朱 清 姚蓓蓓 吳明華

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

蒲參膠囊對(duì)大鼠腦缺血再灌注后血清bFGF和BDNF蛋白表達(dá)的影響

朱 清 姚蓓蓓 吳明華△

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

目的 觀察蒲參膠囊對(duì)大鼠腦缺血/再灌注后血清bFGF和BDNF蛋白表達(dá)的影響，探討蒲參膠囊促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)損傷恢復(fù)的可能作用機(jī)制。方法 將健康SD大鼠隨機(jī)分成蒲參膠囊低、中、高劑量組，假手術(shù)和模型組。通過(guò)線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）腦缺血再灌注模型，術(shù)后高劑量組（250 mg/200 g）、中劑量組（125 mg/200 g）、低劑量組（62.5 mg/200 g）每日予灌胃給藥1次，假手術(shù)、模型組給予生理鹽水灌胃。術(shù)后第1天、7天、14天分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，并分離血清，用酶聯(lián)免疫吸附劑（ELISA）測(cè)定血清中bFGF和BDNF的水平。結(jié)果 與模型組相比，蒲參膠囊中劑量組第7天可明顯提高外周血bFGF和BDNF的蛋白水平。結(jié)論 蒲參膠囊在一定程度上可提高大鼠腦缺血/再灌注后血清bFGF和BDNF的表達(dá)水平，改善神經(jīng)再生微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)。

蒲參膠囊 腦缺血/再灌注 bFGF BDNF

缺血性腦血管病目前已成為成人致殘的主要原因之一。雖然再灌注有益于減少缺血性損傷及恢復(fù)一些可逆性損害，但最近的研究發(fā)現(xiàn)，再灌注在某些情況下可能會(huì)進(jìn)一步加重?fù)p傷和功能障礙，缺血/再灌注導(dǎo)致大量的神經(jīng)元壞死，造成難以逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷［1］。因此尋找有效的方法保護(hù)受損神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)再生及神經(jīng)損傷的修復(fù)至關(guān)重要。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是由神經(jīng)支配的組織或者膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生、分泌的一類蛋白質(zhì)，通過(guò)支持神經(jīng)元的存活，促進(jìn)它們的生長(zhǎng)及分化，刺激軸突生長(zhǎng)，促進(jìn)神經(jīng)再生，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)功能、修復(fù)大腦損傷的作用。堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）是兩種重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備大鼠腦缺血/再灌注模型，給予蒲參膠囊中藥粉劑干預(yù)，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附劑檢測(cè)大鼠血清中bFGF和BDNF蛋白的水平，探討蒲參膠囊對(duì)促進(jìn)腦缺血/再灌注后的神經(jīng)損傷修復(fù)的作用及其相關(guān)機(jī)制。為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 蒲參膠囊粉劑，由蘇中藥業(yè)提供，藥物組成：何首烏、蒲黃、丹參、川芎、赤芍、山楂、澤瀉、黨參。實(shí)驗(yàn)前用0.9%氯化鈉注射液溶解。ELISA試劑盒品牌，購(gòu)自金益柏公司；ELx800光吸收酶標(biāo)儀、ELx50微孔板全自動(dòng)洗板機(jī)，購(gòu)自BIOTEK公司；5424R冷凍離心機(jī)，購(gòu)自Eppendorf公司；隔水室恒溫培養(yǎng)箱（國(guó)產(chǎn)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，體質(zhì)量250～280 g，SPF級(jí)，共96只。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001；動(dòng)物合格證號(hào)11400700173737。

1.3 分組與造模 1）分組：大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組、模型組、蒲參高劑量組、蒲參中劑量組、蒲參低劑量組，每組19只。2）模型制備：動(dòng)物飼養(yǎng)至體質(zhì)量250～280 g，采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）腦缺血再灌注模型。動(dòng)物用7%水合三氯乙醛（6 mL/kg）麻醉，于頸部正中切開(kāi)，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈，循頸內(nèi)動(dòng)脈向前，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈。夾閉頸總動(dòng)脈近心端，從頸外動(dòng)脈的結(jié)扎線的遠(yuǎn)端作一切口，插入外徑為0.285 mm的尼龍線，進(jìn)過(guò)頸總動(dòng)脈分叉進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，然后徐徐插入至有輕微阻力為止（自分叉處約20 mm），阻斷大腦中動(dòng)脈的所有血供，右側(cè)腦缺血2 h后，輕輕拔出尼龍線，恢復(fù)血供進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組分離、暴露血管后縫合。3）模型納入標(biāo)準(zhǔn)：大鼠完全清醒后，出現(xiàn)右側(cè)虹膜顏色變淺，瞳孔縮小，左側(cè)偏癱（左上肢明顯），大鼠自主運(yùn)動(dòng)時(shí)，出現(xiàn)左轉(zhuǎn)圈，提尾懸空時(shí)，左前肢屈曲、內(nèi)收為模型成功。如未出現(xiàn)上訴癥狀，予以排除。神經(jīng)功能損傷評(píng)價(jià)參考改良Bederson 5分制法［2］。0分：提尾懸空時(shí)，動(dòng)物的兩前肢均伸向地板方向，且無(wú)其他行為缺陷；1分：提尾懸空時(shí)，動(dòng)物的手術(shù)對(duì)（左）側(cè)前肢表現(xiàn)為腕肘屈曲、肩內(nèi)旋、肘外展、緊貼胸壁；2分：將動(dòng)物置于光滑平板上，推手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動(dòng)時(shí)阻力降低；3分：動(dòng)物自由行走時(shí)，向手術(shù)對(duì)側(cè)環(huán)行或轉(zhuǎn)圈；4分：肢體軟癱，肢體無(wú)自發(fā)活動(dòng)。0分及4分者予以排除。

1.4 給藥方法 造模成功后，所有大鼠均接受每天1次灌胃給藥。蒲參膠囊成人用量為1 g，每日3次，參考動(dòng)物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)表［3］，得出蒲參低劑量組的給藥劑量為62.5 mg/200g，中劑量組為125 mg/200 g，高劑量組為250 mg/200 g。于再灌注后，待動(dòng)物清醒后灌胃給藥1次，其后每日給藥1次，假手術(shù)對(duì)照組、模型空白對(duì)照組給按5 mL/kg灌胃0.9%氯化鈉溶液。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 第1天、第7天、第14天對(duì)各組大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，并分離血清，低溫保存。ELISA采用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）水平。具體操作步驟按照bFGF和BDNF的ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以s）表示，用秩和檢驗(yàn)對(duì)進(jìn)行組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后進(jìn)行兩兩比較，根據(jù)重復(fù)檢驗(yàn)的次數(shù)重新規(guī)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組bFGF水平比較 見(jiàn)表1。治療1 d，與模型組相比，假手術(shù)組bFGF水平明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。治療7 d，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低、中、高、假手術(shù)分別與模型組比較，確定兩兩對(duì)比的檢驗(yàn)水準(zhǔn)，α＇=0.0125，即P<0.0125差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：與模型組對(duì)比，低劑量組bFGF水平升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.0125）；中劑量組bFGF水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.0125）；高劑量組bFGF水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0125）；假手術(shù)組bFGF水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0125）。治療14 d，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05），不再進(jìn)行兩兩比較。

表1 各組不同時(shí)期bFGF水平比較s）

表1 各組不同時(shí)期bFGF水平比較s）

1 d 7 d- 11.35±1.21- 12.02±0.56- 10.56±0.54假手術(shù)組14 d蒲參低劑量組 11.19±0.42蒲參中劑量組 11.48±1.00蒲參高劑量組 11.51±0.46組 別12.55±1.01 11.97±0.61模型組 10.50±1.91 11.30±0.20 11.81±0.79 12.07±0.96

2.2 各組BDNF水平比較 見(jiàn)表2。治療第1天，與模型組對(duì)比，假手術(shù)組BDNF水平升高，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療第7天，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），再進(jìn)行兩兩比較，蒲參低、中、高劑量組及假手術(shù)組分別與模型組比較，確定兩兩對(duì)比的檢驗(yàn)水準(zhǔn)，α′=0.0125，即P<0.0125差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：與模型組對(duì)比，蒲參低劑量組BDNF水平升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.0125）；蒲參中劑量組BDNF水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0125）；蒲參高劑量組BDNF水平降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.0125）；假手術(shù)組BDNF水平升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.0125）。治療第14天，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），再進(jìn)行兩兩比較，蒲參低、中、高劑量組及假手術(shù)分別與模型組比較，確定兩兩對(duì)比的檢驗(yàn)水準(zhǔn)，α′=0.0125，即P<0.0125差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：與模型組對(duì)比，蒲參低、高劑量組、假手術(shù)組BDNF水平降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.0125）；蒲參中劑量組BDNF水平升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.0125）。

表2 各組不同時(shí)期BDNF水平比較）

表2 各組不同時(shí)期BDNF水平比較）

1 d 7 d- 6 0.8 7±7.5 4- 6 2.0 9±1.5 2- 5 2.1 4±5.4 8假手術(shù)組1 4 d蒲參低劑量組 6 0.9 4±3.8 5蒲參中劑量組 6 6.3 4±3.0 3蒲參高劑量組 6 1.3 5±3.2 1組 別6 1.7 9±7.4 6 5 7.9 9±2.3 6模型組 5 6.6 9±1 0.2 6 5 2.9 9±4.6 0 6 2.3 1±8.5 5 5 7.6 5±2.9 8

3 討 論

缺血性腦血管病屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇，中風(fēng)的發(fā)生常由“風(fēng)、火、痰、氣、虛”引起，而與血瘀關(guān)系尤為密切，于瀟等［4-5］認(rèn)為血瘀是中風(fēng)發(fā)病的關(guān)鍵，貫穿中風(fēng)病始終，且?jiàn)A瘀夾虛者居多。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證實(shí)［6］，缺血性中風(fēng)的發(fā)病，血液流變學(xué)檢查一般表現(xiàn)為血液黏稠度增高、血液流動(dòng)緩慢、血液動(dòng)力學(xué)障礙等特點(diǎn)，與血瘀特征相似。因此血瘀是導(dǎo)致中風(fēng)的重要因素，活血祛瘀法是中風(fēng)病的治療大法。蒲參膠囊為臨床用于治療高脂血癥的血瘀證，具有活血祛瘀，滋陰化濁的功效，根據(jù)中醫(yī)的“異病同治”觀點(diǎn)，蒲參膠囊的作用特點(diǎn)也可用于治療中風(fēng)的血瘀證，蒲參膠囊由何首烏、蒲黃、丹參、川芎、赤芍、山楂、澤瀉、黨參組成。何首烏補(bǔ)肝腎、益精血，蒲黃化瘀行血通經(jīng)，丹參、川芎、赤芍、山楂均有活血祛瘀之功，澤瀉利水滲濕，可瀉水濕，行痰飲，黨參補(bǔ)氣補(bǔ)血生津，諸藥合用，可行活血祛瘀，滋陰化濁之功，痰濁、瘀血祛，則血脈通暢，氣機(jī)條達(dá)，滋補(bǔ)陰液，則新血得以化生，舊血祛，新血生，血脈暢，腦絡(luò)得以濡養(yǎng)，則可促進(jìn)組織損傷的恢復(fù)。

bFGF屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）家族中的一員，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，在生理狀態(tài)下，bFGF很難通過(guò)血腦屏障，但腦缺血缺氧造成局部血腦屏障損傷后，通透性增加，它可通過(guò)病變組織進(jìn)入到外周血中［7］。bFGF不僅直接營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元，還可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化從而促進(jìn)受損神經(jīng)組織的恢復(fù)。bFGF可與細(xì)胞膜表面的相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可能的作用機(jī)制涉及促進(jìn)血管生成、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、減少興奮性氨基酸毒、維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)定性和抗氧自由基的損害［8-10］。

BDNF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，其中以海馬和皮層組織中含量最高。BDNF不僅在中樞系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)神經(jīng)元的生存、分化、發(fā)育和維持其正常功能表達(dá)上起關(guān)鍵作用，還可促進(jìn)神經(jīng)元損傷后的再生修復(fù)，防止神經(jīng)元受損死亡。Mamounas等［11］證實(shí)，緩慢注入BDNF浸潤(rùn)腦組織可顯著刺激大鼠腦內(nèi)新皮質(zhì)區(qū)和海馬內(nèi)受神經(jīng)毒素PCA損傷的軸突發(fā)芽，可見(jiàn)BDNF對(duì)神經(jīng)損傷及神經(jīng)再生具有其獨(dú)特的作用，但也依賴其他因子的協(xié)調(diào)作用。BDNF通過(guò)與其特異性受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用，TrKB是BDNF高親和力受體，BDNF與TrKB受體結(jié)合同時(shí)激活絲裂原活化蛋白激酶、磷酯酰肌醇3激酶和磷脂酶C-γ等信號(hào)通路［12］。通過(guò)激活的信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)元生存，增加突觸可塑性及神經(jīng)發(fā)生的作用。BDNF還具有抑制腦缺血后的各種損傷機(jī)制的作用：如減輕鈣離子的超載、抗氧自由基損傷、抑制谷氨酸毒性等［13-15］。從而保護(hù)腦缺血后受損神經(jīng)元，促進(jìn)大腦損傷的恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)蒲參膠囊中劑量組在治療7 d時(shí)可明顯提高bFGF及BDNF蛋白的水平。治療14 d，蒲參膠囊低劑量組與治療第7天時(shí)相比，對(duì)bFGF、BDNF的水平無(wú)明顯影響；而中劑量組和高劑量組均有升高，但與模型組比較無(wú)顯著差異。說(shuō)明蒲參膠囊在一定程度上可以刺激神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌，保護(hù)受損神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)再生，從而促進(jìn)腦缺血/再灌注后神經(jīng)損傷的修復(fù)，但其量效關(guān)系還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

因此，通過(guò)對(duì)中風(fēng)病的病因病機(jī)及中藥藥物組成療效的分析，結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，為蒲參膠囊治療缺血性中風(fēng)的可行性及促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)提供了一定的依據(jù)。

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1004-745X（2017）09-1599-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.029

2017-03-21）

△通信作者（電子郵箱：mhuawu@163.com）