韓嘯峰

（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250001）

益氣養(yǎng)陰健脾方對(duì)急性胃潰瘍模型大鼠血清炎癥因子、行為學(xué)和表皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

韓嘯峰

（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250001）

目的 觀察益氣養(yǎng)陰健脾方對(duì)急性胃潰瘍模型大鼠血清炎癥因子、行為學(xué)和表皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響。方法 30只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、中藥組，每組10只，采用不可預(yù)知性刺激法建立急性胃潰瘍大鼠模型，對(duì)照組和模型組蒸餾水灌胃，中藥組益氣養(yǎng)陰健脾方煎煮液灌胃。觀察各組大鼠的行為學(xué)和胃組織病理學(xué)變化，比較血清白介素6（IL-6）、白介素23（IL-23）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，免疫組化法檢測(cè)檢測(cè)胃黏膜表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）。結(jié)果 模型組大鼠精神萎靡，扎堆睡覺(jué)，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)不順，飲食減少，大便稀，而中藥組大鼠表現(xiàn)不明顯。與對(duì)照組比較，模型組大鼠糖水消耗、垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)得分降低，強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間增加，中藥組可增加大鼠糖水消耗、垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)得分，減少?gòu)?qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間（P<0.05）。與對(duì)照組比較，模型組胃黏膜缺損，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維素滲出、部分肌質(zhì)纖維溶解，中藥組潰瘍愈合，胃黏膜下肉芽組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，毛細(xì)血管豐富。模型組血清IL-6、IL-23和TNF-α水平顯著升高，中藥組血清IL-6、IL-23和TNF-α水平顯著降低（P<0.05）。模型組大鼠胃黏膜EGF和VEGF顯著升高，中藥組胃黏膜EGF和VEGF顯著降低（P<0.05）。結(jié)論 益氣養(yǎng)陰健脾方可改善急性胃潰瘍模型大鼠行為學(xué)，保護(hù)胃組織，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)胃黏膜修復(fù)及潰瘍愈合。

益氣養(yǎng)陰健脾方 胃潰瘍 炎癥因子 表皮生長(zhǎng)因子

臨床中急性胃潰瘍易發(fā)生多種并發(fā)癥，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，與胃黏膜生長(zhǎng)因子失衡、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)［1-2］。 胃潰瘍屬中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”“脅痛”范疇，因肝郁氣滯、肝胃不和，飲食不節(jié)損傷脾胃所致，治宜益氣養(yǎng)陰、健脾疏肝為主［3-4］。益氣養(yǎng)陰健脾方益氣養(yǎng)陰、健脾疏肝，可減輕急性胃潰瘍炎癥反應(yīng)，提高臨床療效，但其作用機(jī)制尚不明確［5］。因此，本研究以不可預(yù)知性刺激法建立急性胃潰瘍大鼠模型大鼠，旨在探討益氣養(yǎng)陰健脾方對(duì)急性胃潰瘍模型大鼠血清炎癥因子、行為學(xué)和胃黏膜表皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響，為臨床治療提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只健康清潔級(jí)SD大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供 ［許可證號(hào)SCXK（京）2011-0011］，雌雄各半，體質(zhì)量（250±20） g。 自然光線(xiàn)，以標(biāo)準(zhǔn)飼料和無(wú)菌蒸餾水喂養(yǎng)。

1.2 試藥與儀器 水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公），益氣養(yǎng)陰健脾方（組成：黃芪 15 g，黨參 10 g，生地黃 15 g，玄參 10 g，柴胡 10 g，薏苡仁 20 g，白芍10 g，枳殼 10 g，川芎 10 g，香附 10 g，延胡索 10 g，白及10 g，甘草10 g。藥材均為本院中藥房提供，并制成1 g/mL 的煎煮液）。 白介素-6（IL-6）、白介素-23（IL-23）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（上海生工技術(shù)有限公司），表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）抗體（美國(guó) Santa Cruz公司）。NI500顯微鏡（日本尼康公司），Biotek aQuant型酶標(biāo)儀（上海坤肯生物化工有限公司），RM2125切片機(jī)和TPIIZO全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī) （德國(guó)徠卡公司），Y6-6LF生物組織包埋機(jī) （湖北亞光易用電子技術(shù)有限公司），13R離心機(jī)［力康集團(tuán)力新儀器（上海）有限公司］。

1.3 造模與分組 30只SD大鼠，隨機(jī)取10只為對(duì)照組，剩余20只SD大鼠給予多種不可預(yù)知的應(yīng)激刺激制作急性胃潰瘍模型［6］。不可預(yù)知應(yīng)激刺激方法有4℃冰水中游泳5 min，夾尾巴3 min，束縛制動(dòng)4 h/d，電擊30次，束縛1周后，每日隨機(jī)選取3種應(yīng)激刺激方法，連續(xù)刺激8 d后，20只大鼠隨機(jī)分為模型組與中藥組。對(duì)照組和模型組給予蒸餾水灌胃，中藥組給予益氣養(yǎng)陰健脾方煎煮液灌胃，10 mL/kg，每日灌胃1次，連續(xù)給藥7 d。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) 觀察各組大鼠的皮膚毛發(fā)、情緒反應(yīng)、行為狀態(tài)、興奮程度、活躍狀況、飲食等一般情況。灌胃給藥7 d后，訓(xùn)練大鼠適應(yīng)含糖飲水，計(jì)算大鼠糖水消耗，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)，直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分，動(dòng)物穿越底面方塊數(shù)為水平活動(dòng)得分，記錄5 min內(nèi)大鼠靜止時(shí)間［7］。處死各組大鼠，切取胃組織標(biāo)本，甲醛固定，24 h后，經(jīng)酒精脫水和二甲苯透明后，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片間距5 mm，HE染色，樹(shù)膠封片后，光學(xué)顯微鏡觀察胃組織病理學(xué)變化。取血液2 mL，自然凝固后，3000 r/min離心10 min，分離血清，采用ELISA法檢測(cè)血清IL-6、IL-23和TNF-α水平，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。采用免疫組化法檢測(cè)胃黏膜EGF和VEGF，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，在光學(xué)顯微鏡下EGF陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒，平均光度值反映陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度，每張隨機(jī)選取3個(gè)視野，自動(dòng)計(jì)算其平均光度值和平均灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s）表示，采用t檢驗(yàn)比較組內(nèi)和組間差異；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較 對(duì)照組大鼠行動(dòng)迅速敏捷，攝食正常，毛發(fā)整齊有光澤，大便正常；模型組精神萎靡，扎堆睡覺(jué)，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)不順，飲食減少，大便稀，而中藥組大鼠一般狀態(tài)與對(duì)照組比較表現(xiàn)不明顯。

2.2 各組大鼠行為學(xué)比較 見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，模型組大鼠糖水消耗、垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)得分降低，強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間增加。中藥組可增加大鼠糖水消耗、垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)得分，減少?gòu)?qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 各組大鼠糖水消耗、垂直運(yùn)動(dòng)、水平運(yùn)動(dòng)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)比較

表1 各組大鼠糖水消耗、垂直運(yùn)動(dòng)、水平運(yùn)動(dòng)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)比較

與模型組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n 糖水消耗（mL）垂直運(yùn)動(dòng)（分）水平運(yùn)動(dòng)（分）強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間（s）對(duì)照組 10模型組 10 3.71±0.89 72.16±9.36 16.37±3.24 64.21±6.74 2.51±0.76△ 41.61±8.42△ 6.15±2.53△ 115.67±8.69△中藥組 103.16±0.91* 56.84±9.13* 11.05±3.12* 76.74±8.64*

2.3 各組大鼠病理學(xué)變化 見(jiàn)圖1。對(duì)照組大鼠組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)潰瘍形成；模型組胃黏膜缺損，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維素滲出、部分肌質(zhì)纖維溶解；中藥組潰瘍愈合，有癒痕組織，胃黏膜下肉芽組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，毛細(xì)血管豐富。

圖1各組大鼠胃組織病理學(xué)變化（HE染色，400倍）

2.4 各組大鼠炎癥因子比較 見(jiàn)表2。模型組血清IL-6、IL-23和TNF-α水平顯著升高，中藥組血清IL-6、IL-23和TNF-α水平顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表2 各組大鼠血清炎癥因子比較

表2 各組大鼠血清炎癥因子比較

組 別 n IL-6（ng/L） IL-23（ng/L） TNF-α（μg/L）對(duì)照組 10模型組 10 100.21±16.63 53.54±3.59 0.98±0.23 175.41±21.37△ 75.17±4.31△ 1.67±0.28△中藥組 10130.52±17.61* 64.12±3.86* 1.27±0.21*

2.5 各組大鼠表皮生長(zhǎng)因子比較 見(jiàn)表3。模型組大鼠胃黏膜EGF和VEGF顯著升高，中藥組胃黏膜EGF和VEGF顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表3 各組大鼠胃黏膜EGF和VEGF比較（IOD

表3 各組大鼠胃黏膜EGF和VEGF比較（IOD

組 別 n EGF VEGF對(duì)照組 10模型組 10 0.19±0.03 0.16±0.04 0.85±0.12△ 0.76±0.09△中藥組 100.22±0.05* 0.24±0.06*

3 討 論

急性胃潰瘍患者組織局部結(jié)構(gòu)與功能未完全恢復(fù)，可存在結(jié)締組織充填，黏膜層變薄，微血管結(jié)構(gòu)紊亂，易并發(fā)出血穿孔，可發(fā)展為慢性胃潰瘍，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后［8-9］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性胃潰瘍與正氣不足及脾胃瘀阻，飲食不節(jié)、肝怒犯脾等致氣血失暢、胃膜受損、胃膜不生，胃潰瘍與肝脾兩臟密切相關(guān)，是多種因素所致［10-11］。多種不可預(yù)知應(yīng)激法制作急性胃潰瘍模型大鼠，動(dòng)物不僅不能預(yù)知刺激，避免適應(yīng)現(xiàn)象的發(fā)生，也可模擬情志異常引發(fā)肝郁證的過(guò)程，符合以炎性糜爛、胃黏膜淺表性潰瘍甚至出血急性胃潰瘍病機(jī)［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組精神萎靡，扎堆睡覺(jué)，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)不順，飲食減少，大便稀，糖水消耗、垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)得分降低，強(qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間增加，胃黏膜缺損，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維素滲出、部分肌質(zhì)纖維溶解，血清IL-6、IL-23和TNF-α水平顯著升高，胃黏膜EGF和VEGF顯著升高，說(shuō)明不可預(yù)知性刺激法建立急性胃潰瘍大鼠模型的一般狀態(tài)、行為學(xué)、胃組織病理、炎癥因子和胃組織皮生長(zhǎng)因子均發(fā)生了顯著的變化，所建立的急性胃潰瘍大鼠模型符合急性胃潰瘍患者的病理變化，所建立的動(dòng)物模型可較好地評(píng)價(jià)藥物的干預(yù)作用和機(jī)制的研究［13］。給予益氣養(yǎng)陰健脾方煎煮液灌胃后發(fā)現(xiàn)，中藥組可顯著改善大鼠的皮膚毛發(fā)、情緒反應(yīng)、行為狀態(tài)、興奮程度、活躍狀況、飲食等一般情況，增加大鼠糖水消耗、垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)得分，減少?gòu)?qiáng)迫游泳中靜止時(shí)間，促進(jìn)潰瘍愈合，胃黏膜下肉芽組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，毛細(xì)血管豐富，血清IL-6、IL-23和TNF-α水平顯著降低，胃黏膜EGF和VEGF顯著降低，提示益氣養(yǎng)陰健脾方可改善急性胃潰瘍模型大鼠行為學(xué)，保護(hù)胃組織，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)胃黏膜修復(fù)及潰瘍愈合。益氣養(yǎng)陰健脾方具有益氣養(yǎng)陰、健脾疏肝功效，方中黃芪健脾補(bǔ)中、益衛(wèi)固表，益氣升陽(yáng)以治療中虛；黨參健脾補(bǔ)氣；生地黃滋陰降火；玄參、生地黃清熱涼血，養(yǎng)陰生津；柴胡疏散退熱、疏肝解郁、升陽(yáng)舉陷，疏肝理氣；薏苡仁健脾和胃；白芍養(yǎng)肝斂陰、和胃止痛，助柴胡疏肝功效；枳殼瀉脾壅滯，調(diào)中焦運(yùn)化，加強(qiáng)疏肝理氣、解郁之功；川芎行氣開(kāi)郁、活血止痛；香附理氣和胃止痛，延胡索活血，行氣，止痛；白芍和甘草配伍緩急止痛，諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、健脾疏肝功效，對(duì)急性胃潰瘍可標(biāo)本兼治?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)柴胡疏肝可改善急性應(yīng)激大鼠行為學(xué)及胃組織學(xué)形態(tài)，減少潰瘍指數(shù)，提高大腦藍(lán)斑中腦腸肽含量，改善胃局部血液循環(huán)、清除氧自由基，保護(hù)胃黏膜和增強(qiáng)免疫力［14-15］。

綜上所述，益氣養(yǎng)陰健脾方可改善急性胃潰瘍模型大鼠行為學(xué)，保護(hù)胃組織，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)胃黏膜修復(fù)及潰瘍愈合。

［1］陸珊恩.中西醫(yī)結(jié)合治療急性胃潰瘍臨床觀察［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2014，23（4）：694-695.

［2］鄒俊波，桑文濤，王芳，等.美洲大蠊提取物對(duì)乙醇致小鼠急性胃潰瘍的預(yù)防作用［J］.中成藥，2016，38（11）：2325-2331.

［3］楊永生，麻春杰，董平，等.鎖陽(yáng)多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性胃潰瘍大鼠模型的影響［J］.安徽醫(yī)藥，2011，15（10）：1204-1206.

［4］楊宗保，王晨光，龔安，等.艾灸調(diào)節(jié)急性胃潰瘍大鼠胃黏膜細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志蛋白質(zhì)表達(dá)的研究［J］.中國(guó)針灸，2013，33（11）：1017-1021.

［5］滿(mǎn)光亮，葛惠男，石方臻，等.益氣活血方對(duì)急性胃潰瘍大鼠模型黏膜愈合質(zhì)量研究［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2015，24（11）：1939-1941.

［6］呂紅偉，李靖，陳淳，等.柴胡疏肝散對(duì)急性胃潰瘍模型大鼠行為學(xué)及胃組織學(xué)的影響［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36（2）：150-152.

［7］李霞，吳程燁，肖世富，等.慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激對(duì)大鼠曠場(chǎng)行為和糖水偏愛(ài)度影響的觀察［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2012，32（3）：175-181.

［8］陳欽明，江毓妮，黃麗暉，等.內(nèi)鏡下治療急性胃潰瘍出血的臨床效果觀察［J］.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2016，10（3）：69-70.

［9］王頌歌，余會(huì)麗，馬明，等.抗菌藥物對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染胃潰瘍患者血清炎癥因子及胃泌素指標(biāo)的影響［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26（11）：2470-2472.

［10］王麗君.加味左金丸聯(lián)合三聯(lián)療法對(duì)胃潰瘍患者血清炎癥因子的影響［J］.醫(yī)學(xué)信息，2016，29（13）：253.

［11］蘇鳳哲，于文濤，楊牧祥，等.胃炎飲方對(duì)胃潰瘍大鼠表皮生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)雜志，2015，56（5）：418-422.

［12］秦培潔，王柳青，程志立，等.應(yīng)激性胃潰瘍大鼠前爪不同區(qū)域黑色素變化的ghrelin-POMC通路研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（12）：12-14，19，封 3.

［13］楊宗保，王亞?wèn)|，劉瓊，等.電針胃經(jīng)穴抑制胃潰瘍大鼠氧化損傷的作用機(jī)制研究［J］.中國(guó)針灸，2016，36（6）：617-621.

［14］鄧晉芳，方蕾，巴恩平，等.柴胡復(fù)方水提物對(duì)大鼠急性胃潰瘍預(yù)防作用的影響［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（5）：820-823.

［15］楊建軍，趙廣利，柯彤，等.柴胡疏肝散對(duì)功能性消化不良患者胃動(dòng)力及胃腸激素的影響［J］.吉林中醫(yī)藥，2013，33（8）：801-803.

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1004-745X（2017）09-1596-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.028

2017-05-19）