expression of VEGF-C in marrow of aplastic anemia was located in the stromal cell,and the positive expression rate was 20.63%.After treatment,the expression of VEGF-C in marrow of patients with acute and chronic aplastic anemia were(139.45±24.39)pg/mL,(134.78±25.24)pg/mL,which were significantly higher than(73.12±20.18)pg/mL,(66.23±21.86)pg/mL before treatment and lower than(170.51±29.64)pg/mL of healthy volunteers after treatment(P＜0.05).The expression of VEGF-C showed no statistically significant difference between patients with acute aplastic anemia and those with chronic aplastic anemia(P＞0.05).ConclusionThe expression of VEGF-C in marrow of patients with aplastic anemia is lower than healthy volunteers,and the expression increases after treatment,which indicates that VEGF-C provides a detection index for the diagnosis and treatment of patients with aplastic anemia.

Aplastic anemia;Acute;Chronic;Vascular endothelial growth factor-C(VEGF-C);Marrow

R556.5

A

1003—6350（2017）18—2945—03

2017-03-02)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.18.006

江瑞。E-mail：hbdyl81@163.com