王 琳，王 睿，鄭循華，張麗娟

氣相轉(zhuǎn)化－化學(xué)發(fā)光法測(cè)定土壤中的亞硝態(tài)氮

王 琳1，2，王 睿2*，鄭循華2，3，張麗娟1

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定071000；2.中國(guó)科學(xué)院大氣物理研究所大氣邊界層物理和大氣化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100029；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)地球科學(xué)學(xué)院，北京200049）

試驗(yàn)探究了將亞硝態(tài)氮（NO2－）還原轉(zhuǎn)化為一氧化氮（NO）氣體與化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)NO相結(jié)合的方法（氣相轉(zhuǎn)化－化學(xué)發(fā)光法，簡(jiǎn)稱(chēng)NC法）對(duì)土壤NO2－含量測(cè)定的適用性。在室溫條件下，采用濃度為50%的冰醋酸提供酸性條件，以抗壞血酸為還原劑，將NO2－還原為NO氣體，生成的NO被高純氮?dú)廨d入化學(xué)發(fā)光法氮氧化物分析儀的NO檢測(cè)通道，實(shí)時(shí)記錄NO信號(hào)值并積分信號(hào)峰面積，通過(guò)已知NO2－濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定樣品中的NO2－濃度。結(jié)果顯示：NO信號(hào)值的峰面積與樣品的NO2－濃度顯著正相關(guān)（P＜0.01），線性檢測(cè)范圍為2～500 μg·L－（1以純N計(jì)，下同），檢出限為2 μg·L－1，對(duì)土壤NO2－濃度的檢出限為10 μg·kg－（1以水土比為5∶1計(jì)），優(yōu)于比色法的檢出限15 μg·kg－1；重復(fù)測(cè)定10次50 μg·L－1標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積變異系數(shù)為1.2%，精度為1.2 μg·L－（195%置信區(qū)間），對(duì)應(yīng)的土壤NO2－濃度檢測(cè)精度為6 μg·kg－1，優(yōu)于比色法的檢測(cè)精度11 μg·kg－1；檢測(cè)已知濃度NO2－的回收率為90%～97%。與比色法相比，NC法測(cè)定酸性土壤NO2－濃度的準(zhǔn)確度相當(dāng)，精度更優(yōu)，但該方法測(cè)定堿性土壤NO2－濃度的結(jié)果偏高，可能是堿性土壤中大量的Ca2+、SO24－和CO23－對(duì)測(cè)定有干擾，而且NC法測(cè)定NO2－濃度的分析時(shí)間較比色法長(zhǎng)，單個(gè)樣品需8～15 min。

亞硝態(tài)氮；氣相化學(xué)發(fā)光法；土壤；一氧化氮

亞硝態(tài)氮（NO-2）在陸地生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過(guò)程中具有重要作用，參與土壤的多個(gè)氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程，如硝化、反硝化、硝化細(xì)菌反硝化、厭氧氨氧化及硝酸鹽異化還原為銨等過(guò)程[1]，可生成一氧化氮（NO）和氧化亞氮（N2O）等含氮?dú)怏w，間接影響氣候及環(huán)境。其中，NO是大氣中的高活性組分，會(huì)造成空氣質(zhì)量惡化，還會(huì)導(dǎo)致酸雨的形成和對(duì)流層臭氧（O3）的產(chǎn)生[2-3]；N2O是一種重要的溫室氣體，也是破壞平流層O3的首要人為源大氣成分[4]。土壤NO-2還是大氣中氣態(tài)亞硝酸（HONO）的重要來(lái)源[5]，HONO是城市污染的一種典型代表物，大氣中氫氧自由基主要來(lái)源于HONO光解，土壤NO-

2的含量與轉(zhuǎn)化對(duì)于大氣化學(xué)及氣溶膠動(dòng)力學(xué)有著重要的影響[6]。此外，NO-2會(huì)通過(guò)植物進(jìn)入人體內(nèi)，一方面會(huì)降低血液的載氧能力，導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥[7]；另一方面可與次級(jí)胺結(jié)合，形成亞硝胺，誘發(fā)癌變[8-9]。因此，準(zhǔn)確地測(cè)定土壤中NO-2的含量對(duì)于氮素循環(huán)、氣候環(huán)境變化研究及人類(lèi)健康評(píng)估具有重要的影響。

測(cè)定NO2-的方法有比色法[10-11]、熒光光度法[12-13]、化學(xué)發(fā)光法[14-15]、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法[16]、離子色譜法[17-18]和流動(dòng)分析法[19-20]等。比色法最為常用，測(cè)定水質(zhì)中NO2-含量的國(guó)標(biāo)方法就是比色法[21]，其測(cè)定原理是NO2-在磷酸介質(zhì)（pH=1.8）中與4-氨基苯磺酰胺反應(yīng)生成重氮鹽，再與N-（1-萘基）-乙二胺二鹽酸鹽偶聯(lián)生成紅色染料，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，當(dāng)NO2-含量小于200 μg·L-（1以純N計(jì)，下同）時(shí)，吸光度與NO2-含量成正比。有研究者采用將NO2-還原轉(zhuǎn)化為NO氣體與化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)NO相結(jié)合的方法（氣相轉(zhuǎn)化-化學(xué)發(fā)光法，簡(jiǎn)稱(chēng)NC法）測(cè)定水體及血漿中微量的NO2-。該方法的原理是在酸性條件下，NO2-被還原為NO，產(chǎn)生的NO與O3反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)的二氧化氮（NO2*），其在返回基態(tài)時(shí)放出的能量與NO2-濃度成正比，由此可對(duì)NO2-進(jìn)行定量（見(jiàn)反應(yīng)式1、2，其中hv表示釋放出的能量）。1980年Cox[22]首次用該方法測(cè)定自然水體中的NO2-，還原劑為碘離子（I-）；之后有研究者利用釩（V3+）作為還原劑測(cè)定海水中的NO-2[23-24]；還有研究者利用抗壞血酸（Vc）作為還原劑，檢測(cè)血漿中的NO-2濃度[25]。

NO-2是活性很強(qiáng)的離子，極易發(fā)生反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成其他的氮素形態(tài)，因而土壤或浸提液樣品中的NO-2不易保存，大量樣品難以實(shí)現(xiàn)在線測(cè)定。研究中往往通過(guò)加入穩(wěn)定劑抑制微生物活性的方法保存NO-2，但穩(wěn)定劑大多有毒性（如氯仿、氯化汞等）[26]，為此需要尋找一個(gè)能夠直接、在線測(cè)定土壤NO-2含量的簡(jiǎn)易而安全的方法。Nagababu等[25]采用NC法在線測(cè)定血漿中痕量的NO-2，操作相對(duì)簡(jiǎn)單并具有較高的準(zhǔn)確度（97%）和低的檢測(cè)限（0.2～0.9 μg·L-1）。但目前僅有少數(shù)研究者采用NC法測(cè)定土壤浸提液中的NO-2，如Amini等[27]。NC法能否成為一種在線測(cè)定土壤中NO2-含量的方法是本研究關(guān)注的科學(xué)問(wèn)題。本文參照Nagababu等[28]提供的測(cè)定血漿中NO2-的NC法（利用冰醋酸提供酸性條件，抗壞血酸作為還原劑），測(cè)定三種不同酸堿度土壤的NO2-濃度，并與比色法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)估該方法對(duì)于測(cè)定土壤NO2-含量的分析精度及適用性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用亞硝酸鈉（NaNO2）配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，選取中間濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液采用NC法重復(fù)測(cè)定，通過(guò)變異系數(shù)計(jì)算方法的精度（濃度與其2倍變異系數(shù)的乘積）；用濃度稀釋法在3倍信噪比時(shí)，測(cè)得NO-2的濃度，求得檢出限；采用NC法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作液中NO-2的濃度，確定該方法適宜的檢測(cè)范圍。

選擇三種不同酸堿度的土壤，按5∶1的水土比，分別采用去離子水和含有50 μg·L-1的NaNO2溶液浸提，所得浸提液分別稱(chēng)為待測(cè)液A和待測(cè)液B；將待測(cè)液B與50 μg·L-1的NaNO2溶液等體積混合，得到待測(cè)液C，以計(jì)算方法的回收率。每個(gè)土壤設(shè)置3次重復(fù)，以試驗(yàn)用水作為空白對(duì)照，待測(cè)液A、B和C中的N濃度同時(shí)采用比色法和NC法測(cè)定，并分別計(jì)算回收率，評(píng)估NC法測(cè)定土壤N的準(zhǔn)確度和適用性。

1.2 供試土壤及浸提液制備

供試土壤分別為取自湖南省長(zhǎng)沙市金井鎮(zhèn)小流域（113°20′E，28°33′N(xiāo)）雙季稻田的酸性（pH 5.4）砂質(zhì)壤土（HN）、取自湖北省十堰市西溝村（110°37′E，32°38′N(xiāo)）單季稻田的酸性（pH 6.2）砂質(zhì)壤土（HB）和取自山西省永濟(jì)市董村農(nóng)場(chǎng)（34°56′N(xiāo)，110°43′E）的典型冬小麥－夏玉米輪作農(nóng)田的堿性（pH 8.7）壤質(zhì)粘土（SX）。土壤的基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1，詳細(xì)的試驗(yàn)點(diǎn)概況及土壤性質(zhì)數(shù)據(jù)請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn)[29－31]。采回的鮮土經(jīng)風(fēng)干、過(guò)篩（2 mm）、除雜、混勻后，置于室內(nèi)干燥保存。

稱(chēng)取風(fēng)干土壤樣品20.00 g置于三角瓶中，加入100 mL去離子水或50 μg·L－1的NaNO2溶液，振蕩30 min，離心（8000 r·min－1）5 min，過(guò)濾（0.45 μm聚醚砜膜），浸提液當(dāng)天測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 NC法測(cè)定NO－2濃度

（1）儀器和試劑

氮氧化物分析儀（42i NO－NO2－NOx，熱電環(huán)境儀器公司，中國(guó)上海），當(dāng)平均讀數(shù)時(shí)間為60 s時(shí)，儀器的檢出限為0.40 nmol·mol－1。

NaNO2標(biāo)準(zhǔn)貯備液1（100 mg·L－1）：稱(chēng)取0.492 9 g的NaNO2試劑溶解于去離子水中，定容至1 L，4℃冰箱內(nèi)可保存一周。

NaNO2標(biāo)準(zhǔn)貯備液2（1 mg·L－1）：吸取1 mL的貯備液1，用去離子水定容至100 mL，配制僅供當(dāng)天使用。

NaNO2標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0 mL的貯備液2于50 mL容量瓶中，用去離子水定容，獲得濃度為2、10、20、30、40、50、100、200、300、500 μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

50%的冰醋酸溶液：將冰醋酸和去離子水等體積混合。

抗壞血酸溶液（0.05 mol·L－1）：稱(chēng)取0.88 g抗壞血酸溶解于100 mL去離子水中，配制僅供當(dāng)天使用。

氫氧化鈉（NaOH）溶液（2 mol·L－1）：稱(chēng)取80 g NaOH溶于1 L去離子水中。

（2）試驗(yàn)裝置

裝置由氣源、反應(yīng)部分、檢測(cè)和數(shù)據(jù)采集三部分組成（圖1）。氣源為高純氮?dú)猓∟2，99.999%），用質(zhì)量流量控制器調(diào)節(jié)流速為500 mL·min－1，以滿足氮氧化物分析儀的進(jìn)氣要求。反應(yīng)部分包括兩個(gè)廣口瓶，一個(gè)裝有20 mL 50%的冰醋酸溶液和3 mL 0.05 mol·L－1抗壞血酸溶液（反應(yīng)瓶），另一個(gè)裝有20 mL 2 mol·L－1的NaOH溶液（除酸瓶），分別于瓶口涂上凡士林并用橡膠塞塞緊，在反應(yīng)瓶的膠塞上固定好長(zhǎng)型針頭用于進(jìn)樣。檢測(cè)和數(shù)據(jù)采集部分包括氮氧化物分析儀、電腦和自動(dòng)數(shù)據(jù)采集軟件，該軟件以1 Hz頻率將氮氧化物分析儀的NO濃度信號(hào)值記錄到電腦中。

由于大氣中常含有高濃度的NO，尤其是霧霾天氣時(shí)大氣本底的NO濃度能高達(dá)100 nmol·mol－1以上，裝置的氣密性直接關(guān)系到NO－2測(cè)定的準(zhǔn)確性，因此在試驗(yàn)前嚴(yán)格檢查裝置的氣密性，保證其在試驗(yàn)過(guò)程中不受外界NO的干擾。首先檢測(cè)反應(yīng)部分的氣密性，在兩個(gè)廣口瓶瓶口涂上凡士林，塞緊膠塞，堵住膠塞一端的管路，另一端通入0.2 MPa的N2，將廣口瓶浸入水中，觀察瓶口是否有氣泡產(chǎn)生，若沒(méi)有表明廣口瓶氣密性良好；然后檢測(cè)整個(gè)管路的氣密性，將肥皂水泡沫涂于管路連接處，通入0.2 MPa的N2觀察是否有氣泡產(chǎn)生，若沒(méi)有表明整個(gè)管路氣密性良好。

圖1 氣相轉(zhuǎn)化－化學(xué)發(fā)光法（NC法）測(cè)定NO2－的試驗(yàn)裝置圖Figure 1 The device of chemiluminescence method for determination of NO2－concentration

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 The basic physical and chemical properties of soils

（3）試驗(yàn)方法

將高純N2、裝有冰醋酸和抗壞血酸的反應(yīng)瓶及裝有NaOH的除酸瓶依次連接，打開(kāi)氣源使N2流經(jīng)反應(yīng)部分，約2 h后，連入氮氧化物分析儀，待反應(yīng)瓶背景NO濃度降低至5 nmol·mol-1以下并穩(wěn)定，于室溫條件（約25℃）下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)液中的NO-2濃度。

用注射器吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)工作液/待測(cè)液，通過(guò)長(zhǎng)型針頭加入到反應(yīng)瓶底部溶液中。反應(yīng)瓶中產(chǎn)生的NO隨N2進(jìn)入氮氧化物分析儀，NO濃度的信號(hào)值變化通過(guò)數(shù)據(jù)采集軟件實(shí)時(shí)采集并保存到電腦中。待NO濃度降低至5 nmol·mol-1以下并穩(wěn)定，可再次進(jìn)樣測(cè)定，每次進(jìn)樣前用待測(cè)液潤(rùn)洗長(zhǎng)型針頭。每個(gè)濃度的工作液重復(fù)測(cè)定3次，每測(cè)定約含500 ng NO2--N樣品更換一次反應(yīng)瓶。

測(cè)定結(jié)束后，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)液的NO濃度值的峰面積進(jìn)行積分，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)工作液NO2-濃度與其對(duì)應(yīng)峰面積的線性回歸方程（公式1），將待測(cè)樣品的峰面積帶入公式1可計(jì)算其N(xiāo)O2-的濃度。

式中：y為NO-2標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度，μg·L-1；x為NO-2標(biāo)準(zhǔn)工作液相應(yīng)的NO信號(hào)值峰面積；a、b為擬合參數(shù)。

1.3.2 比色法測(cè)定NO-2濃度[21]

（1）儀器與試劑

分光光度計(jì)（UNICO UV-2802，尤尼柯儀器有限公司，中國(guó)上海）

NaNO2標(biāo)準(zhǔn)貯備液1、2的配制方法同1.3.1。

NaNO2標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取0.5、2.5、5.0、7.5、10.0 mL的貯備液2于50 mL容量瓶中，用去離子水定容，獲得濃度為10、50、100、150、200 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

顯色劑：500 mL燒杯內(nèi)置入250 mL去離子水和50 mL磷酸（15 mol·L-1），加入20.0 g 4-氨基苯磺酰胺，再將1.00 g N-（1-萘基）-乙二胺二鹽酸鹽溶于上述溶液中，轉(zhuǎn)移至500 mL棕色容量瓶中，用去離子水稀釋至標(biāo)線，搖勻，置于4℃冰箱保存。

（2）試驗(yàn)方法

標(biāo)準(zhǔn)工作液測(cè)定：向50 mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液中加入1.0 mL顯色劑，密塞，搖勻，靜置。20 min后、2 h以內(nèi)，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

樣品測(cè)定：將選定體積的樣品移至50 mL比色管中，用水稀釋至刻度線，之后的操作同標(biāo)準(zhǔn)工作液的測(cè)定方法。

測(cè)定結(jié)束后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)工作液的NO2-濃度與相應(yīng)吸光度的線性回歸。樣品吸光度通過(guò)空白參比校正后，根據(jù)回歸方程計(jì)算NO2-濃度，計(jì)算方法同1.3.1。

（3）回收率的計(jì)算

大多研究者通過(guò)加入待測(cè)物的實(shí)測(cè)量除以加入量來(lái)計(jì)算方法回收率[24，32]。土壤待測(cè)液B與A中NO2-濃度差減的理論值應(yīng)該為浸提待測(cè)液B時(shí)所用的NaNO2濃度（50 μg·L-1），回收率（RB-A）如公式2所示。但土壤中加入的50 μg·L-1NO2-可能被微生物消耗而導(dǎo)致回收率降低。因此，本研究通過(guò)待測(cè)液C和B的差值與NO2-加入量的比值計(jì)算回收率（RC-B），如公式3所示。

式中：R為方法回收率，%；c（A）、c（B）和c（C）分別為待測(cè)液A、B和C中NO2-的濃度，μg·L-1；c（NaNO2）為加入的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，50 μg·L-1；VS為待測(cè)液體積，L；V為加入的50 μg·L-1NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，L。

1.4 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

采用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)的積分處理，采用SPSS 16.0的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行P＜0.05水平的顯著性檢驗(yàn)，采用Microsoft Office Excel 2010繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NC法冰醋酸濃度的選擇

Nagababu等[28]采用NC法測(cè)定血漿中NO2-濃度時(shí)，選擇7 mL純冰醋酸和1 mL 0.05 mol·L-1抗壞血酸作為反應(yīng)劑，且每測(cè)定4個(gè)3 μg·L-1左右的NO2-樣品（總含氮量1.2 ng NO2--N）更換一次反應(yīng)瓶?？紤]到土壤的NO2-濃度高于血漿，如曹娜等[33]觀測(cè)到厭氧條件下土壤中NO2-濃度可達(dá)200 μg·L-1，本研究將反應(yīng)瓶中的反應(yīng)劑體積增加2倍，改為20 mL 99.5%的冰醋酸與3 mL 0.05 mol·L-1的抗壞血酸混合，既保證對(duì)高濃度NO2-的分析能力，又不用頻繁更換反應(yīng)瓶。但是當(dāng)反應(yīng)罐中只裝有20 mL 99.5%冰醋酸，高純N2通過(guò)反應(yīng)罐進(jìn)入氮氧化物分析儀時(shí)，可觀測(cè)到很高的NO濃度背景，最高可達(dá)1000 nmol·mol－1，隨后NO濃度逐漸降低，待背景NO信號(hào)值降至5 nmol·mol－1且穩(wěn)定則至少需要5 h；在此期間若晃動(dòng)反應(yīng)瓶或加入抗壞血酸溶液均會(huì)導(dǎo)致NO信號(hào)值增大（至80 nmol·mol－1左右），待信號(hào)重新降至5 nmol·mol－1且穩(wěn)定又需要2 h的時(shí)間。這遠(yuǎn)高于Nagababu等[28]給出的測(cè)樣之前的穩(wěn)定時(shí)間（0.5～1 h），如此長(zhǎng)的穩(wěn)定時(shí)間可能是反應(yīng)劑體積增加造成的。

考慮到冰醋酸在NO－2的還原反應(yīng)中只起到提供酸性環(huán)境的作用，本研究將冰醋酸濃度稀釋至50%，在不改變抗壞血酸濃度的條件下與其混合，即采用20 mL 50%的冰醋酸和3 mL 0.05 mol·L－1抗壞血酸。結(jié)果顯示反應(yīng)瓶背景的NO濃度能夠在2 h內(nèi)降低至5 nmol·mol－1以下并穩(wěn)定，而且在50%的冰醋酸條件下重復(fù)測(cè)定10次50 μg·L－1NO－2的穩(wěn)定性很好（參見(jiàn)下節(jié)及圖2）。

2.2 NC法的精度、檢出限和檢測(cè)范圍

采用NC法重復(fù)測(cè)定10次50 μg·L－1NO－2標(biāo)準(zhǔn)工作液，其對(duì)應(yīng)的NO信號(hào)值峰雖然有降低的趨勢(shì)（圖2），但是峰面積穩(wěn)定，平均值為6 573.1±76.7（n=10），CV為1.2%，95%置信區(qū)間內(nèi)的精度為1.2 μg·L－1，即對(duì)于土壤樣品的檢測(cè)精度為6 μg·kg－1（按水土比5∶1計(jì)）。該結(jié)果表明，50%的冰醋酸提供的酸性環(huán)境可以滿足對(duì)50 μg·L－1NO－2的10次測(cè)定，且每測(cè)定500 ng NO－2－N需更換一次反應(yīng)瓶。

用濃度稀釋法在3倍背景濃度的信噪比時(shí)，測(cè)得NO2－的檢出限為2 μg·L－1，相當(dāng)于2 ng的NO2－－N（進(jìn)樣量為1 mL）。采用NC法測(cè)定NO2－標(biāo)準(zhǔn)工作液系列，濃度范圍為2～500 μg·L－1，其對(duì)應(yīng)的氮氧化物分析儀NO濃度信號(hào)變化如圖3a所示。每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液重復(fù)測(cè)定3次的CV值介于0.3%～5.2%之間，平均為2.5%。NO2－的濃度與NO濃度值峰面積顯著正相關(guān)（P＜0.001，圖3b）。

圖2 重復(fù)測(cè)定10次50 μg·L－1NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的NO濃度圖Figure 2 The chemiluminescence concentration of NO by ten times repeated measurement of 50 μg·L－1in NaNO2standard solution

圖3 NO2－標(biāo)準(zhǔn)工作液的NO濃度信號(hào)圖（a）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（b）Figure 3 Chemiluminescence NO concentration of nitrite standard solution（a）and standard curve（b）

2.3 NC法與比色法比較

土壤待測(cè)液B與A的NO－2濃度之差為37.1～50.1 μg·L－1，其回收率RB－A為79.0%～90.7%（比色法）和93.1%～106.6%（NC法）；土壤待測(cè)液B與C的NO－2濃度的差值為45.2～51.6 μg·L－1，比色法測(cè)定三種土壤NO－2濃度的回收率RC－B為92.7%～103.1%，NC法的回收率RC－B為90.3%～96.6%（表2）。

3 討論

3.1 冰醋酸濃度的選擇

依據(jù)Nagababu等[28]提供的測(cè)定血漿中NO－2濃度選用的反應(yīng)劑（7 mL純冰醋酸和1 mL 0.05 mol·L-1抗壞血酸），本研究選擇較大的反應(yīng)劑體積（增加2倍，以滿足對(duì)高濃度NO2-樣品的檢測(cè)）和較低的冰醋酸濃度（50%，以縮短反應(yīng)劑背景信號(hào)的穩(wěn)定時(shí)間），即反應(yīng)劑采用20 mL 50%的冰醋酸和3 mL 0.05 mol·L-1抗壞血酸混合。結(jié)果顯示反應(yīng)劑的背景NO信號(hào)值能夠在2 h內(nèi)穩(wěn)定，而且連續(xù)重復(fù)測(cè)定10次50 μg·L-1NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的NO信號(hào)峰面積穩(wěn)定（CV為1.2%），表明50%冰醋酸提供的酸性條件不影響該濃度NO2-的還原效率，并可滿足對(duì)500 ng N含量的NO2-測(cè)定。

圖4 兩種方法測(cè)定3種土壤的NO-2濃度Figure 4 The concentrations of NO-2measured by both methods of colorimetry and chemiluminescence

3.2 NC法的精度

本研究采用NC法，選擇50%冰醋酸提供酸性條件，以0.05 mol·L-1抗壞血酸作為還原劑，測(cè)定NO2-標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，檢測(cè)范圍為2～500 μg·L-1，檢出限為2 μg·L-1，即10 μg·kg-（1按水土比5∶1計(jì)），在95%置信區(qū)間內(nèi)的精度為1.2 μg·L-1。前人采用NC法主要用于測(cè)定水體和人體血漿中NO2-濃度（表3），如Cox[22]測(cè)定天然水體的NO2-濃度，精度為0.4 μg·L-1；王燕等[24]測(cè)定水體中NO2-濃度的精度為0.34 μg·L-1；Nagababu等[25]測(cè)定血漿中NO2-濃度的精度為0.16 μg·L-1。本研究中NC法的檢測(cè)精度為1.2 μg·L-1，高于前人采用NC法的測(cè)定結(jié)果。這可能是由于不同的研究者選擇的氮氧化物分析儀、酸性條件與還原劑不同造成的。

不同的氮氧化物分析儀其測(cè)樣頻率和載氣流速均不同。本研究采用熱電環(huán)境儀器公司出品的氮氧化物分析儀（型號(hào)42i），其對(duì)NO濃度的檢測(cè)頻率最高為1s一個(gè)數(shù)據(jù)，即1Hz，遠(yuǎn)低于Nagababu等[28]采用一氧化氮分析儀（Sievers280i，通用電氣分析儀器公司，美國(guó)）的采樣頻率4 Hz。兩臺(tái)儀器的檢測(cè)限相近（1 nmol·mol-1左右），而高的采樣頻率會(huì)提高NO2-的檢測(cè)精度。本研究所用的載氣流速為500 mL·min-1，以滿足熱電環(huán)境儀器公司出品的氮氧化物分析儀的使用要求，但該載氣流速高于之前研究采用的流速101～300 mL·min-（1表3）。Bateman等[34]的研究表明，流速在42～126 mL·min－1范圍時(shí)，加大流經(jīng)反應(yīng)瓶的載氣流速，會(huì)促進(jìn)反應(yīng)瓶中的NO由液態(tài)向氣態(tài)轉(zhuǎn)化，從而加快NO氣體與液體的分離速度，同時(shí)會(huì)減少NO在氮氧化物分析儀中與O3的反應(yīng)時(shí)間，導(dǎo)致NO濃度信號(hào)值降低，但能提高方法精度；而王燕等[24]觀測(cè)到隨著載氣流速的增加（150～750 mL·min－1），反應(yīng)的信號(hào)值先增大后降低，當(dāng)流速為480 mL·min－1時(shí)信號(hào)值最大。如果信號(hào)值高導(dǎo)致精度欠佳，則本研究采用大的載氣流速可能是導(dǎo)致精度低的一個(gè)原因。但是對(duì)于本試驗(yàn)，降低載氣流速是否能提高方法的精度，還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 兩種方法測(cè)定3種土壤NO2-濃度的回收率Table 2 The recovery rate of NO2-in three soils measured by both methods of colorimetry and chemiluminescence

此外，不同的研究者采用NC法測(cè)定NO－2濃度時(shí)選用不同物質(zhì)作為還原劑和酸性環(huán)境，如Amini等[27]選擇碘（I－）和硫酸，王燕等[24]選擇礬（V3+）和鹽酸。本研究之所以選擇抗壞血酸作為還原劑，主要是因?yàn)槠湎鄬?duì)于碘和礬來(lái)說(shuō)，能更好地避免硝酸鹽、亞硝胺、亞硝基硫醇等物質(zhì)的干擾[25]，而這些物質(zhì)在土壤中也普遍存在。至于不同還原劑和酸性條件是否會(huì)影響方法的檢測(cè)精度仍需進(jìn)一步研究。

3.3 NC法與比色法比較

采用NC法測(cè)定三種不同酸堿度（pH 5.4～8.7）土壤中NO－2濃度的回收率結(jié)果較好，為90%～97%。本研究NC法測(cè)定土壤NO－2濃度的檢出限和精度均優(yōu)于比色法。對(duì)于酸性土壤（HN和HB）的NO－2，采用NC法與比色法的測(cè)定結(jié)果沒(méi)有顯著差異，但對(duì)于堿性土壤（SX）來(lái)說(shuō)，NC法的測(cè)定結(jié)果較比色法顯著提高11%～24%。這可能是由土壤性質(zhì)的差異導(dǎo)致的。HN土壤的有機(jī)質(zhì)和總氮含量明顯高于HB土壤，但兩方法測(cè)定HN和HB土壤的NO－2濃度結(jié)果無(wú)顯著差異，表明有機(jī)質(zhì)和總氮可能不是造成差異的原因。兩方法測(cè)定結(jié)果差異顯著的SX土壤，pH值為8.7，高于HN和HB土壤（5.4和6.2），屬于堿性土壤。Amini等[27]采用NC法測(cè)定土壤浸提液中的NO2－濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)，樣品中Ca2+、SO24－和CO23－會(huì)對(duì)NO2－的測(cè)定產(chǎn)生一定的干擾，而堿性土壤中上述離子的含量一般較多。這可能是導(dǎo)致NC法測(cè)定SX土壤NO2－濃度較比色法偏高的一個(gè)原因。但由于本試驗(yàn)所用的土壤種類(lèi)較少，土壤酸堿性對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響有待后續(xù)增加樣本數(shù)量來(lái)驗(yàn)證。

3.4 NC法的優(yōu)缺點(diǎn)

NC法對(duì)于土壤中NO2－濃度的測(cè)定有以下三方面優(yōu)點(diǎn)：

（1）樣品用量少。本試驗(yàn)中，考慮到土壤浸提液中NO2－濃度范圍和操作方便等問(wèn)題，采用進(jìn)樣量為1 mL；若待測(cè)液的NO2－濃度較大時(shí)，還可適當(dāng)減少進(jìn)樣量。

（2）不受浸提液中懸浮物質(zhì)或顏色的影響。而采用比色法測(cè)定NO2－濃度時(shí)，需對(duì)有懸浮物或有顏色的待測(cè)液進(jìn)行前處理，過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

（3）所需試劑容易配制，尤其針對(duì)比色法某些試劑含有毒性而言，操作簡(jiǎn)單安全。

但NC法較比色法也存在著不足：

（1）樣品分析效率較低。本研究中NC法測(cè)定NO2－樣品的時(shí)間為8～15 min·個(gè)－1，隨著樣品中NO2－濃度的增加，分析時(shí)間也相應(yīng)增加，對(duì)于批量樣品測(cè)定效率并不高。如對(duì)于40個(gè)NO2－樣品（＜100 μg·L－1）的測(cè)定，采用比色法僅需1 h，而采用NC法至少需要6 h。

（2）系統(tǒng)穩(wěn)定時(shí)間較長(zhǎng)。比色法的顯色僅需20 min，而NC法中待反應(yīng)瓶背景NO信號(hào)值降低至5 nmol·mol－1以下并穩(wěn)定至少需要2 h。

（3）對(duì)裝置氣密性要求很高，否則外界環(huán)境中NO的濃度會(huì)對(duì)測(cè)定造成影響，而比色法則不受環(huán)境中NO濃度的影響。

（4）儀器維護(hù)成本較高。NC法中使用的氮氧化物分析儀需定期進(jìn)行標(biāo)定（需要標(biāo)定系統(tǒng)及標(biāo)準(zhǔn)氣體等）及維護(hù)（更換顆粒過(guò)濾器及清洗儀器管路等），其成本明顯高于比色法中分光光度計(jì)的維護(hù)成本。

表3 不同研究者采用NC法測(cè)定NO2－濃度的條件、范圍和精度Table 3 The condition，detection range,detection limit and precision for NO2－concentration with chemiluminescence method by different studies

4 結(jié)論

本研究采用氣相轉(zhuǎn)化-化學(xué)發(fā)光法，選擇50%冰醋酸提供酸性條件，以0.05 mol·L-1抗壞血酸作為還原劑，測(cè)定土壤中的NO2-含量。該方法檢測(cè)范圍為2～500 μg·L-1，平均變異系數(shù)為2.5%，在95%置信區(qū)間內(nèi)測(cè)定精度為6 μg·kg-（1水土比為5∶1），方法回收率為90%～97%。該方法測(cè)定酸性土壤NO2-含量與國(guó)標(biāo)比色法無(wú)顯著差異，但可能會(huì)高估堿性土壤的NO2-含量。氣相化學(xué)發(fā)光法不受浸提液中懸浮物質(zhì)或有色物質(zhì)的影響，所用試劑無(wú)毒性，但分析時(shí)間隨著NO2-濃度的增加而增長(zhǎng)（8～15 min），限制了該方法的分析效率。后續(xù)研究可考慮通過(guò)增加不同類(lèi)型土壤樣本、更換不同的還原劑或降低反應(yīng)流速，進(jìn)一步評(píng)估該方法的適用性，并提高方法的精度和分析效率。

致謝：對(duì)本研究提供技術(shù)支持和幫助的有中國(guó)科學(xué)院大氣物理研究所的付永鋒、張寒、馬磊和李來(lái)港等，謹(jǐn)致謝忱。

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A gas phase conversion-chemiluminescence method for detecting nitrite concentrations in soils

WANG Lin1,2,WANG Rui2*,ZHENG Xun－h(huán)ua2,3,ZHANG Li－juan1
（1.College of Resources and Environmental Sciences,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China;2.State Key Laboratory of Atmospheric Boundary Layer Physics and Atmospheric Chemistry,Institute of Atmospheric Physics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100029,China;3.College of Earth Sciences,University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 200049,China）

A chemiluminescence method that detects nitric oxide（NO）combined with the conversion from nitrite to NO for measuring soil nitrite concentrations is reported.The applicability of the method is evaluated by comparing it with the colorimetry method.The chemiluminescence method involves a reaction system consisting of 50%glacial acetic acid and ascorbic acid in the purge vessel.At room temperature,samples containing nitrite were injected into the purge vessel and nitrite was stoichiometrically reduced to NO by ascorbic acid under these acidic conditions.The produced NO was swept with pure nitrogen gas into the NO analyzer and the data was recorded while chemiluminescence signals were generated.The concentration of nitrite in the samples was calculated by the curve between the peak areas of the NO signals and the corresponding standard nitrite concentrations.The results showed that peak areas of chemiluminescence signals were linearly positively correlated with the nitrite concentrations in the range of 2 to 500 μg·L－1（P＜0.01）.The lowest detection limit of this method was 2μg·L-1,equivalent to10 μg·kg-1in soil（water∶soil=5∶1）,lower than that of the colorimetry method（15 μg·kg-1）.This method had a good precision of 1.2 μg·L-1within 95%confidence interval by repeating the measurements of standard nitrite concentration of 50 μg·L-1for ten times.The corresponding precision for soil nitrite concentration（6 μg·kg-1）was also better than that of colorimetry（11 μg·kg-1）.The recovery rates were in the range of 90%～97%.Compared to the colorimetry,the chemiluminescence method had the same accuracy for detecting nitrite concentrations in acid soils,but it overestimated the concentrations in alkaline soil because of the existence of Ca2+,SO2-4,and CO2-3in alkaline soil.Moreover,the analysis times for each soil nitrite sample were approximately 8～15 min,which is time-consuming comparing to the colorimetry method.

nitrite;chemiluminescence;soil;nitric oxide

S153.6

A

1672－2043（2017）09－1916－09

10.11654/jaes.2017－0238

王 琳，王 睿，鄭循華,等.氣相轉(zhuǎn)化－化學(xué)發(fā)光法測(cè)定土壤中的亞硝態(tài)氮[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（9）：1916－1924.

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2017－02－28

王 琳（1992—），女，河北保定人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橥寥拉h(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)與監(jiān)測(cè)。E－mail：wanglin26@mail.iap.ac.cn

*通信作者：王 睿E－mail：wangrui@mail.iap.ac.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41303060，41675144）；大氣邊界層物理與大氣化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（41303060，41675144）；State Key Laboratory of Atmospheric Boundary Layer Physics and Atmospheric Chemistry