王俊美, 徐 飛, 宋玉立, 李亞紅, 劉露露, 韓自行

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450002)

小麥誘導(dǎo)抗性基因TaWIR1b的克隆及表達(dá)分析

王俊美, 徐 飛, 宋玉立*, 李亞紅, 劉露露, 韓自行

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450002)

全蝕病是小麥上一種重要的土傳病害。選育和種植抗病品種是防治小麥全蝕病的根本途徑,抗病基因研究是抗病育種的基礎(chǔ)性工作。根據(jù)基因TaWIR1b(Accession no.M94959.1)的全長序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增‘新農(nóng)19’的cDNA,獲得了完整ORF,編碼85個(gè)氨基酸殘基,比對后發(fā)現(xiàn)與TaWIR1b序列同源性達(dá)100%。根據(jù)獲得的TaWIR1b基因全長序列設(shè)計(jì)定量引物,分析TaWIR1b在全蝕菌脅迫條件下不同互作模式的表達(dá)特征。結(jié)果表明接種全蝕病菌后抗病小麥品種‘新農(nóng)19’中TaWIR1b基因被誘導(dǎo)表達(dá),接菌后3 d達(dá)到峰值143.97,感病品種‘新麥19’中峰值出現(xiàn)在接菌后8 d,表達(dá)量僅為對照的4.22倍,提示該基因可能參與小麥對全蝕病的抗病過程。

小麥全蝕病;TaWIR1b; 基因克隆; 基因表達(dá)分析

小麥全蝕病是由禾頂囊殼小麥變種Gaeumannomycesgraminisvar.tritici引起的小麥上一種重要根部病害,在世界各小麥種植區(qū)廣泛分布。其發(fā)生危害重、傳播速度快,一旦發(fā)生難以根除,一般引起小麥減產(chǎn)10%～20%,重病田減產(chǎn)近半甚至絕收。選育和種植抗病品種是解決小麥全蝕病危害的根本途徑,而抗病基因研究是抗病育種的基礎(chǔ)性工作。

WIR1(wheat induced resistance 1)基因首次報(bào)道是在小麥與大麥白粉菌的非親和互作中被誘導(dǎo)表達(dá),引起抗性反應(yīng)[1]。目前小麥中已有3個(gè)WIR1基因被克隆鑒定,分別是TaWIR1a、TaWIR1b和TaWIR1c,其中TaWIR1a和TaWIR1b聚在同一分支,與TaWIR1c的同源性較低。對WIR1基因編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)分析表明WIR1蛋白N末端具有疏水殘基,這種結(jié)構(gòu)特征降低了剪接的可能性,增加了膜結(jié)合的可能性。TaWIR1a蛋白具有親水的C末端,其可能功能是在病原物攻擊的過程中增強(qiáng)細(xì)胞膜與細(xì)胞壁的黏附從而增強(qiáng)細(xì)胞的穩(wěn)定性[2]。而TaWIR1b和TaWIR1c蛋白包含有信號肽,與分泌有關(guān),可能涉及細(xì)胞壁加固和增強(qiáng)物理屏障從而限制病原菌定殖。

實(shí)驗(yàn)室前期抗性鑒定結(jié)果中小麥品種‘新農(nóng)19’對小麥全蝕病菌GaNS-90菌株表現(xiàn)中抗[3],可用于研究小麥對全蝕菌的抗性機(jī)制。本研究根據(jù)已有TaWIR1b基因的序列合成引物擴(kuò)增‘新農(nóng)19’的cDNA獲得了基因的全長序列。同時(shí)根據(jù)獲得基因的序列合成定量引物,分析了接種小麥全蝕病菌GaNS-90后TaWIR1b在‘新農(nóng)19’和感病品種‘新麥19’中的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用河南省區(qū)試小麥品種‘新農(nóng)19’(Xinnong19)、‘新麥19’(Xinmai19)及小麥全蝕病菌菌株GaNS-90均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護(hù)研究所小麥病害課題組收集、保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備與取樣

挑取均勻飽滿的小麥種子,用75%乙醇表面消毒30 s,清水洗凈后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中浸種24 h,然后種植于營養(yǎng)缽中溫室(20℃)培養(yǎng),每天光照16 h。至長出4葉后將整株苗連根拔出沖洗干凈,置于放有濕潤衛(wèi)生紙的托盤內(nèi),用打孔器打取全蝕菌菌餅并放置于根部,保鮮膜封住托盤。將托盤置于培養(yǎng)箱中,采集接菌后0、2、3和8 d以及同期不接菌對照的小麥根,用錫箔紙包好液氮速凍,存放于-80℃冰箱備用。

1.2.2 總RNA提取及第一鏈cDNA合成

采用 TRIzol法(參考TaKaRa說明書)提取小麥根的RNA,加入DNase純化RNA。用Eppendorf Biospectrometer分光光度計(jì)檢測樣品的濃度和純度。用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA第一鏈。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 目的基因獲得及序列分析

根據(jù)目的基因TaWIR1b(Accession no. M94959.1)的ORF框兩端序列設(shè)計(jì)引物對:WIR1F:CTCGAAACACACCAGCAT;WIR1R:GGTGCGTGACAGTAGATTAAC。以‘新農(nóng)19’的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增體系如下:10×Taqbuffer 2 μL,dNTPs(10 mmol/L)0.4 μL,上游引物(10 μmol/L)0.2 μL,下游引物(10 μmol/L)0.2 μL,cDNA 1 μL,TaqDNA聚合酶0.2 μL,ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 3 min;94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,UVP凝膠成像系統(tǒng)照相。電泳后回收目標(biāo)片段,連接入pMD19-T simple載體,轉(zhuǎn)化TJ1感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒,送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。

利用NCBI(http:∥ncbi.nlm.nih.gov/)中的ORF Finder(http:∥www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.html)工具查找目的片段的開放閱讀框。通過BLAST對克隆的目的片段進(jìn)行同源性分析。

1.2.4 內(nèi)參及目的基因定量引物設(shè)計(jì)及檢測

以組成型表達(dá)基因,小麥的26S rRNA(Accession no.Z11889.1)作為內(nèi)參對照,引物序列[4]:26S-F: GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC;26S-R:TCTCC-CTTTAACACCAACGG。根據(jù)克隆得到的基因序列,利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)定量PCR引物,序列如下:WIR1M-F:TGCCGCACAGTTTATGGATG;WI-R1M-R:TAAGGTGGTGCGTGACAGTAGA。

先通過普通 PCR 擴(kuò)增判斷引物的特異性,產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。選擇最佳退火溫度,確保沒有引物二聚體產(chǎn)生后按該退火溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。通過梯度稀釋模板的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測引物的擴(kuò)增效率,根據(jù)熔解曲線判斷引物的特異性。

1.2.5 熒光定量PCR檢測與分析

應(yīng)用 ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀,以各個(gè)取樣點(diǎn)的cDNA 為模板,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:2×SYBR PremixExTaq10 μL,50×ROX Ⅱ0.4 μL,WIRIM-F(10 μmol/L)0.8 μL,WIRIM-R(10 μmol/L)0.8 μL,cDNA第一鏈2 μL(10×稀釋的 RNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物),ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 1 min;95℃ 10 s,60℃ 20 s,72℃ 40 s,40個(gè)循環(huán)。于 72℃收集熒光信號,反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熒光值變化曲線和熔解曲線分析。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次,Ct值取平均值。以各取樣時(shí)間點(diǎn)小麥 26S rRNA 的量為內(nèi)參對照來確定目標(biāo)基因的相對量,利用2-△△Ct方法[5]來確定目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因獲得

提取所有試驗(yàn)材料的總RNA。用Eppendorf Biospectrometer檢測,所提取的總RNA OD260/OD280值為2.0左右,表明RNA質(zhì)量較好,OD260/OD230值大于2.0,表明RNA純度較高,無小分子鹽類污染。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總 RNA,沒有降解現(xiàn)象,可用于下一步試驗(yàn)。根據(jù)試劑盒說明,利用TaKaRa First Strand cDNA synthesis進(jìn)行cDNA第一鏈合成。

利用擴(kuò)增基因全長的引物擴(kuò)增‘新農(nóng)19’的cDNA,獲得了370 bp左右的特異片段,將該片段回收、克隆轉(zhuǎn)化后送公司測序。測序結(jié)果表明片段長度為373 bp,其序列與已報(bào)道的TaWIR1b基因序列完全相同。利用 NCBI 中 ORF finder工具在克隆片段中找到長258 bp完整開放閱讀框,該ORF編碼86個(gè)氨基酸殘基(圖1)。與已知基因TaWIR1b編碼的氨基酸序列100%一致。獲得的ORF框N末端具有豐富的甘氨酸(glycine G)和脯氨酸(proline P)重復(fù),是TaWIR1b的功能區(qū)域。

圖1 基因TaWIR1b 的序列Fig.1 The sequence of TaWIR1b

2.2 定量表達(dá)分析

以小麥核糖體26S rRNA基因作為內(nèi)參對照,采用相對定量的方法分析全蝕菌侵染脅迫條件下基因TaWIR1b在不同互作條件下的表達(dá)模式。結(jié)果表明:小麥品種‘新農(nóng)19’中基因TaWIR1b受到病原菌侵染后誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),且在接種后第3天達(dá)到高峰值,比對照高出143.97倍;而感病品種‘新麥19’中基因的表達(dá)高峰出現(xiàn)在接菌后第8天,且僅為對照的4.22倍,各時(shí)期基因的表達(dá)量均顯著低于‘新農(nóng)19’(圖2)。

圖2 接種全蝕病菌后TaWIR1b基因的表達(dá)模式Fig.2 Expression pattern of the gene TaWIR1b after inoculation with Gaeumannomyces graminis var. tritici

3 討論

小麥WIR基因早在1989年被克隆,目前有TaWIR1a、TaWIR1b和TaWIR1c3個(gè)基因被克隆。已有結(jié)果表明,該類基因受到多種病原物的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。其中TaWIR1a同源基因在大麥與大麥葉銹菌和小麥葉銹菌互作及大麥對大麥白粉菌的基礎(chǔ)防御和小種?；涂剐灾芯梢员徽T導(dǎo)表達(dá)[6-7];WIR1在小麥中參與對小麥葉銹菌的非小種?；涂剐院突A(chǔ)防御過程[8]。Coram等的研究結(jié)果表明TaWIR1a基因參與小麥對條銹菌的小種?；涂剐赃^程[9]。Diethelm等比較了小麥抗、感品種中TaWIR1b基因的表達(dá)情況,認(rèn)為該基因在小麥對赤霉病的抗性中發(fā)揮作用,將該基因定位在小麥5DS染色體上,并將其列為抗病基因的候選基因[10]。

本研究結(jié)果表明,該類基因受到全蝕病菌的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá),在抗病品種‘新農(nóng)19’中的表達(dá)量顯著高于感病品種‘新麥19’,峰值出現(xiàn)得也較早,提示該基因可能參與‘新農(nóng)19’對全蝕病菌的抗病過程。目前對于TaWIR1的功能沒有定論。利用大麥條紋花葉病毒(BSMV)介導(dǎo)的基因沉默(virus inducing gene silencing, VIGS)系統(tǒng)分析TaWIR1基因的功能時(shí)發(fā)現(xiàn),雖然在病菌誘導(dǎo)后該基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),但并未發(fā)現(xiàn)對小麥白粉菌的定殖有影響[1-2]。同時(shí)在小麥中過表達(dá)TaWIR1a對于白粉菌吸器的形成不產(chǎn)生影響[11]。沉默試驗(yàn)小麥材料‘Renan’中全部TaWIR1基因?qū)τ谛←湴追劬陌l(fā)育沒有顯著影響[12]。Diethelm等則認(rèn)為該基因?qū)铙w營養(yǎng)型病原物和死體營養(yǎng)型病原物的作用是截然相反的,其在植物與死體營養(yǎng)型的病原菌互作時(shí)參與抗病過程[10]。小麥全蝕菌屬于死體營養(yǎng)型病原物,其啟動(dòng)的小麥抗性和防御反應(yīng)很可能與同是死體營養(yǎng)型的小麥赤霉菌模式相同,下一步需要深入開展TaWIR1b基因在‘新農(nóng)19’與全蝕菌互作中的功能研究,為闡明基因的作用機(jī)理及進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 楊明麗)

CloningofthewheatinducedresistancegeneTaWIR1bandexpressionanalysis

Wang Junmei, Xu Fei, Song Yuli, Li Yahong, Liu Lulu, Han Zihang

(InstituteofPlantProtection,HenanAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonCropsinSouthernPartofNorthChina,MinistryofAgriculture,Zhengzhou450002,China)

Take-all disease,caused byGaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt), is one of the important soil-borne diseases of wheat. It is the fundamental way to breed and plant resistant varieties for preventing the disease,and research on resistance genes is the foundation for resistance breeding. In this study,a complete ORF (open reading frame),with 100% homology withTaWIR1bfrom GenBank,was obtained by amplifying cDNA of ‘Xinnong19’ using primers designed based onTaWIR1bsequence (Accession no.M94959.1). Primers were synthesized for analyzing the transcription patterns of the gene by quantitative PCR in different wheat-pathogen interaction patterns induced byGgt. The results indicated thatTaWIR1bwas induced byGgtup-regulation expression in resistant cultivar ‘Xinnong19’,with a peak value of 143.97 three days post inoculation, but the peak value was 4.22 at 8 d post inoculation in susceptible cultivar ‘Xinmai19’. It indicates that the geneTaWIR1bmight be involved in the course of resistant response to take-all disease.

wheat take-all disease;TaWIR1bgene; gene cloning; gene expression analysis

S 512.1

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.025

2016-10-31

： 2016-12-19

河南省小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(S2010-01-05);河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(142300413221);河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金

* 通信作者 E-mail:songyuli2000@126.com