黃幼生，翁陽，解娜，張藝馨，羅志飛，薛逢貴

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科，海南?？?70102)

結腸癌microRNA表達譜檢測及生物信息學分析

黃幼生，翁陽，解娜，張藝馨，羅志飛，薛逢貴

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科，海南?？?70102)

目的探討miRNA(microRNA，微小RNA)在結腸癌組織中的表達特征及生物學功能。方法選取臨床特征相似的3對結腸癌組織及其配對正常黏膜組織，應用Exiqon miRNA芯片檢測miRNA在結腸癌及其配對組織中差異表達情況；3個差異表達的miRNA被選取進行qPCR驗證；生物信息學分析差異表達的miRNA及其靶向基因在結腸癌進展中的作用機制。結果芯片結果顯示，在3對結腸癌組織中有201個miRNA出現上調表達，94個下調表達(差異倍數＞2)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。qPCR結果顯示，與對照組織比較，選取的3個miRNA中hsa-miR-18b-3p、hsa-miR-31-5p在結腸癌組織中表達上調，hsa-miR-142-3p表達下調，與芯片結果一致，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。GO及pathway分析顯示差異表達的miRNA涉及結腸癌細胞的分化、遷移、定位、增生及RNA、蛋白合成等功能調控，與細胞粘附、結腸癌發(fā)生發(fā)展等信號途徑的激活相關。結論結腸癌組織中miRNA存在異常表達，可能涉及結腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

miRNA；結腸癌；差異表達；生物信息學；miRNA芯片

結腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居第五位[1]。轉移、復發(fā)的晚期結腸癌患者主要依靠藥物治療，雖然靶向治療取得了一定的成效，但因靶向藥物少，易耐藥等缺點，使得轉移性結腸癌患者的預后仍然不理想，因而闡明結腸癌發(fā)病的分子機制、尋找分子靶標、開發(fā)靶向藥物是改善治療措施、提高患者預后的關鍵[1-2]。miRNA(microRNA，微小RNA)是一類非編碼RNA，大小21～25個核苷酸，由約70 nt大小的可形成發(fā)夾結構的前體加工而來，其作用是在轉錄水平上對基因表達產生抑制性作用[3]。越來越多的資料顯示，miRNA結構或表達的異常與腫瘤的發(fā)生密切相關，涉及腫瘤的浸潤、轉移、分期及預后等[3-5]。許多研究證實miRNA異常表達參與了結腸癌的發(fā)生發(fā)展，是結腸癌診斷、治療或判斷預后的候選生物標志[6-7]。

本課題利用Exiqon miRNA寡核苷酸芯片，檢測3對結腸癌及其配對組織的miRNA表達特征。應用生物信息學分析差異表達的miRNA生物學功能及其在結腸癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用，為闡明結腸癌的發(fā)病機制、尋找分子靶標、開發(fā)靶向藥物奠定分子理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料3對結腸癌及其配對正常的結腸黏膜組織(距離腫瘤邊緣5 cm)均來自海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2014年1月手術切除標本，其使用已獲得患者知情同意?；颊咝畔呐R床病例信息中心提取，所有病例術前均未接受放化療，病理診斷、分型、分期由兩位高級職稱病理專家HE切片確診。

1.2 主要試劑miRCURYTM Array Power標記試劑盒(Cat#208032-A)、miRCURYTM LNA芯片(v.18.0)購自Exiqon公司產品。TRIzol?Reagent為Invitrogen life technologies產品；RNasey Mini試劑盒購自QIAGEN公司；miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒購于北京天根生物技術有限公司。

1.3 組織總RNA提取及純化3對結腸癌及其配對組織使用BioPulverizer?進行組織破碎勻漿，使用TRIzol試劑盒提取組織總RNA，具體提取及純化步驟按TRIzol及RNasey Mini試劑盒使用說明書進行。RNA濃度及純度使用NanoDrop ND-1000測量，1.5%凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.4 RNA標記與芯片雜交RNA標記及芯片雜交具體操作由上?？党缮镉邢薰就瓿?，簡而言之，采用Fluorescent label(Hy3TM)標記純化的RNA。標記完成后，根據Exiqon的實驗方法將樣品與miRCURYTM LNAArray(v.18.0)芯片雜交：(1)25 μL的樣品與25 μL的雜交緩沖液混合，95℃變性2 min，隨即置于冰上2 min。(2)應用雜交系統(tǒng)(Nimblegen Systems，Inc，Madison，WI，USA)，將樣品與芯片56℃下雜交18 h。(3)雜交完成后，使用Wash buffer kit(Exiqon)清洗芯片，應用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片。

1.5 數據分析GenePix Pro6.0軟件讀取芯片圖像、提取探針信號值，相同的探針取中值合并。保留在所有樣品中均≥30.0的探針，進行中值標準化，篩選差異表達探針。使用倍數變化(＞2.0)及P值(P＜0.05)篩選兩組樣品間差異表達的miRNA。最后，對差異表達miRNAs進行聚類并繪制聚類圖。miRNA Raw數據提交至美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的基因表達綜合數據庫(Gene Expression Omnibus database，GEO)，通過號為GSE101502。

1.6 實時定量PCR(qPCR)驗證應用Primer 6.0軟件設計3個被選取進行qPCR驗證的miRNA引物，由英駿生物公司合成，引物序列見表1。應用ABI ViiA7 Real-time PCR儀進行逆轉錄及PCR反應，簡述如下：采用miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒進行逆轉錄，miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒進行PCR反應，具體操作按試劑盒說明書進行。反應體系：2×SYBR Green mix 10 μL，通用引物(10μmol/L)0.4 μL，特異引物(10μmol/L)0.4 μL，cDNA 1 μL，50×ROX Reference Dye 1 μL，RNase-free水補充至體積20 μL。反應條件：94℃預反應2 min，94℃20 s、60℃34 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miRNA相對表達值，U6 snRNA為內參。

1.7 生物信息學分析檢索miR2Disease與miRCancer數據庫中癌癥相關miRNA，BioVenn軟件在線篩選本文中差異表達的miRNA與兩大數據庫下載的腫瘤相關miRNA三方重疊數據。應用mircocosm、targetscan及miranda在線軟件預測差異表達miRNA可能的靶向基因，利用在線miRTarBase軟件(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)下載差異表達miRNA實驗已驗證的靶向基因，剔除兩者重復項，應用在線數據庫DAVID系統(tǒng)(http://david.ncifcrf.gov/)將獲得的靶向基因進行GO(Gene ontology)及KEGG pathways富集分析。

表1 miRNA特異性引物及U6引物列表

1.8 統(tǒng)計學方法miRNA芯片及qPCR數據均為計量資料，以均數±標準差(x-±s)表示。miRNA芯片檢測數據采用芯片顯著性分析(significance analysis of microarray，SAM)；qPCR檢測數據應用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行Student'st檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 標本信息及RNA提取3對結腸癌病例為近期手術切除標本，患者病理及臨床資料相對接近。3例均為男性，62～64歲(平均年齡62.7歲)，TNM分期Ⅱ的高分化結腸管狀腺癌患者?？俁NA提取完成后，NanoDrop檢測顯示各標本總RAN OD260/280在1.97～2.01之間，總含量均超過30 μg；1.5%凝膠電泳鑒定顯示，各標本均有3條清晰的泳帶，28S、18S清晰明亮。表明提取的總RNA含量充足，可用于芯片檢測及qPCR分析。

2.2 miRNA芯片表達分析芯片結果顯示超過2 000個miRNA在結腸癌組織中存在表達，295個miRNA在癌組織及其配對組織間出現不同程度的差異表達(具體請查詢GEO：GSE101502)。其中，相對配對組織，有201個miRNA在結腸癌組織內出現上調表達，94個出現下調表達(差異倍數＞2)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。前10上調及下調表達的miRNA見表2。為更直觀地了解結腸癌及其配對正常黏膜組織中miRNA的表達特征，無監(jiān)督層次聚類與相關分析被執(zhí)行。結果顯示6組miRNA很清晰的分為兩大組，對應結腸癌組織及其配對組(圖1)，表明與正常黏膜組織比較，miRNA在結腸癌組織中的表達出現異常變化。

表2 差異表達前10的miRNA(結腸癌/配對正常結腸黏膜組織)

2.3 qPCR驗證為了驗證miRNA芯片數據的可靠性，3個差異表達的miRNA(hsa-miR-18b-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-31-5p)被選取執(zhí)行qPCR檢測。結果顯示，在這3對結腸癌組織中，相比對照組織，hsa-miR-18b-3p、hsa-miR-31-5p出現上調表達，hsa-miR-142-3p下調表達(表3)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與芯片檢測的結果基本一致，表明miRNA芯片檢測結果真實有效(圖2)。

2.4 生物信息學分析從miR2Disease、miRCancer數據庫下載癌癥相關miRNA，剔除重復項，共獲得700余個miRNA，其中結腸癌相關miRNA 252個。將本研究中差異表達的miRNA與這兩群數據相比較，通過BioVenn在線軟件分析發(fā)現有14個miRNA與兩大數據庫結腸癌相關miRNA重疊，包括：hsa-miR-31-5p及hsa-miR-142-3p。本研究以qPCR驗證有差異表達的hsa-miR-31-5p、hsa-miR-142-3p為模板，應用mircocosm、targetscan及miranda數據庫在線預測其可能的靶向基因，Bio-Venn分析三大數據庫重疊的基因(87條)作為預測可靠的靶向基因，再從mitarBASE數據庫[8]下載已有實驗驗證的靶向基因(86條，至少有兩種方法證實)，剔除重復項，共計獲得149個靶向基因。應用DAVID數據庫對這149個靶基因進行在線GO及KEGG pathways富集分析，分析發(fā)現，這些miRNA的靶向基因與細胞分化、細胞遷移、細胞定位、細胞增生、RNA及蛋白合成等功能調控有關，涉及細胞粘附、結腸癌發(fā)生發(fā)展等相關信號途徑的激活(圖3)。

圖1 結腸癌組織差異表達miRNA聚類分析圖

表3 3個miRNAs在結腸癌及其配對組織中的qPCR檢測結果(x-±s)

圖2 qPCR/miRNA芯片檢測miRNA表達結果比較圖

圖3 KEGG分析P值前10信號途徑

3 討論

miRNAs是具有調控mRNA表達功能的非編碼RNA，調控大概三分之一人類基因mRNA的表達。miRNA通過與靶基因互補結合，切割mRNA，抑制靶基因的翻譯，調控基因表達[3-4]。越來越多的研究表明，miRNA的異常表達可引起腫瘤相關基因的激活或失活，參與調控細胞分化、凋亡、增生及腫瘤的浸潤、轉移等，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3-7]。

目前，生物芯片的應用越來越廣泛，是篩選疾病相關miRNA最常用的方法之一。應用該項技術發(fā)現每種腫瘤都有其特異的miRNA表達譜，更能準確地進行組織分類及腫瘤分型[3-5,9]。Volinia等[10]應用540例各種癌癥組織標本進行miRNA表達譜差異分析，發(fā)現miRNA在的表達具有組織特異性，組合性檢測上調表達的21個miRNA能正確區(qū)分、前列腺癌、胰腺癌、結腸癌、乳腺癌和肺癌等組織。本研究應用Exiqon miRNA芯片檢測3對結腸癌組織及其配對正常組織，發(fā)現相比配對正常組織，有201個miRNA在結腸癌組織中上調表達，94個下調表達，qPCR的驗證結果與芯片一致，表明miRNA在結腸癌組織中存在表達異常。

近年來，研究miRNA在結直腸癌組織中表達情況的報道逐漸增多[6,7,11-13]。通過文獻復習分析發(fā)現有接近600個miRNA被發(fā)現在結直腸癌組織中存在差異表達，主要上調表達的有miR-181b，miR-106b，miR-92a，miR-31，miR-29a，miR-29b，miR-21，miR-20a，miR-19a，miR-18a，miR-17等，下調表達的主要有miR-192，miR-142，miR-133a，miR-129，miR-101，miR-34a，miR-30a，miR-30c，miR-9，let-7a，miR-1等，涉及腫瘤細胞的分化、增生、浸潤、轉移、藥物抗性等多種生物學功能，認為能夠作為結腸癌診斷、預后、復發(fā)及藥物療效的標記物。然而異常表達的miRNA在不同的研究中重合率較低，重復性差。本文通過檢索miRCancer與miR2Disease數據庫，共獲得252個結腸癌相關miRNA，來源于500余篇文獻，分散度大。本文發(fā)現的295個差異表達的miRNA僅僅14個曾報道與結腸癌相關。造成重復性差的原因可能與結腸癌組織的異質性、個體和種族的差異性及采用的研究方法等的不同有關。

miRNA通過靶向序列的互補性調控靶基因的表達，發(fā)揮其生物學功能，根據miRNA序列預測其靶基因是研究miRNA功能的常用方法之一[3-5,9]。目前，預測miRNA靶向基因的在線軟件比較有名的有Targetscan，miRbase、mircocosm及miranda等[14]。本研究采取Targetscan，mircocosm及miranda預測(miRNA hsa-miR-31、hsa-miR-142)的靶向基因，三者重疊的靶基因作為可靠的預測結果。本文通過檢索mitarBASE數據庫[8]獲取已有實驗驗證的miRNA(hsa-miR-31、hsa-miR-142)靶向基因，兩種方法共獲得149個靶向基因。GO及KEGG分析發(fā)現這些miRNA的靶向基因與細胞分化、細胞遷移、細胞定位、細胞增生、RNA及蛋白合成等功能調控有關，涉及細胞粘附、結腸癌發(fā)生發(fā)展等相關信號途徑的激活。

綜上所述，多量的miRNA在結腸癌組織中存在表達異常，這些異常表達的miRNA可能參與結腸癌的發(fā)生、發(fā)展。更多的實驗去探索這些差異表達的miRNA在結腸癌組織中的功能及作用方式有助于闡明結腸癌生物學進程的分子機制。

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Expression profile of microRNAs and bioinformatics analysis in human colon cancer tissues.

HUANG You-Sheng,WENG Yang,XIE Na,ZHANG Yi-xin,LUO Zhi-fei,XUE Feng-gui.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression profile and biological functions of miRNAs(microRNA)in human colon cancer tissues.MethodsThe expression profiles of miRNAs were compared between 3 pairs of colon cancer and its adjacent normal tissues using a Exiqon miRNA array,following which quantitative PCR(qPCR)was employed to confirm the results of the miRNA array,and 3 differentially expressed miRNAs were selected for qPCR validation.Bioinformatics was used to analyze the biological function of the differentially expression miRNAs and its target genes in colon cancer.ResultsCompared with adjacent normal mucosal tissues,201 miRNAs were up-regulated and 94 miRNAs were down-regulated in colon cancer tissues(fold＞2),the difference was statistically significant(P＜0.05).The qPCR results showed that,compared with the control group,the expression of hsa-miR-18b-3p and hsa-miR-31-5p were up-regulated and the expression of hsa-miR-142-3p was down regulated in colon cancer tissues,which were consistent with microarray-based expression analysis,with statistically significant difference(P＜0.05).Furthermore,the online GO and KEGG pathwany analysis revealed that the differentially expressed miRNAs may be involving cell differentiation,migration,localization,proliferation,synthesis of RNA and protein and other biological functions,and perhaps related to cell adhesion and activation of signaling pathways of colon cancer development.ConclusionThere are abnormal expression of miRNAs in colon cancer tissues,which may be related to colon cancer tumorigenesis.

microRNA;Colon cancer;Differential expression;Bioinformatics;microRNAarray

R735.3+5

A

1003—6350（2017）18—2928—04

2017-07-17)

10.3969/i.issn.1003-6350.2017.18.002

國家自然科學基金(編號：81260321)

黃幼生。E-mail：hys768811@163.com