張洲洲，浦金賢，俞弘頎，趙雪志，陳齊峰

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院北區(qū)泌尿外科，蘇州 215008;2.蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科)

·論著·

PPAR-γ和PTEN蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

張洲洲1，浦金賢2，俞弘頎1，趙雪志1，陳齊峰1

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州市立醫(yī)院北區(qū)泌尿外科，蘇州 215008;2.蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科)

目的測(cè)定膀胱移行細(xì)胞癌中PPAR-γ和PTEN蛋白的表達(dá)及與其病理分級(jí)、臨床分期及預(yù)后相關(guān)性。方法免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PPAR-γ和PTEN于膀胱移行細(xì)胞癌標(biāo)本及正常膀胱組織中的表達(dá)程度，病理分析儀測(cè)定蛋白表達(dá)程度。結(jié)果①在正常膀胱組織中PPAR-γ蛋白的表達(dá)(20%)明顯低于膀胱癌(68%)，而正常膀胱組織PTEN蛋白的表達(dá)(100%)明顯高于膀胱癌(52%)，兩者陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。② 膀胱移行細(xì)胞癌組織中PPAR-γ表達(dá)與臨床分期、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性，PTEN蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。③ PPAR-γ蛋白和PTEN蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.604，P<0.05)。結(jié)論P(yáng)PAR-γ和PTEN可能參與了膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，對(duì)膀胱癌診斷、臨床分期及預(yù)后有一定價(jià)值。

膀胱腫瘤；基因,腫瘤抑制；PPARγ；PTEN

近年來(lái)，臨床上對(duì)于過(guò)氧化物酶體增殖物的激活受體與第10號(hào)的染色體的同源消失性的磷酸酶—張力蛋白基因的研究受到醫(yī)學(xué)人員的重視和關(guān)注。PPAR-γ作為Ⅱ型核激素受體超家族成員之一，根據(jù)臨床研究數(shù)據(jù)顯示，在如胃腸道腫瘤，前列腺惡性腫瘤以及子宮內(nèi)膜癌等疾病的發(fā)展中，存在明顯的突變、缺失抑或異常的表達(dá)等，且與腫瘤惡性程度也呈現(xiàn)為緊密相關(guān)關(guān)系[1-3]，另外，PPAR-γ和它的配體也已經(jīng)被證明，可以對(duì)多種類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抑制性的繁殖、分化誘導(dǎo)以及介導(dǎo)凋亡[4-8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)等方法檢測(cè)在膀胱惡性腫瘤中PPAR-γ和PTEN的表達(dá)及相關(guān)性，從而為今后可能的靶向治療提供靶點(diǎn)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的收集方法 納入研究對(duì)象為2010年1月至2015年1月在蘇州市立醫(yī)院北區(qū)進(jìn)行手術(shù)治療的94例膀胱癌患者。60例患者行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切(TURBT)術(shù)，34例患者行膀胱部分切除術(shù)，病理結(jié)果均為移行細(xì)胞癌。依據(jù)WHO的臨床國(guó)際準(zhǔn)則，進(jìn)行病理分級(jí)，其中59例為低級(jí)別尿路上皮癌，35例為高級(jí)別尿路上皮癌，年齡33～92歲，其中男性39例，女性21例，平均(71±11)歲。按照2002年國(guó)際的抗癌協(xié)會(huì)聯(lián)盟(UICC)有關(guān)TNM的臨床分期進(jìn)行分類(lèi)，淺表型腫瘤(Ta—T1期腫瘤)的患者有61例，浸潤(rùn)型腫瘤(T2—T4期腫瘤)的患者有33例。對(duì)照組選取膀胱鏡檢查活檢結(jié)果為正常膀胱組織患者20例，其中，13例男性，7例女性，年齡53～85歲，平均(65±10.5)歲。兩組年齡、性別等一般資料比較，具有可比性。

1.2 試劑與儀器 使用常規(guī)SP免疫組織化學(xué)試劑，兔抗人PPAR-γ單克隆抗體、兔抗人PTEN單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，德國(guó)萊卡病理圖像分析儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果判定

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢驗(yàn) 所有標(biāo)本經(jīng)過(guò)含量為10%的甲醛液固定1 d，并應(yīng)用石蠟包埋。包埋的蠟塊進(jìn)行5 μm切片處理，切片的數(shù)量有4張，使用已知的陽(yáng)性片給予陽(yáng)性對(duì)照，使用PBS緩沖液給予陰性對(duì)照。使用免疫組織化學(xué)染色S-P 法對(duì)PPAR-γ以及PTEN進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 病理結(jié)果判定 采用德國(guó)萊卡公司生產(chǎn)的病理分析圖像儀對(duì)取得的結(jié)果進(jìn)行記錄和分析。采用空白對(duì)照法對(duì)陰性進(jìn)行參照。陽(yáng)性結(jié)果的判斷為細(xì)胞漿和胞核為棕黃色抑或?yàn)辄S色。采用隨機(jī)數(shù)字表法選取數(shù)量5個(gè)高倍視野內(nèi)(4×100)，如果陽(yáng)性細(xì)胞的比例占據(jù)計(jì)數(shù)細(xì)胞中的比值大于等于10%，則可以定義為陽(yáng)性表達(dá)，反之則判定為陰性。使用雙盲法給予結(jié)果判斷，使用德國(guó)萊卡的病理分析儀對(duì)切片給予灰度測(cè)定，灰度值與免疫組織化學(xué)的染色結(jié)果成反比。使用平均灰度值對(duì)陽(yáng)性的表達(dá)水平進(jìn)行描述。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料比較，采用χ2檢驗(yàn)；使用計(jì)量資料對(duì)于組間的PPAR-γ和PTEN的表達(dá)差異性給予對(duì)比，使用Pearson相關(guān)性分析對(duì)PPAR-γ和PTEN的相關(guān)系數(shù)給予計(jì)算。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPAR-γ及PTEN在正常膀胱組織及膀胱腫瘤組織中的表達(dá) 膀胱移行細(xì)胞癌組織中PPAR-γ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(68%)高于正常膀胱組織(20%)，P<0.001，見(jiàn)表1。膀胱腫瘤組織中PTEN蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率(52.1%)低于正常膀胱組織(100%)，兩者組織中PPAR-γ蛋白和PTEN蛋白表達(dá)的平均灰度值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表2。表淺型膀胱移行細(xì)胞癌PPAR-γ蛋白表達(dá)灰度值高于浸潤(rùn)型膀胱移行細(xì)胞癌(P<0.001)；低級(jí)別膀胱移行細(xì)胞癌中PPAR-γ蛋白表達(dá)灰度值高于高級(jí)別腫瘤(P=0.002)；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱移行細(xì)胞癌PPAR-γ蛋白表達(dá)量灰度值高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤(P<0.001)。膀胱移行細(xì)胞癌中PPAR-γ蛋白表達(dá)灰度值與腫瘤是否浸潤(rùn)肌層、病理分期及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。而腫瘤的PPAR-γ蛋白表達(dá)在性別、年齡(>65歲組和≤65歲)、腫瘤大小(直徑≤3 cm組和>3 cm組)各組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 在正常膀胱組織及膀胱移行細(xì)胞癌中PTEN陽(yáng)性率

而在浸潤(rùn)型、高級(jí)別、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱移行細(xì)胞癌PTEN蛋白表達(dá)灰度值均高于表淺型、低級(jí)別、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱腫瘤組織，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。PTEN蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌表達(dá)灰度值與腫瘤是否浸潤(rùn)肌層、病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系。見(jiàn)表3。

2.2 Peason相關(guān)性分析 PPAR-γ及PTEN在膀胱移行癌組織中表達(dá)，顯示PPAR-γ及PTEN呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.604，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

表3 PPAR-γ及PTEN在膀胱腫瘤組織中

圖1 PPAR-γ及PTEN在膀胱癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

PPARs對(duì)細(xì)胞增殖控制和分化的過(guò)程中起著十分關(guān)鍵的效果[9-10]。經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)外的臨床數(shù)據(jù)證實(shí)，在細(xì)胞分化、胰島素敏感度發(fā)展、2型糖尿病發(fā)展以及動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤生物學(xué)過(guò)程中，PPAR-γ皆有所參與[11]。當(dāng)前對(duì)PPAR-γ和腫瘤之間的關(guān)系已經(jīng)受到醫(yī)學(xué)專(zhuān)家的廣泛關(guān)注，由于PPAR-γ可對(duì)患者體內(nèi)的新陳代謝情況以及炎性反應(yīng)給予適宜的調(diào)控，當(dāng)PPAR-γ被TZDs所激活之后，其可對(duì)患者體內(nèi)的相關(guān)細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞凋亡等給予適宜的調(diào)控[12]。

PTEN的總稱(chēng)為人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶，為我國(guó)目前臨床上發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)有磷酸酶活性的抑制癌癥因子的基因。在人類(lèi)所患有的多種腫瘤類(lèi)別中，PTEN的缺失和突變頻率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這可能是一種新型的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，和人類(lèi)所患癌癥有著緊密的關(guān)聯(lián)。這一系列的復(fù)合物質(zhì)已經(jīng)被證實(shí)為對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有促進(jìn)效果。PTEN抑癌機(jī)制主要為：①對(duì)細(xì)胞周期抑制從而對(duì)生長(zhǎng)流程進(jìn)行調(diào)節(jié)控制。PTEN具磷酸酶的活性，促使PIP3表現(xiàn)為脫磷酸化的情況，進(jìn)而對(duì)PI3K/AKT信號(hào)的傳導(dǎo)途徑給予一定程度抑制，降低細(xì)胞內(nèi)的AKT磷酸化水平，并有效降低細(xì)胞的周期蛋白D1，加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性；②對(duì)腫瘤血管的生成進(jìn)行抑制[13]。在PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路中，PTEN具有調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而對(duì)VEGF/VEGF受體的信號(hào)途徑產(chǎn)生影響，對(duì)MMPs進(jìn)行下調(diào)，并調(diào)節(jié)VEGF的分泌，對(duì)腫瘤的血管生成進(jìn)行調(diào)控，以此抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。③惡性腫瘤中由于PTEN出現(xiàn)缺失和突變，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)控制作用減弱，造成腫瘤生長(zhǎng)[14]。臨床研究顯示，在胃腸道腫瘤、腎上腺癌、前列腺腫瘤以及子宮內(nèi)膜癌等疾病中，PTEN均有異常表達(dá)，且與腫瘤惡性程度有一定相關(guān)性[15]。

本次研究結(jié)果顯示，膀胱移行上皮腫瘤PPAR-γ以及PTEN的表達(dá)為負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，r=0.604，P<0.05，這一結(jié)果說(shuō)明，PPAR-γ和PTEN在膀胱腫瘤的發(fā)展中存在一定的相關(guān)關(guān)系。相關(guān)研究表明，當(dāng)對(duì)PPAR-γ進(jìn)行激活后，其抑制癌癥的基因(PTEN)以及c-myc和P27等，上調(diào)下游目的基因表達(dá)，起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和生物學(xué)浸潤(rùn)作用[16]。臨床數(shù)據(jù)證實(shí)，當(dāng)激活PPAR-γ后，其PTEN的表達(dá)上調(diào)，從而對(duì)PIP3激活PPI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行抑制。促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞周期阻礙，并阻隔細(xì)胞周期停滯于G1期階段，在抑制腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等方面也發(fā)揮十分重要的作用[17]。PPAR-γ和PTEN皆屬于抑制癌癥的基因，但是在膀胱癌中，PTEN的表達(dá)呈現(xiàn)為顯著下降的趨勢(shì)，而PPAR-γ持續(xù)上升，這一原因主要是由于：僅在發(fā)生PPAR-γ的磷酸化或與其他蛋白相互結(jié)合時(shí)，PPAR-γ異常表達(dá)才有可能具備一定的生物活性，進(jìn)而可能為PPAR-γ的激動(dòng)劑提供一定的治療靶點(diǎn)。

一旦PTEN因子物質(zhì)出現(xiàn)了缺損、突發(fā)性病變或者活性減弱時(shí)，則隨之PTEN/PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)通路也會(huì)受到影響，出現(xiàn)紊亂的情況。當(dāng)PI3K或者是PKB等致癌物質(zhì)不斷發(fā)展過(guò)程中，PTEN對(duì)這些致癌物質(zhì)的抑制效果不斷減弱，導(dǎo)致這些致癌物質(zhì)出現(xiàn)了活化異常上升的情況。而當(dāng)致癌物質(zhì)反應(yīng)時(shí)，導(dǎo)致PPAR-γ的表達(dá)出現(xiàn)異常提高。導(dǎo)致這一因素出現(xiàn)的主要原因和激活劑產(chǎn)生抗腫瘤所提供靶點(diǎn)有所關(guān)聯(lián)。同時(shí)在膀胱癌疾病的不斷進(jìn)展中，雖然PPAR-γ蛋白表達(dá)逐漸升高，然而PPAR-γ內(nèi)在活性并未升高，可能一定程度出現(xiàn)下降。從而不能通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控PTEN，故PTEN并未因此激活而表達(dá)水平有所下降，所以膀胱腫瘤患者體內(nèi)的PPAR-γ為上升，PTEN為降低。

綜上所述，PPAR-γ和PTEN可能參與了膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。通過(guò)PPAR-γ對(duì)PTEN/PI3K/AKT通路介導(dǎo)，以此對(duì)PTEN的表達(dá)產(chǎn)生影響，這為今后臨床靶向治療提供新的思路。

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TheexpressionandsignificanceofPPAR-γandPTENinbladdertransitionalcellcarcinoma

Zhangzhouzhou*，PuJinxian，YuHongqi，ZhaoXuezhi，ChenQifeng

(*DepartmentofUrinarySurgery，theAffiliatedSuzhouHospitalofNanjingMedicalUniversity，Suzhou215008,China)

ObjectiveTo exolore the expression of ppar-gamma and PTEN in cell carcinoma of the bladder and the its correlation with pathologic grade,clinical stage and prognosis.MethodsThe expression of ppar-gamma and PTEN in bladder transitional cell carcinoma specimens and normal bladder tissues was detected by immunohistochemistry,and the expression level of protein was detected by pathological analyzer.Results① The expression of PPAR- gamma protein(20%) in normal bladder tissues was significantly lower than that of bladder cancer(68%),while the expression of PTEN protein in normal bladder tissues (100%)was significantly higher than that in bladder cancer(52%).The positive rate of the two markers had significant difference (P<0.01)。② The expression of PPAR- gamma was positively correlated with clinical stage,pathological stage and lymph node metastasis in bladder transitional cell carcinoma,and negatively correlated with PTEN protein expression.③There was a negative correlation between PPAR- gamma protein and PTEN protein in bladder transitional cell carcinoma (r=-0.604,P<0.05).ConclusionPpar-gamma and PTEN may be involved the occurrence and development of bladder cancer and maybe has some value in clinical diagnosis,staging and prognosis judgment of bladder cancer.

Urinary bladder neoplasms； Genes,tumor suppressor；PPAR gamma；PTEN

R737.14

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.05.020

2017-06-10)

江蘇省蘇州市“科教興衛(wèi)”青年科技項(xiàng)目(KJXW2014023)

張洲洲，主治醫(yī)師，Email：5747096@qq.com