鄧 雪，胡雪原， 何 丹，晏子俊，周云莉， 張景勍

（重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 /藥物高校工程研究中心，重慶 400016）

靜脈給予尿酸酶自組裝空心納米微球的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性初步研究

鄧 雪，胡雪原， 何 丹，晏子俊，周云莉， 張景勍*

（重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 /藥物高校工程研究中心，重慶 400016）

研究了載尿酸酶聚乙二醇-透明質(zhì)酸 （Hyaluronic acid-graft-polyethylene glycol，HA-g-PEG）/磺丁基-β-環(huán)糊精（Sulfobutyl ether-beta-cyclodextrin，SCD）自組裝空心納米微球（HA-g-PEG/SCD self-assembly hollow spheres encapsulated uricase，UHPSD）在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性。大鼠單劑量靜脈注射給予UHPSD和游離尿酸酶（Uricase，UOX），眼底靜脈叢取血，測定給藥后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿中尿酸酶的活性。采用DAS 2.1.1軟件分析處理藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，并對UHPSD和UOX進(jìn)行生物等效性評價(jià)。UHPSD和UOX血藥活性曲線符合二室模型。UHPSD提高了尿酸酶的生物利用度，UHPSD與UOX不具有生物等效性。

尿酸酶；自組裝空心納米微球；藥代動(dòng)力學(xué)；生物等效性

尿酸酶（Uricase，UOX）是生物體內(nèi)嘌呤代謝途徑中的關(guān)鍵酶，能夠?qū)Ｒ淮呋蛩嵫趸赡蚰宜亍⑦^氧化氫和二氧化碳[1-2]，降低體內(nèi)尿酸水平。人類和靈長類動(dòng)物缺乏UOX，故可將其用于尿結(jié)石和腎病功能衰竭等所致高尿酸血癥的治療[3]。如Patte等[4]用從黃曲霉中制備的UOX治療由白血病化療引起的嚴(yán)重高尿酸血癥。但是天然的UOX存在許多缺點(diǎn)：生理pH條件下活性低，穩(wěn)定性差，體內(nèi)活性半衰期短，機(jī)體易產(chǎn)生免疫反應(yīng)以及易被體內(nèi)酶水解失活[5]。因此，UOX的臨床應(yīng)用受到較大限制。

自組裝空心納米微球是一種新型的藥物載體，具有生物膜相似性，提高被包封藥物的穩(wěn)定性，降低免疫原性和提高藥物生物利用度等優(yōu)點(diǎn)[6]。為了克服UOX的缺點(diǎn)，將UOX裝載于聚乙二醇-透明質(zhì)酸 （Hyaluronic acid-graft-poly ethylene glycol，HA-g-PEG）/磺丁基-β-環(huán)糊精 （Sulfobutyl etherbeta-cyclodextrin，SCD）形成的空心納米微球中，形成尿酸酶自組裝空心納米微球 （HA-g-PEG/SCD self-assembly hollow spheres encapsulated uricase，UHPSD）。作者著重考察了UHPSD在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程，并對UHPSD和UOX進(jìn)行生物等效性評價(jià)，為進(jìn)一步研究UHPSD的藥效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

UOX，美國Sigma公司產(chǎn)品；尿酸，英國Alfa Aesar公司產(chǎn)品；磺丁基-β-環(huán)糊精：南京都萊生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

AB204S電子分析天平：瑞士Mettler Toledo儀器公司產(chǎn)品；85-2型恒溫磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-16B臺式高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；UV-7504 PC型紫外分光光度計(jì)，PHS-3C型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Sephadex G-200層析柱：上?？笊锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品；清潔級SD大鼠：雄性，（230±20）g，中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證書：SCXK（渝）2012-0005。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 UHPSD的制備 按照Meng等[7]的方法，將1mg的UOX溶于2 mL的HA-g-PEG溶液 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%）中，然后在攪拌的條件下，將2 mL含有UOX的HA-g-PEG溶液緩慢滴加入6 mL的SCD溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.0%）中。開始滴加時(shí)，溶液變輕微的渾濁，表明開始有空心納米球形成.繼續(xù)在10℃條件下磁力攪拌2 h，即得UHPSD。

1.2.2 UHPSD包封率的測定 按照參考文獻(xiàn)報(bào)道方法，采用葡聚糖凝膠柱色譜法[8]測定包封率。待Sephadex G-200柱填充與平衡后，吸取0.5 ml的UHPSD，上柱，用pH8.5的Bicine-NaOH緩沖液作為洗脫液洗脫分離UHPSD和UOX。取100 μL過柱后的UHPSD，加入乙醚破乳后，再加入考馬斯亮藍(lán)，在595 nm波長處測定吸收度值（A1）。以同法處理的未過柱的UHPSD，同法測定吸收度值（A2）。包封率（%）=（A1/A2）×100%，重復(fù)3次。

1.2.3 動(dòng)物分組及給藥 取雄性SD大鼠12只，按照簡單隨機(jī)方法分為2組，每組6只。一組靜脈注射給予UOX（2U/Kg），另一組靜脈給予UHPSD（相當(dāng)于游離酶2U/Kg）。給藥前禁食不禁水24 h，分別在給藥 后 0.083、0.17、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h后，眼眶下靜脈取血，置于肝素化離心管中，離心（6 000 r/min）10 min后分離血漿樣品。

1.2.4 藥時(shí)曲線的繪制 按照采用直接動(dòng)力學(xué)尿酸酶法[9]測定UHPSD組和UOX組大鼠不同采血時(shí)間點(diǎn)血漿樣品中酶的活性。根據(jù)所測結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，酶活性為縱坐標(biāo)，繪制平均血藥活性-時(shí)間曲線。

1.2.5 藥動(dòng)學(xué)和生物等效性分析 用藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算程序 DAS 2.1.1擬合大鼠單次靜脈注射UHPSD和UOX的經(jīng)時(shí)血藥濃度數(shù)據(jù)，Cmax及Tmax采用實(shí)測值，AUC0～24h、AUC0～∞和半衰期 t1/2為擬合數(shù)據(jù)。根據(jù)AUC0～24h計(jì)算UHPSD的平均相對生物利用度，即：平均相對生物利用度（F）=AUC（UHPSD）/ AUC（UOX）。再采用雙向單側(cè)t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)量，求得（1-2α）置信區(qū)間。如在規(guī)定范圍內(nèi)（經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，UHPSD的 AUC0～24h在 UOX的 80%～125%范圍，UHPSD的Cmax在UOX的70%-143%范圍），即可有1-2α判斷兩者生物等效。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 UHPSD的包封率

制備3批UHPSD，經(jīng)檢測，平均包封率為（62.60±3.17）%。

2.2 藥時(shí)曲線和藥動(dòng)學(xué)

2組雄性 SD大鼠分別靜脈注射 UHPSD和UOX后，尿酸酶的藥-時(shí)曲線見圖1。UHPSD和UOX在SD大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。

如圖1所示，SD大鼠分別靜脈注射UHPSD和UOX后，UOX組酶活性達(dá)到最高值后迅速下降。2 h時(shí)，UOX組大鼠血漿樣品中檢測不出酶的活性，而此時(shí)，UHPSD組大鼠血漿樣品仍保留較高的酶活性（40.87 mU/L）。到達(dá)10 h時(shí)，UHPSD組大鼠血漿樣品仍然能夠檢測到酶活性，且此時(shí)酶活性為本組最高活性的12.35%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UHPSD延長了UOX在大鼠體內(nèi)的滯留時(shí)間。

圖1 SD大鼠靜脈注射UHPSD和UOX后平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.1 Mean plasma concentration-time curve after injecting UHPSD and UOX in SD rats

如表1所示，UHPSD組和UOX組的t1/2分別為（8.35±5.95）h和 （0.89±0.25）h，t1/2延長了約8.38倍。Tmax分別為 （0.97±0.30）h和 （0.33± 0.00）h，Tmax明顯延后。AUC0～24h分別為 （412.25± 34.87）mU·h/L和 （116.04±6.61）mU·h/L，AUC0～∞分別為（526.71±115.90）mU·h/L和（146.87±23.93）mU·h/L。經(jīng)計(jì)算，UHPSD平均相對生物利用度F0-t為（355.27±30.05）%，UHPSD提高了UOX的相對生物利用度。

表1 SD大鼠靜脈注射UHPSD和UOX后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 1 Main pharmacoinetic parameters after injecting UHPSD and UOX in rats

2.3 生物等效性評價(jià)結(jié)果

經(jīng)過 DAS2.1.1軟件處理，AUC0-24h、AUC0-∞和Cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行雙單側(cè)t檢驗(yàn)及90%可信區(qū)間考察，UHPSD和 UOX的 AUC0-24h之比為355.27%，置信區(qū)間為78.5%～81.2%；AUC0-∞之比為358.62%，置信區(qū)間為76.4%～79.4%；Cmax之比為50.90%，置信區(qū)間為104.3%～107.6%。雙向單側(cè) t檢驗(yàn)結(jié)果顯示UHPSD與UOX的 AUC0-24h、AUC0-∞和Cmax具有顯著性差異 （P＜0.05），Tmax經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)具有顯著性差異（P＜0.05）。按照生物等效性判定標(biāo)準(zhǔn)，單次靜脈注射UHPSD和UOX比較，兩者不具有生物等效性。

3 結(jié)語

針對UOX存在生理pH條件下活性低；穩(wěn)定性差，體內(nèi)活性半衰期短；機(jī)體易產(chǎn)生免疫反應(yīng)以及易被體內(nèi)酶水解失活等缺點(diǎn)。Poznansky[10]等將尿酸酶與白蛋白進(jìn)行交聯(lián)；Yasuda[11]將尿酸酶吸附或以共價(jià)結(jié)合于殼聚糖或葡聚糖等。但是，以上方法都不能使尿酸酶發(fā)揮其最佳的催化活性，且大都存在生物相容性較低以及穩(wěn)定性不理想等缺點(diǎn)。自組裝空心納米微球是一種新型的藥物載體，具有緩釋、降低藥物毒性、提高藥物穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)前期初步研究，將UOX包裹于HA-g-PEG/SCD自組裝形成的空心納米微球后，酶的體外穩(wěn)定性獲得了提高。

目前尚未見UHPSD的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和生物等效性研究的相關(guān)報(bào)道。作者將UOX制備成UHPSD，酶以分子形式包裹于納米微球中，不會(huì)泄露到體液中，從而到達(dá)長效、高效的目的。作者首次對UHPSD在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明UHPSD提高了酶的活性和生物利用度，延長了酶的t1/2和Tmax，緩釋效果明顯。UHPSD與UOX不具有生物等效性。

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會(huì)議名稱(中文)：2017年全國植物生物學(xué)大會(huì)

所屬學(xué)科：生物物理學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué),細(xì)胞生物學(xué),遺傳與發(fā)育生物學(xué),作物學(xué)及林木育種、生物學(xué)

開始日期：2017-10-09 結(jié)束日期：2017-10-10

所在城市：重慶市 渝中區(qū)

具體地點(diǎn)：重慶市 悅來國際會(huì)議中心

主辦單位：中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)、中國作物學(xué)會(huì)、中國植物學(xué)會(huì)、中國植物生理與植物分子生物學(xué)學(xué)會(huì)、中國遺傳學(xué)會(huì)

協(xié)辦單位：重慶大學(xué)、重慶市科協(xié)

承辦單位：西南大學(xué)、重慶市植物學(xué)會(huì)、重慶市遺傳學(xué)會(huì)、重慶市作物學(xué)會(huì)、中國科學(xué)院植物分子生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

主題：植物科學(xué)改善人類生活

會(huì)議主席：李家洋、許智宏、袁隆平

聯(lián)系人：崔 強(qiáng)

聯(lián)系電話：010-62836674

E-MAIL：cuiqiang@ibcas.ac.cn

會(huì)議網(wǎng)站：http://www.ncpb.net/2017/

會(huì)議背景介紹：為了展示我國植物生物學(xué)研究的最新成果和進(jìn)展，促進(jìn)植物科學(xué)改善人類生活，加強(qiáng)相關(guān)領(lǐng)域科研人員之間的交流與合作，中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)、中國作物學(xué)會(huì)、中國植物學(xué)會(huì)、中國植物生理與植物分子生物學(xué)學(xué)會(huì)、中國遺傳學(xué)會(huì)聯(lián)合舉辦“2017全國植物生物學(xué)大會(huì)”。大會(huì)定于2017年10月9日-10日在重慶市召開。大會(huì)將邀請國內(nèi)植物生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域取得突出成果并具有重要學(xué)術(shù)影響的專家學(xué)者以及優(yōu)秀青年科學(xué)家進(jìn)行學(xué)術(shù)報(bào)告。組委會(huì)誠摯邀請國內(nèi)外同行參加本次大會(huì)。

Pharmacokinetics and Bioequiavailability of Intravenous Uricase Self-Assembly Hollow Nanospheres

DENG Xue， HU Xueyuan， HE Dan， YAN Zijun， ZHOU Yunli， ZHANG Jingqing*
（College of Pharmacy/Engineering Research Center in University，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

To study the pharmacokinetic and bioequivalence of hollow nanospheres self-assembled by hyaluronic acid-graft-poly（ethylene glycol）（HA-g-PEG）and sulfobutyl ether-beta-cyclodextrin（SCD）containing uricase（UHPSD）in SD rats.Rats were administrated with（i.v.）UHPSD and UOX，respectively.Blood sample were collected from eye socket，and the activity of uricase were assayed.Compartmental pharmacokinetics were analyzed by DAS 2.1.1 software，then the bioequivalence was judged.The activity-time curve of UHPSD and UOX were conformed to a two-compartment model with a lag time.

uricase，self-assembly hollow nanosphere，pharmacokinetics，bioequiavailability

R 91

：A

：1673—1689（2017）07—0698—04

2015-07-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30973645）；重慶市首批高等學(xué)校優(yōu)秀人才資助計(jì)劃。

*通信作者：張景勍（1973—），女，重慶人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事藥物新劑型與新技術(shù)研究工作。E-mail：zjqrae01@163.com

鄧雪，胡雪原，何丹，等.靜脈給予尿酸酶自組裝空心納米微球的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性初步研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（07）：698-701.