王翠平華學(xué)軍林 彬劉愛華寧夏林業(yè)研究院種苗生物工程國家重點實驗室, 寧夏銀川 75000;中國科學(xué)院植物研究所, 北京 0009;中國科學(xué)院大學(xué), 北京0009;Department of Plant Science, University of Manitoba, Winnipeg, RTN, MB, Canada

甘藍(lán)型油菜脯氨酸合成相關(guān)同源基因的進化和差異表達分析

王翠平1華學(xué)軍2,*林 彬3劉愛華4
1寧夏林業(yè)研究院種苗生物工程國家重點實驗室, 寧夏銀川 750004;2中國科學(xué)院植物研究所, 北京 100093;3中國科學(xué)院大學(xué), 北京100049;4Department of Plant Science, University of Manitoba, Winnipeg, R3T2N2, MB, Canada

以異源四倍體甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)及其二倍體祖先白菜(B. rapa)和甘藍(lán)(B. oleracea)為對象, 研究了脯氨酸合成途徑關(guān)鍵酶基因P5CS和OAT的進化命運以及各自不同祖先來源的同源基因的差異表達情況。序列比對和進化分析表明, 甘藍(lán)型油菜中P5CS基因和OAT基因和其二倍體祖先的相對應(yīng)基因高度同源; 進化上, 和二倍體親本相比甘藍(lán)型油菜P5CS2基因發(fā)生了1個拷貝的丟失, 而OAT基因沒有基因丟失現(xiàn)象; 半定量RT-PCR結(jié)果表明, 甘藍(lán)型油菜中來自二倍體親本白菜和甘藍(lán)的P5CS2和OAT同源基因在所有檢測器官中均表達, 沒有發(fā)生基因沉默; 但是它們可能發(fā)生了亞功能化, 不同祖先來源的2個P5CS2同源基因存在較弱的偏向性表達, 不同器官的同源基因表達模式稍有不同; 而OAT基因明顯偏向于表達來自于甘藍(lán)祖先的同源基因, OAT的2個同源基因的不同器官表達模式基本一致; 鹽脅迫處理后, 來自于甘藍(lán)的BnaC.P5CS1.d表達量顯著高于來自于白菜的BnaA.P5CS1.a, 表明鹽處理條件下甘藍(lán)型油菜偏向性表達 BnaC.P5CS1.d。甘藍(lán)型油菜的脯氨酸合成基因 BnaA.P5CS1.a、BnaC.P5CS1.d及BnaA.P5CS2.a、BnaC.P5CS2.c的鹽誘導(dǎo)表達模式均基本保持了親本來源基因的特征。以上結(jié)果表明, 與二倍體祖先相比, 甘藍(lán)型油菜中脯氨酸合成基因序列和表達模式均存在高度保守性, 這可能說明了脯氨酸積累在進化上對植物的有利性。

甘藍(lán)型油菜; 脯氨酸合成; 多倍化; 偏向性表達; 亞功能化

在環(huán)境脅迫, 如干旱、鹽、重金屬、紫外線等條件下, 高等植物可以通過短時間內(nèi)迅速大量地積累脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 對自身起到保護作用,以此來增強植物對滲透脅迫的抵抗能力[1-5]。在脅迫條件下, 脯氨酸可以作為兼容性滲透調(diào)節(jié)劑、蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑、活性氧清除劑和氧化還原平衡劑[6-7]。并且近年來有研究發(fā)現(xiàn), 脯氨酸參與了開花及胚胎發(fā)育過程[8-11]。高等植物中, 脯氨酸由吡咯啉-5-羧酸(P5C)經(jīng)吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)催化合成, 根據(jù) P5C來源的不同, 脯氨酸合成分為谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑。谷氨酸途徑主要負(fù)責(zé)脅迫條件下脯氨酸的積累, 而鳥氨酸途徑主要在氮充足條件下起作用, 不參與脅迫情況下脯氨酸的積累[4,12]。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)催化谷氨酸途徑的第一步,是脯氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶[13-14]。擬南芥中吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)由 2個基因編碼(AtP5CS1, At2g39800; AtP5CS2, At3g55610), 其中AtP5CS1基因在大多數(shù)器官中表達, 受高鹽、干旱和ABA脅迫的誘導(dǎo), 但是在快速分裂的細(xì)胞組織中不表達[15]。而 AtP5CS2是看家基因, 在快速分裂的細(xì)胞系、分生組織和繁殖器官中表達[16]。鳥氨酸途徑的前體是鳥氨酸, 通過鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(δ-OAT)轉(zhuǎn)氨基作用催化鳥氨酸生成谷氨酸半醛(GSA), GSA自發(fā)環(huán)化成Δ1-二氫吡咯-5-羧酸(P5C), 然后通過P5C還原酶(P5CR)的作用生成脯氨酸[4]。

多倍化是植物進化過程中重要的動力, 許多作物經(jīng)歷了多倍化過程, 而多倍體能夠為新表型的出現(xiàn)提供原材料, 具有進化上的優(yōu)勢[17]。由于染色體重組和基因重排, 多倍化之后一些基因表達模式會發(fā)生變化, 某些基因甚至?xí)G失[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)人工合成的擬南芥四倍體的開花時間與重復(fù)基因FLOWERING LOCUS C (FLC) 的表達變化相關(guān)。擬南芥四倍體中來自Arabidopsis thaliana祖先的FLC表達上調(diào), 來自另一個祖先親本A. arenosa的FLC的表達下調(diào), 這種基因表達模式的變化導(dǎo)致擬南芥四倍體出現(xiàn)比2個親本開花時間都晚的晚花表型[19]。多倍化還可能導(dǎo)致基因沉默和同源基因的偏向表達。甘藍(lán)型油菜中, 來源于二倍體祖先甘藍(lán)的 BnPOX1能夠被核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的感染所誘導(dǎo), 而來源于白菜的同源基因則未被誘導(dǎo)[20]。

蕓薹屬(Brassica)植物作為一種非常好的模式植物體系, 常用于研究由多倍化引起的基因丟失、沉默和偏向表達, 我們利用禹氏三角模型來解釋蕓薹屬植物之間的進化關(guān)系[21]。甘藍(lán)型油菜(Bassica napus)是最新形成的異源四倍體, 來源于二倍體白菜(B. rapa)和甘藍(lán)(B. oleracea)的種間雜交, 并且經(jīng)歷了染色體加倍的過程[22]。而白菜、甘藍(lán)和擬南芥起源于一個共同的祖先, 大概在 14.5～20.4百萬年之前, 這個祖先分化為擬南芥和白菜、甘藍(lán)的祖先[23]。比較物理圖譜研究表明, 白菜和甘藍(lán)的祖先經(jīng)歷了三倍化和基因重排的過程[24]。而白菜基因組測序數(shù)據(jù)也表明, 白菜中大多數(shù)基因具有 2～3個同源基因[25]。那么, 我們推測甘藍(lán)型油菜中同源基因拷貝數(shù)最多應(yīng)該多至6個。有報道稱, 甘藍(lán)型油菜中基因拷貝數(shù)目可能由于進化過程中基因丟失而減少, 從而使甘藍(lán)型油菜中基因平均拷貝數(shù)為4個[26]。

脅迫條件下脯氨酸積累是一個非常保守且有效的過程, 然而迄今為止我們?nèi)圆磺宄谋扼w中脯氨酸代謝相關(guān)基因的進化模式及其和二倍體祖先脯氨酸代謝相關(guān)基因的關(guān)系。我們前期研究發(fā)現(xiàn), 甘藍(lán)型油菜中含有6個脯氨酸合成途徑關(guān)鍵基因P5CS1,即該基因沒有發(fā)生丟失, 并且不同器官中和脅迫誘導(dǎo)情況下不同來源的P5CS1基因表達模式不同[27]。本文中, 我們集中研究了甘藍(lán)型油菜中脯氨酸合成代謝相關(guān)基因進化命運, 包括與二倍體親本物種的基因序列差異和重復(fù)同源基因的表達模式差異。研究結(jié)果能夠加深多倍化對脯氨酸代謝相關(guān)基因影響的理解, 為多倍體表型和重復(fù)基因調(diào)控的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和無菌苗培養(yǎng)

甘藍(lán)型油菜 Brassica napus L. cv. Westar, 為加拿大的雙低春油菜品種。甘藍(lán)型油菜種子由加拿大卡爾加里大學(xué)(University of Calgary)的 Maurice MOLONEY博士, Ed YEUNG博士和唐明娟博士惠贈。白菜(B. rapa cv. Zhongbai 60)和甘藍(lán)(B. oleracea cv. Zhonggan 21)種子均購買自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 經(jīng)實驗室自交純化。選取飽滿種子, 經(jīng)70%乙醇浸泡30 s, 10%次氯酸鈉處理15 min, 無菌水洗滌7～8次, 轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基, 培養(yǎng)箱生長條件為25℃, 16/8 h光周期。

1.2 植物材料的鹽脅迫處理

于不含 NaCl的 MS培養(yǎng)基上播種, 生長3周,轉(zhuǎn)移到新的燒杯中, 在含250 mmol L–1NaCl的MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng), 處理0、6、12、24和48 h后整株取樣, 每種處理 3個生物學(xué)重復(fù), 每個重復(fù)至少包含 6株幼苗。取樣后, 將幼苗立即以液氮速凍保存于–80℃冰箱。

1.3 基因序列分析

白菜和甘藍(lán)的相應(yīng)基因序列由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所王曉武研究員提供, 并且通過數(shù)據(jù)庫(http://www.brassica.info/; http://www.ocri-genomics. org/bolbase/index.html)檢索和比對確認(rèn)。甘藍(lán)型油菜基因序列來自于甘藍(lán)型油菜基因組序列數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)。應(yīng)用DNAMAN 8軟件(Lynnon Biosoft, Vaudreuil, Quebec, Canada)進行核酸序列比對分析。通過同源基因的基因組DNA序列比對和序列分析, 用MEGA4軟件中鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[28]。

1.4 基因差異表達分析

采用LiCl-SDS方法提取總RNA[29], 用DNase I (TaKaRa, 中國大連)去除總RNA中可能存在的基因組 DNA 污染, 通過 Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。

半定量 RT-PCR采用 10 ng cDNA作為模板, 1×PCR緩沖液, 0.25 mmol L–1dNTPs, 0.25 μmol L–1正向和反向引物(表 1), 0.5 U的 Taq DNA聚合酶(Qiagen, Valencia, CA, USA), 用 ddH2O補足至 20 μL。PCR擴增程序為94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 28個循環(huán); 72℃延伸10 min。PCR結(jié)束后, 經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離, 并用嗅化乙錠(EB)染色觀察。

表1 半定量RT-PCR引物序列Table 1 Primers for semi-quantitive RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜中脯氨酸合成代謝相關(guān)重復(fù)基因

2.1.1 白菜、甘藍(lán)、油菜中的 P5CS基因 通過數(shù)據(jù)庫序列比對和分析表明, 白菜中存在 2個P5CS2的同源基因(http://www.brassica.info/) (ChrA9, Bra007179; ChrA4 Bra014742), 甘藍(lán)中存在 2個P5CS2基因 (http://www.ocri-genomics.org/bolbase/ index.html) (Bol044364, Bol044229), 甘藍(lán)型油菜中存在 3個 P5CS2基因(ChrA8, NM_001315755.1; ChrA4, XM_013886902.1; ChrC8, XM_013800452.1) (http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)。根據(jù)系統(tǒng)命名法則[30], 將白菜的2個同源P5CS2基因分別命名為BraA.P5CS2.a和BraA.P5CS2.b, 這2個基因的cDNA編碼區(qū)長度分別為2184 bp和2181 bp, 與BraA.P5CS2.a的cDNA編碼區(qū)相比, BraA.P5CS2.b的起始密碼子后缺失了3個堿基(圖1-A)。將甘藍(lán)中的2個BoP5CS2基因分別命名為BolC.P5CS2.a和BolC.P5CS2.b, 它們的 cDNA 編碼區(qū)長度分別為2184 bp和2181 bp, 與BolC.P5CS2.b的編碼區(qū)比較, BolC.P5CS2.a在起始密碼子后發(fā)生了堿基序列缺失(圖1-A)。將甘藍(lán)型油菜的3個BnP5CS2基因分別命名為 BnaA.P5CS2.a、BnaA.P5CS2.b和 BnaC. P5CS2.c, cDNA編碼區(qū)長度分別為 2184、2181和2184 bp, 與 BnaA.P5CS2.a和 BnaC.P5CS2.c相比, BnaA.P5CS2.b起始密碼子之后發(fā)生了3個堿基的缺失(圖1-A)。

2.1.2 白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜中OAT基因 基因組測序結(jié)果表明, 白菜中存在 1個 OAT基因(Bra025033), 位于白菜第 6染色體上, 被命名為BraA.OAT.a, 該基因的 cDNA編碼區(qū)長度為 1434bp。甘藍(lán)中存在 1個 OAT基因, 被命名為BolC.OAT.a, 該基因的編碼區(qū)長度為 1431 bp。與BolC.OAT.a相比, 基因BolC.OAT.b的編碼區(qū)出現(xiàn)3個堿基的缺失。甘藍(lán)型油菜中存在2個BnOAT基因, 分別被命名為 BnaA.OAT.a和 BnaC.OAT.b, cDNA編碼區(qū)長度分別為 1434 bp和 1431 bp, 與BnaC.OAT.b相比, BnaA.OAT.a同樣出現(xiàn)了3個堿基的缺失(圖1-B)。

2.2 脯氨酸合成酶基因的同源性和進化關(guān)系

2.2.1 P5CS基因的同源性和進化關(guān)系 甘藍(lán)型油菜基因組中含有的3個P5CS2基因, 為研究其祖先來源, 即這 3個基因在甘藍(lán)型油菜染色體加倍過程中來自白菜基因組還是甘藍(lán)基因組, 我們將 3個基因分別和白菜及甘藍(lán)的P5CS2基因的基因組序列和編碼區(qū)(CDS)序列兩兩比對(表 2)。同時, 將甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)和擬南芥的同源P5CS2基因的基因組DNA序列作多重比對, 構(gòu)建了該基因的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2)。

圖1 白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜的同源基因部分差異序列比對Fig. 1 Alignment of partial sequence of homologous genes in B. rapa, B. oleracea, and B. napus

表2 甘藍(lán)型油菜BnP5CS2基因與二倍體親本白菜和甘藍(lán)P5CS2基因序列相似性Table 2 Sequence identities of P5CS2 genes among B. napus, diploid ancestors B. rapa and B. oleracea (%)

BnaA.P5CS2.a與BraA.P5CS2.a, BnaA.P5CS2.b與BraA.P5CS2.b, BnaC.P5CS2.c與BolC.P5CS2.a之間的基因組DNA相似性分別為92.9、95.6和93.2,而他們之間編碼區(qū)相似性更高, 分別為 98.4、99.3和 99.0, 無論是基因組序列還是編碼區(qū)序列均高于同系列其他比對(表 2)。因此, 我們推斷 BnaA. P5CS2.a、BnaA.P5CS2.b和BnaC.P5CS2.c可能分別來源于BraA.P5CS2.a、BraA.P5CS2.b和BolC.P5CS2.a。

而基于相對應(yīng)的基因組序列的進化關(guān)系分析表明 BnaA.P5CS2.a、BnaA.P5CS2.b和 BnaC.P5CS2.c分別為白菜 BraA.P5CS2.a、BraA.P5CS2.b和甘藍(lán)BolC.P5CS2.a的直向同源基因(圖2)。

圖2 蕓薹屬植物P5CS2基因進化關(guān)系分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of Brassica P5CS2 genes

2.2.2 OAT基因的同源性和進化關(guān)系 甘藍(lán)型油菜基因組中含有2個同源的OAT基因, 為了研究其祖先來源, 將其分別和白菜及甘藍(lán)的OAT基因基于基因組序列和編碼區(qū)(CDS)序列兩兩比對(表 3)。同時, 將甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)和擬南芥的所有已知序列的同源OAT基因的基因組DNA序列作多重比對, 構(gòu)建了該基因的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3)。

BnaA.OAT.a和 BraA.OAT.a, BnaC.OAT.b 和BolC.OAT.a基因組 DNA序列相似性高達 95.3%和 99.6% (表3), 而他們之間編碼區(qū)相似性分別為98.2和99.7 (表3), 無論是基因組序列還是編碼區(qū)序列均高于同系列其他比對, 我們推測 BnaA.OAT.a和BnaC.OAT.b 可能分別來源于 BraA.OAT.a 和BolC.OAT.a。而基于相對應(yīng)的基因組序列的進化關(guān)系分析也表明BnaA.OAT.a和BnaC.OAT.b分別為白菜 BraA.OAT.a和甘藍(lán) BolC.OAT.a的直向同源基因(圖3)。

2.3 甘藍(lán)型油菜不同器官中脯氨酸合成相關(guān)同源基因的差異表達

半定量 RT-PCR結(jié)果表明, 甘藍(lán)型油菜的P5CS2和OAT同源基因在所有器官中均表達(圖4)。說明在不同發(fā)育階段中, 所檢測的不同祖先來源的4個同源基因都沒有發(fā)生基因沉默。

圖4表明, 甘藍(lán)型油菜中2個不同祖先來源的P5CS2同源基因存在較弱的偏向性表達, 甘藍(lán)型油菜幼葉中來自白菜的拷貝(BnaA.P5CS2.a)表達較高,其他器官中2個拷貝表達量相近。同時, 這2個同源基因器官特異性表達的模式也稍有不同, BnaA.P5CS2.a在幼葉和花苞中表達量最高, 而BnaC.P5CS2.c在花和花苞中表達量最高。而甘藍(lán)型油菜的不同祖先來源的2個OAT同源基因存在明顯的偏向表達, 在所有器官中, 來自甘藍(lán)的基因表達量高于來自白菜的拷貝。但是, 不同祖先來源的OAT的 2個同源基因的表達模式基本一致, 都是在花器官中表達量最高(圖4)。

2.4 鹽脅迫下甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)的脯氨酸代謝相關(guān)同源基因差異表達情況

表3 甘藍(lán)型油菜中OAT基因的基因組片段與二倍體祖先中相對應(yīng)的基因核苷酸序列相似性Table 3 Sequence identities of OAT genes between B. napus and its diploid ancestors B. rapa and B. oleracea (%)

甘藍(lán)型油菜中 P5CS1的表達情況如圖 5所示,在250 mmol L–1NaCl處理條件下, BnaA.P5CS1.a和BnaC.P5CS1.d的表達均受鹽脅迫誘導(dǎo), 但是BnaC.P5CS1.d的誘導(dǎo)更快, 基因表達量在6 h達到最大值。通過比較不同時間點的表達量還發(fā)現(xiàn), 鹽脅迫處理后, BnaC.P5CS1.d表達量顯著高于BnaA.P5CS1.a, 表明鹽處理條件下甘藍(lán)型油菜偏向性表達BnaC.P5CS1.d。

之前的研究結(jié)果表明, 甘藍(lán)型油菜基因BnaA.P5CS1.a來源于 BraA.P5CS1.a, 而 BnaC. P5CS1.d來源于 BolC.P5CS1.a, 所以分別檢測了BraA.P5CS1.a和BolC.P5CS1.a在二倍體白菜和甘藍(lán)中的鹽脅迫誘導(dǎo)表達情況。如圖 5所示, 白菜的BraA.P5CS1.a的表達受鹽脅迫誘導(dǎo), 表達量在12 h達到最大值。甘藍(lán)的 BolC.P5CS1.a表達受鹽脅迫誘導(dǎo), 表達量在 6 h達到最大值。因此, BolC. P5CS1.a受鹽脅迫誘導(dǎo)的速率快于BraA.P5CS1.a。而BnaC.P5CS1.d受鹽脅迫誘導(dǎo)的速率也快于BnaA. P5CS1.a (圖 5), 我們認(rèn)為甘藍(lán)型油菜的 BnaA. P5CS1.a和 BnaC.P5CS1.d在鹽誘導(dǎo)基因表達速率方面均保持了其二倍體親本來源基因的特征。

甘藍(lán)型油菜 Bna.P5CS2.a的表達量在鹽處理后2 h后開始上調(diào), 表達水平一直保持到24 h, BnaC. P5CS2.c的表達量不受鹽誘導(dǎo)。而二倍體祖先親本基因中, 甘藍(lán)的BolC.P5CS2.b表達不受鹽處理的影響,白菜的BraA.P5CS2.a在鹽處理后6 h和12 h微弱上調(diào)(圖 5)。因此, 鹽處理條件下, 甘藍(lán)型油菜 BnaA. P5CS2.a和BnaC.P5CS2.c的鹽誘導(dǎo)表達模式均基本保持了親本來源基因的特征。

圖3 蕓薹屬植物OAT基因進化關(guān)系分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of Brassica OAT genes

圖4 甘藍(lán)型油菜不同祖先來源的P5CS2和OAT基因在不同器官中的表達模式Fig. 4 Expression pattern for P5CS2 and OAT from different diploid ancestors in different organs of B. napus

圖5 250 mmol L–1NaCl脅迫下甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)的P5CS1和P5CS2的表達模式Fig. 5 Expression pattern of P5CS1 and P5CS2 in B. napus, B. rapa, and B. oleracea under 250 mmol L–1NaCl

3 討論

3.1 甘藍(lán)型油菜的 P5CS2基因發(fā)生了一個拷貝的丟失

甘藍(lán)型油菜(B. napus)起源于白菜(B. rapa)和甘藍(lán)(B. oleracea)的雜交, 并且經(jīng)過了染色體加倍, 而其祖先白菜和甘藍(lán)自身也經(jīng)歷了基因組三倍化和重排[22], 這樣我們推測甘藍(lán)型油菜中每個基因最多可以達到6個。然而研究發(fā)現(xiàn), 由于基因丟失現(xiàn)象的存在, 甘藍(lán)型油菜中同源基因的拷貝數(shù)平均為4個[26]。研究表明, 甘藍(lán)型油菜中存在3個ALCATRAZ (ALC)基因[32], 3個 GPAT4 (sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase 4)基因, 以及 3個來源于白菜另外 3個來源于甘藍(lán)的6個PSY (phytoene synthase)基因[32],而我們之前的研究發(fā)現(xiàn), 甘藍(lán)型油菜中存在 6個P5CS1基因[27]。本研究中, 甘藍(lán)型油菜中存在 3個P5CS2基因, 而其祖先白菜和甘藍(lán)中各存在 2個P5CS2基因, 進化過程中甘藍(lán)型油菜發(fā)生了 P5CS2基因一個拷貝的丟失, 根據(jù)序列比對和進化分析結(jié)果, 我們推測來自于二倍體祖先甘藍(lán)的P5CS2基因的一個拷貝發(fā)生丟失。甘藍(lán)型油菜中存在2個OAT基因, 其祖先白菜和甘藍(lán)中各存在 1個 OAT基因,甘藍(lán)型油菜中OAT基因沒有發(fā)生丟失。

3.2 甘藍(lán)型油菜中脯氨酸代謝相關(guān)基因與二倍體親本來源基因高度同源

根據(jù)白菜和甘藍(lán)全基因組測序結(jié)果, 白菜和甘藍(lán)中P5CS1、P5CS2和OAT同源基因拷貝數(shù)都分別為3、2和1, 而甘藍(lán)型油菜中拷貝數(shù)為6、3和2。序列比對結(jié)果表明, 甘藍(lán)型油菜脯氨酸代謝途徑相關(guān)基因均和其親本白菜和甘藍(lán)來源的基因高度同源, P5CS1、P5CS2和OAT同源基因和親本來源基因的基因組 DNA同源性分別為 96%～100%、92.9%～95.6%和95.3%～99.6%。其中BnaC.P5CS1.d基因組DNA序列和親本基因序列完全相同, 說明這些基因在甘藍(lán)型油菜進化過程中高度保守, 即使進化上相對不保守的內(nèi)含子序列也沒有發(fā)生變異。這和之前的甘藍(lán)型油菜基因克隆的相關(guān)研究報道一致, 甘藍(lán)型油菜中克隆到3個PISTILLATA基因, 兩兩序列相似性為 96.49%～98.72%[33]。脯氨酸合成途徑上不同基因拷貝數(shù)的不同或許說明這些基因在進化上的重要性不同。

3.3 甘藍(lán)型油菜中脯氨酸代謝同源基因表達模式發(fā)生分化

研究認(rèn)為, 重復(fù)基因在進化中會有功能喪失(non-functionalization)、亞功能化(subfunctionalization)和新功能化(neo-functionalization) 3種命運, 而亞功能化是重復(fù)基因在進化過程中的重要模式[35]。研究發(fā)現(xiàn)棉花(Gossypium hirsutum)中來源于不同親本的2個乙醇脫氫酶A (adhA)在非生物脅迫處理和不同器官中均表現(xiàn)出表達模式的分化[35]。本研究發(fā)現(xiàn), 甘藍(lán)型油菜脯氨酸合成途徑基因 BnP5CS1(BnaA.P5CS1.a 和 BnaC.P5CS1.d)和 BnP5CS2 (BnaA.P5CS2.a和BnaC.P5CS2.c)的表達模式出現(xiàn)分化, 表現(xiàn)在基因?qū)}脅迫的響應(yīng)和在不同器官中的偏向表達。鹽脅迫下, BnaA.P5CS1.a的誘導(dǎo)速率比BnaC.P5CS1.d快; 正常生長條件下, BnaC.P5CS1.d在幼葉中表達量最高, 而BnaA.P5CS1.a在莖中表達量較高。鹽處理下, BnaA.P5CS2.a表達上調(diào)而BnaC.P5CS2.c表達不變; 正常條件下, BnaA. P5CS2.a在幼葉中表達量最高, 而BnaC.P5CS2.c在花和花苞中表達量較高。

鹽處理條件下, 甘藍(lán)型油菜中P5CS2同源基因來自于白菜的一個拷貝被誘導(dǎo), 另一個來自于甘藍(lán)的拷貝不被誘導(dǎo)。這與之前的過氧化物酶(POX1)的研究結(jié)果類似, 感染病菌后, 甘藍(lán)型油菜中來自甘藍(lán)(B. oleracea)的過氧化物酶基因表達量增加, 而來自白菜(B. rapa)的過氧化物酶基因幾乎不受影響[20]。脅迫條件下這種表達模式在同源基因之間分化, 可能有利于基因功能特異性和多樣性的維持, 從而提高多倍體的適應(yīng)環(huán)境的能力。

與基因P5CS1和P5CS2相比, 脯氨酸合成途徑的OAT基因(BnaA.OAT.a和BnaC.OAT.b)在不同器官中的表達模式?jīng)]有分化, 均在花器官中表達量最高。BnaA.OAT.a和 BnaC.OAT.b在甘藍(lán)型油菜中可能相互協(xié)調(diào), 在發(fā)育過程中發(fā)揮相似的功能。

3.4 甘藍(lán)型油菜BnP5CS1和BnP5CS2同源基因保留親本來源基因的表達模式

甘藍(lán)型油菜 BnaA.P5CS1.d受鹽脅迫誘導(dǎo)表達上調(diào)的速率快于 BnaA.P5CS1.a, 2個基因的表達量分別在鹽處理后6 h和12 h最高, 鹽誘導(dǎo)基因表達的速率均保持了其二倍體親本來源基因的特征。甘藍(lán)型油菜 BnaA.P5CS2.a基因表達量受鹽脅迫誘導(dǎo)微弱上調(diào), 而BnaC.P5CS2.c表達不受鹽處理的影響,這 2個基因均保持了親本來源基因?qū)}脅迫的響應(yīng)。這種現(xiàn)象在文獻中曾有報道, Zhao等[20]比較研究了甘藍(lán)型油菜中的兩種過氧化物酶(POX1和POX2)和親本白菜及甘藍(lán)中基因的表達模式, 結(jié)果表明在生物脅迫條件下, 2個POX2基因在不同器官中的表達模式都和親本中的基因一樣, 而2個POX1基因在不同器官中的表達模式和親本來源基因不一致, 發(fā)生了變化。甘藍(lán)型油菜中的P5CS1同源基因(BnaA.P5CS1.a和BnaC.P5CS1.d)和P5CS2同源基因(BnaA.P5CS2.a和BnaC.P5CS2.c)都保持了親本來源基因鹽脅迫下的誘導(dǎo)模式, 說明了這些基因在多倍化過程中的功能保守性。

4 結(jié)論

甘藍(lán)型油菜中脯氨酸代謝途徑基因(P5CS和OAT)存在多個拷貝, 它們和其二倍體親本白菜及甘藍(lán)的對應(yīng)基因序列高度相似; 和親本相比, 甘藍(lán)型油菜的P5CS2基因來自二倍體祖先甘藍(lán)的一個拷貝丟失, 而 OAT基因沒有發(fā)生丟失; 鹽脅迫下, 甘藍(lán)型油菜P5CS1和P5CS2基因的誘導(dǎo)模式都和親本中的祖先基因誘導(dǎo)模式一致, 說明甘藍(lán)型油菜進化中該基因鹽誘導(dǎo)模式的保守性。

致謝: 感謝Calgary大學(xué)的Maurice MOLONEY博士,Ed YEUNG博士和唐明娟博士提供甘藍(lán)型油菜(B. napus L. cv. Westar)種子, 感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所王曉武研究員提供白菜和甘藍(lán)的 P5CS基因和OAT基因的相關(guān)序列信息。

[1] Kishor P B K, Hong Z L, Miao G H, Hu C A A, Verma D P S. Overexpression of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol, 1995, 108: 1387–1394

[2] Schat H, Sharma S S, Vooijs R. Heavy metal-induced accumulation of free proline in a metal-tolerant and a nontolerant ecotype of Silene vulgaris. Physiol Plant, 1997, 101: 477–482

[3] Yang S L, Lan S S, Gong M. Hydrogen peroxide-induced proline and metabolic pathway of its accumulation in maize seedlings. J Plant Physiol, 2009, 166: 1694–1699

[4] Tavakoli M, Poustini K, Alizadeh H. Proline accumulation and related genes in wheat leaves under salinity stress. J Agric Sci Tech, 2016, 18: 707–716

[5] Dar M I, Naikoo M I, Rehman F, Naushin F, Khan F A. Proline accumulation in plants: roles in stress tolerance and plant development. In: Iqbal N, Nazar R, Khan N A, eds. Osmolytes and Plants Acclimation to Changing Environment: Emerging Omics Technologies. New Delhi: Springer India Press, 2016. pp 155–166

[6] Chaves M M, Flexas J, Pinheiro C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Ann Bot, 2009, 103: 551–560

[7] Wu H H, Zou Y N, Rahman M M, Ni Q D, Wu Q S. Mycorrhizas alter sucrose and proline metabolism in trifoliate orange exposed to drought stress. Sci Rep, 2017, 7: 42389

[8] Mattioli R, Marchese D, D’Angeli S, Altamura M M, Costantino P, Trovato M. Modulation of intracellular proline levels affects flowering time and inflorescence architecture in Arabidopsis. Plant Mol Biol, 2008, 66: 277–288

[9] Mattioli R, Costantino P, Trovato M. Proline accumulation in plants: not only stress. Plant Signal Behav, 2009, 4: 1016–1018

[10] Mattioli R, Falasca G, Sabatini S, Altamura M M, Costantino P, Trovato M. The proline biosynthetic genes P5CS1 and P5CS2 play overlapping roles in Arabidopsis flower transition but not in embryo development. Physiol Plant, 2009, 137: 72–85

[11] Funck D, Winter G, Baumgarten L, Forlani G. Requirement of proline synthesis during Arabidopsis reproductive development. BMC Plant Biol, 2012, 12: 191

[12] Delauney A J, Hu C A A, Kishor P B K, Verma D P S. Cloning of ornithine delta-aminotransferase cDNA from Vigna-Aconitifolia by transcomplementation in Escherichia coli and regulation of proline biosynthesis. J Biol Chem, 1993, 268: 18673–18678

[13] Kishor P B K, Sangam S, Amrutha R N, Laxmi P S, Naidu K R, Rao K R S S, Rao S, Reddy K J, Theriappan P, Sreenivasulu N. Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: its implications in plant growth and abiotic stress tolerance. Curr Sci India, 2005, 88: 424–438

[14] Wang L, Guo Z, Zhang Y, Wang Y, Yang G, Yang L, Wang R, Xie Z. Characterization of LhSorP5CS, a gene catalyzing proline synthesis in Oriental hybrid lily Sorbonne: molecular modelling and expression analysis. Bot Stud, 2017, 58(1): 10

[15] Yoshiba Y, Kiyosue T, Katagiri T, Ueda H, Mizoguchi T, Yamaguchishinozaki K, Wada K, Harada Y, Shinozaki K. Correlation between the induction of a gene for Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase and the accumulation of proline in Arabidopsis thaliana under osmotic-stress. Plant J, 1995, 7: 751–760

[16] Fabro G, Kovacs I, Pavet V, Szabados L, Alvarez M E. Proline accumulation and AtP5CS2 gene activation are induced by plant-pathogen incompatible interactions in Arabidopsis. Mol Plant Microbe In, 2004, 17: 343–350

[17] Soltis P S, Soltis D E. The role of genetic and genomic attributes in the success of polyploids. Proc Nati Acad Sci USA, 2000, 97: 7051–7057

[18] Buggs R J, Doust A N, Tate J A, Koh J, Soltis K, Feltus F A, Paterson A H, Soltis P S, Soltis D E. Gene loss and silencing in Tragopogon miscellus (Asteraceae): comparison of natural and synthetic allotetraploids. Heredity, 2009, 103: 73–81

[19] Wang J, Tian L, Lee H S, Chen Z J. Nonadditive regulation of FRI and FLC loci mediates flowering-time variation in Arabidopsis allopolyploids. Genetics, 2006, 173: 965–974

[20] Zhao J W, Buchwaldt L, Rimmer S R, Brkic M, Bekkaoui D, Hegedus D. Differential expression of duplicated peroxidase genes in the allotetraploid Brassica napus. Plant Physiol Bioch, 2009, 47: 653–656

[21] Nagahara U. Genome analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of B. napus and peculiar mode of fertilisation. J Jpn Bon, 1935, 7: 389–452

[22] Blanc G, Wolfe K H. Functional divergence of duplicated genes formed by polyploidy during Arabidopsis evolution. Plant Cell, 2004, 16: 1679–1691

[23] Yang Y W, Lai K N, Tai P Y, Li W H. Rates of nucleotide substitution in angiosperm mitochondrial DNA sequences and dates of divergence between Brassica and other angiosperm lineages. J Mol Evol, 1999, 48: 597–604

[24] Park J Y, Koo D H, Hong C P, Lee S J, Jeon J W, Lee S H, Yun P Y, Park B S, Kim H R, Bang J W, Plaha P, Bancroft I, Lim Y P. Physical mapping and microsynteny of Brassica rapa ssp. pekinensis genome corresponding to a 222 kbp gene-rich region of Arabidopsis chromosome 4 and partially duplicated on chromosome 5. Mol Genet Genom, 2005, 274: 579–588

[25] Wang X, Wang H, Wang J, Sun R, Wu J, Liu S, Bai Y, Mun J H, Bancroft I, Cheng F, Huang S, Li X, Hua W, Freeling M, Pires J C, Paterson A H, Chalhoub B, Wang B, Hayward A, Sharpe A G, Park B S, Weisshaar B, Liu B, Li B, Tong C, Song C, Duran C, Peng C, Geng C, Koh C, Lin C, Edwards D, Mu D, Shen D, Soumpourou E, Li F, Fraser F, Conant G, Lassalle G, King G J, Bonnema G, Tang H, Belcram H, Zhou H, Hirakawa H, Abe H, Guo H, Jin H, Parkin I A, Batley J, Kim J S, Just J, Li J, Xu J, Deng J, Kim J A, Yu J, Meng J, Min J, Poulain J, Hatakeyama K, Wu K, Wang L, Fang L, Trick M, Links M G, Zhao M, Jin M, Ramchiary N, Drou N, Berkman P J, Cai Q, Huang Q, Li R, Tabata S, Cheng S, Zhang S, Sato S, Sun S, Kwon S J, Choi S R, Lee T H, Fan W, Zhao X, Tan X, Xu X, Wang Y, Qiu Y, Yin Y, Li Y, Du Y, Liao Y, Lim Y, Narusaka Y, Wang Z, Li Z, Xiong Z, Zhang Z. The genome of the mesopolyploid crop speciesBrassica rapa. Nat Genet, 2011, 43: 1035–1039

[26] Udall J A, Wendel J F. Polyploidy and crop improvement. Crop Sci, 2006, 46: S3–S14

[27] Wang C P, Lin B, Zhang Y Q, Lin Y H, Liu A H, Hua X J. The evolutionary fate of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase 1 (P5CS1) genes in allotetraploid Brassica napus. J Syst Evol, 2014, 52: 566–579

[28] Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol, 2007, 24: 1596–1599

[29] Hua X J, van de Cotte B, Van Montagu M, Verbruggen N. The 5 ' untranslated region of the At-P5R gene is involved in both transcriptional and post-transcriptional regulation. Plant J, 2001, 26: 157–169

[30] ?stergaard L, King G J. Standardized gene nomenclature for the Brassica genus. Plant Methods, 2008, 4: 10

[31] Hua S, Shamsi I H, Guo Y, Pak H, Chen M, Shi C, Meng H, Jiang L. Sequence, expression divergence, and complementation of homologous ALCATRAZ loci in Brassica napus. Planta, 2009, 230: 493–503

[32] Cardenas P D, Gajardo H A, Huebert T, Parkin I A, Iniguez-Luy F L, Federico M L. Retention of triplicated phytoene synthase (PSY) genes in Brassica napus L. and its diploid progenitors during the evolution of the Brassiceae. Theor Appl Genet, 2012, 124: 1215–1228

[33] Deng W, Zhou L, Zhou Y T, Wang Y J, Wang M L, Zhao Y. Isolation and characterization of three duplicated PISTILLATA genes in Brassica napus. Mol Biol Rep, 2011, 38: 3113–3120

[34] Force A, Lynch M, Pickett F B, Amores A, Yan Y L, Postlethwait J. Preservation of duplicate genes by complementary, degenerative mutations. Genetics, 1999, 151: 1531–1545

[35] Adams K L, Liu Z L. Expression partitioning between genes duplicated by polyploidy under abiotic stress and during organ development. Curr Biol, 2007, 17: 1669–1674

Evolutionary Fate and Expression Pattern of Genes Related to Proline Biosynthesis in Brassica napus

WANG Cui-Ping1, HUA Xue-Jun2,*, LIN Bin3, and LIU Ai-Hua4
1State Key Laboratory of Seedling Bioengineering, Ningxia Forestry Institute, Yinchuan 750004, China;2Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China;3University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;4Department of Plant Science, University of Manitoba, Winnipeg, R3T2N2, MB, Canada

Proline accumulation is a widespread metabolic adaptation in many organisms in response to various environmental stresses, and it was proved to play protective roles for plants under adverse conditions. Polyploidization is a prominent driving force during plant evolution and many important crops have experienced this process during their evolutionary history. Brassica napus (AACC) is believed to be a newly formed allotetraploid, evolving from the inter-specific hybridization of two diploids, B. rapa (AA) and B. oleracea (CC) followed by chromosome doubling. In this research, we studied the evolutionary fate of genes related to proline synthesis in allotetraploid (B. napus), and its diploids ancestors (B. rapa and B. oleracea), to explore the effect of polyploidition on homologous gene evolution. First, we obtained the genes for proline biosynthesis (P5CSs, OAT) by database searching, and studied the similarities and the expression regulation pattern of homologous genes in allotetraploid (B. napus), in comparison with its diploids progenitors (B. rapa and B. oleracea), in different organs and in response to salt stress. Sequence analysis and phylogenetic analysis revealed that BnaA.P5CS2.a, BnaA.P5CS2.b, and BnaC.P5CS2.c originated from BraA.P5CS2.a, BraA.P5CS2.b, and BolC.P5CS2.a, respectively; BnaA.OAT.a, BnaC.OAT.b originated from BraA.OAT.a and BolC.OAT.a, respectively. And, one copy of gene loss from B. oleracea occurred for BnP5CS2 but not for BnOAT. Expressionpatterns of these homologous genes in response to salt stress in different organs were also characterized by semi-quantitive RT-PCR. In B. napus, two homologous gene pairs with different origins, BnaA.P5CS2.a and BnaC.P5CS2.c, BnaA.OAT.a and BnaC.OAT.b exhibited biased expression in different organs, implying possible sub-functionalization of P5CS2 and OAT. The genes BnaA.P5CS1.a and BnaC.P5CS1.d with different diploid ancestors were induced by NaCl treatment, and the expression of BnaC.P5CS1.d was higher than that of BnaA.P5CS1.a, showing a biased expression. RT-PCR manifested that preservation of expression pattern of original genes in diploid was found for P5CS1 (BnaA.P5CS1.a and BnaC.P5CS1.d), P5CS2 (BnaA.P5CS2.a and BnaC.P5CS2.c). These results suggest that the gene sequence and expression pattern existing in allotetraploid (B. napus) were conserved, which is benefit to proline accumulation for plant adaptation to environmental stresses.

Polyploidization; Proline biosynthesis; Biased expression; Salt stress; Sub-functionalization

(

): 2017-01-17; Accepted(接受日期): 2017-05-10; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-05-22.

10.3724/SP.J.1006.2017.01480

本研究由寧夏自然科學(xué)基金項目(NZ16215)資助。

The study was supported by the Ningxia Natural Science Foundation of China (NZ16215).

*通訊作者(Corresponding author): 華學(xué)軍, E-mail: xjhua@ibcas.ac.cn

聯(lián)系方式: E-mail: wangcuipingcas@163.com

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170522.0916.006.html