張 楊,吳仁人,張一敏,武兵文,吳孝情,陳中穎,李開明(1.武漢理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 武漢 430070；2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 廣州 106；3.廣東省水與大氣污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 106；4.武漢科技大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 武漢 430081；.浙江工商大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州 310000)

珠三角河網(wǎng)地區(qū)糞便污染源解析

張 楊1,2,吳仁人2,3*,張一敏1,4*,武兵文5,吳孝情2,3,陳中穎2,3,李開明2,3(1.武漢理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 武漢 430070；2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 廣州 510655；3.廣東省水與大氣污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510655；4.武漢科技大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 武漢 430081；5.浙江工商大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州 310000)

準(zhǔn)確識別水體中微生物污染物的宿主來源是進(jìn)行針對性污染治理的基礎(chǔ).應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)篩選出適用于珠江三角洲河網(wǎng)地區(qū)的宿主特異性擬桿菌引物,并結(jié)合總細(xì)菌引物(BACT1369F/PROK1541R)、大腸埃希氏菌引物(EC23S857F/ EC23S857R)、擬桿菌通用引物(GenBac3F/GenBac3R)及糞大腸菌群(Fecal coliform)和大腸埃希氏菌(Escherichia coli)等常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)對研究區(qū)域的水體進(jìn)行分析,結(jié)果表明:人源(qHS601F/qBac725R)、牛源(BacB2-590F/Bac708Rm)、豬源(Bac41F/Bac163R)及雞源(qC160F-HU/qBac265R-HU)特異性擬桿菌引物在珠江三角洲地區(qū)同時(shí)具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性,適用于目標(biāo)研究區(qū)域.選取的 14處城市地表水均受到糞便污染,污染源分別為人、反芻動(dòng)物和禽類糞便.水體中各污染源強(qiáng)度為人源＞反芻動(dòng)物＞雞源,其中人源特異性擬桿菌濃度與糞大腸菌群(Faecal coliform)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)及大腸埃希氏菌引物(EC23S857F/ EC23S857R)濃度具有較好的相關(guān)性(P＜0.05),說明人糞是各地表水中微生物污染的主要貢獻(xiàn)源.

實(shí)時(shí)熒光定量PCR；微生物污染；擬桿菌；特異性引物；珠江三角洲地區(qū)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展及城鎮(zhèn)人口的增加,市政污水的排放給自然環(huán)境帶來了極大的壓力.盡管加大了市政污水排放的管控力度,使其對環(huán)境的污染有了較大改觀,但市政污水造成的點(diǎn)源及面源污染仍然使一些城市河流、湖泊的水質(zhì)逐漸惡化.其中,隨市政污水排入水體中的糞便污染源又是威脅人類健康的主要原因.例如,2011年廣東省各檢測點(diǎn)對廣東省各個(gè)地區(qū)所發(fā)生的水源性疾病統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,報(bào)告的39316例病例中,其他感染性腹瀉病 35164例,所占比例高達(dá)89.44%;細(xì)菌性痢疾2794例,占7.11%[1].因此,對糞便污染城市水體的管控已刻不容緩.

糞便中的腸道致病菌是水源性疾病爆發(fā)的根源.世界上大多數(shù)國家,包括我國的地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838-2002)[2]等通常都將糞大腸菌群或大腸埃希氏菌作為反映水體微生物污染狀況的指示微生物.然而已有研究表明,糞大腸菌與大腸埃希氏菌可能在適宜的自然環(huán)境中繁殖[3-4],影響對糞便污染水體程度的判斷,并且傳統(tǒng)指示菌不具備宿主特異性[5],不能判斷微生物污染來源.為準(zhǔn)確識別水體微生物污染源強(qiáng),國內(nèi)外學(xué)者逐漸將目標(biāo)指示菌由糞大腸菌群、大腸埃希氏菌等傳統(tǒng)指示菌轉(zhuǎn)向了多瘤病毒、甲烷短桿菌及擬桿菌等專性厭氧菌.它們均具有宿主特異性好、且不能在腸道環(huán)境外生存繁殖等特點(diǎn).然而,多瘤病毒、甲烷短桿菌等分子標(biāo)記雖然具有較好地特異性,可以準(zhǔn)確識別微生物污染源,但由于在腸道中并非優(yōu)勢菌群,因此檢出率較低,會(huì)導(dǎo)致低估水體微生物污染程度[6].而擬桿菌不僅具有專性厭氧、宿主特異性好等優(yōu)勢[7],且為腸道中的優(yōu)勢菌群[8],相比于其它指示菌,具有較高的檢出率,近年來得到了越來越廣泛的應(yīng)用.例如,Oyafuso等[9]已在美國華盛頓州部分地區(qū)成功應(yīng)用人及反芻動(dòng)物的特異性擬桿菌標(biāo)記物識別出水體中糞便污染來源.

但由于不同地區(qū)人及動(dòng)物飲食習(xí)慣及所處地區(qū)環(huán)境氣候等的差異,導(dǎo)致寄居于腸道內(nèi)的細(xì)菌相對豐度、菌群結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化,造成指示菌引物存在地區(qū)適用性的問題.例如,反芻動(dòng)物特異性引物 CF128在歐洲各國均表現(xiàn)出較高的靈敏度(100%),但在葡萄牙部分地區(qū)特異性僅為41%,而在愛爾蘭部分地區(qū)其特異性卻高達(dá)96%[10].目前,國內(nèi)關(guān)于引物地區(qū)適用性的研究普遍是通過PCR技術(shù)篩選出引物,再進(jìn)行后續(xù)的定量實(shí)驗(yàn).然而,qPCR作為一種絕對定量技術(shù),其靈敏度及特異性均優(yōu)于 PCR.因此,通過 PCR技術(shù)挑選引物未必能完全驗(yàn)證引物的特性,在對水體微生物污染進(jìn)行定量分析時(shí)往往忽略這一問題.對此,本研究選取了人及常見畜禽動(dòng)物體內(nèi)的擬桿菌特異性引物,在珠江三角洲地區(qū)通過 qPCR技術(shù)對所選引物進(jìn)行地區(qū)適用性驗(yàn)證.同時(shí),選取了廣州、珠海市的部分河段,分析不同來源的糞源微生物在城市水體中的濃度水平及與常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性,為后續(xù)開展微生物污染源解析及污染水平的定量分析奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器:核酸蛋白分析儀(DU730, BeckMan Coulter公司),紫外可見分光光度計(jì)(DR2800,HACH公司),冷凍離心機(jī)(Sigma公司),熒光定量PCR儀(LightCycler 480Ⅱ,Roche公司),多模塊基因擴(kuò)增儀(FlexCycler2,耶拿公司), Quanti-tray 97孔定量盤(IDEXX公司),生化培養(yǎng)箱(三洋公司).

主要試劑:HiPure Stool DNA Kit B(D3141-02B,Magen公司),HiPure Water DNA Kit(D3145-02,Magen公司),SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa公司),瓊脂糖(Biowest,電泳級),COD低量程預(yù)制試劑(HACH公司),科立得試劑(IDEXX公司).

1.2 樣品采集

糞便樣品:2015年10月～2016年10月,在珠江三角洲地區(qū)東江和北江流域的多個(gè)畜禽養(yǎng)殖場內(nèi)采集不同生物的糞便樣品,在廣州市醫(yī)院采集人糞樣品.糞便樣品數(shù)共計(jì) 140份,其中人 31份,雞20份,豬32份,狗14份,兔8份,牛28份,馬7份.樣品采集后保存于冰盒中,6h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理.

水體樣品:對廣州市9處(G1～G9)、珠海市6處(Z1～Z6)地表水進(jìn)行樣品采集,除Z1點(diǎn)在海港附近排污口處采集 3份水樣,其余各采樣點(diǎn)均在河道橫截面左、中、右處各采集一份水樣,共計(jì)45份水樣.所有樣品采集后進(jìn)行編號并保存于冰盒中,于 6h內(nèi)運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).各采樣點(diǎn)如圖1所示.

圖1 廣州、珠海地表水采樣點(diǎn)分布示意Fig.1 Distribution of sampling sites in Guangzhou and Zhuhai surface water

1.3 分析方法

1.3.1 水體中氨氮和 COD的測定 氨氮的監(jiān)測采用納氏試劑分光光度法(HJ 535-2009).COD的監(jiān)測使用HACH公司低量程(LR)重鉻酸鉀法預(yù)制試劑.

1.3.2 固定酶底物法 采用100mL滅菌取樣瓶分別量取 100mL水樣,加入科立得試劑,混勻至試劑在瓶內(nèi)完全溶解.將試劑混勻后的水樣倒入97孔定量盤內(nèi),用封口機(jī)封口.糞大腸菌群的培養(yǎng)放入(44.5±0.2)℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),大腸埃希氏菌的培養(yǎng)放入(37.0±0.2)℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng),24h后進(jìn)行計(jì)數(shù).

1.3.3 樣品處理及 DNA的提取 糞便樣品DNA的提取:采用Magen公司D3141-02B試劑盒,通過珠磨、懸浮、破碎及吸附柱純化等步驟從糞便樣品中提取 40～50μL DNA,具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行.

水體中 DNA的提取采用 Magen公司D3145-02試劑盒,用0.22μm的濾膜過濾100mL水樣使菌體留在濾膜上,并按照說明書提取留在濾膜上的菌體DNA.DNA樣品置于-20℃冰箱儲存.

1.3.4 引物的選取及 qPCR分析 通過不同動(dòng)物的糞便樣品DNA,對選取的具有宿主特異性擬桿菌引物進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證.引物序列如表 1所示.qPCR擴(kuò)增體系為 20μL:SYBR? Premix Ex TaqTM II(2×)(購自TaKaRa公司)10μL; ddH2O, 6.4μL;上下游引物各0.8μL;DNA模板2μL.qPCR擴(kuò)增程序:①預(yù)變性,95 ℃ , 3 0s;②變性,95 ℃ , 5 s;③退火延伸,60 ℃ ,1min.40個(gè)循環(huán).擴(kuò)增體系與程序參照 TaKaRa公司 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ RR820A說明書.

1.3.5 引物靈敏度與特異性分析 采用以下公式分析各對引物的靈敏度(r)與特異性(s):r=[TP/(TP+FN)],s=[TN/(TN+FP)][23].其中,TP表示對自己種屬樣品擴(kuò)增的陽性樣本數(shù),FN表示對自己種屬樣品擴(kuò)增的陰性樣本數(shù);TN表示對其他種屬擴(kuò)增的陰性樣本數(shù),FP表示對其他種屬擴(kuò)增的陽性樣本數(shù).

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 選取具有較高特異性及較強(qiáng)靈敏度的引物對提取的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,對擴(kuò)增后的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收,連接到pMD 19-T Vector載體上,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,采用含有氨芐抗生素的平板培養(yǎng)基挑取陽性克隆,提取質(zhì)粒 DNA,對其進(jìn)行測序,并將基因序列提交至 GenBank進(jìn)行同源性比對,BLAST結(jié)果顯示(未列出),人源1# (qHB )、牛源5#(qRB)、豬源9#(qPB)、雞源11#(qCB)特異性擬桿菌引物及擬桿菌通用引物 13#(qGB)、大腸埃希氏菌引物14#(qEC)與通用引物互補(bǔ)的序列均為各自目標(biāo)菌株不同株系的16S rRNA基因片段,說明所選引物有較高的特異性.而總細(xì)菌引物15#(qTB)則含有變形菌屬、不動(dòng)桿菌等其他多種菌株的核酸序列.同時(shí),測定質(zhì)粒DNA濃度,計(jì)算目的片段的拷貝數(shù).將質(zhì)粒 10倍梯度稀釋,稀釋 10-1,10-2, 10-3,10-4,10-5,10-6,10-77個(gè)梯度,并以此為模板,每個(gè)梯度作為標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)3個(gè)重復(fù),進(jìn)行qPCR擴(kuò)增.反應(yīng)結(jié)束之后,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作.標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)大于 0.99,結(jié)果可信.擴(kuò)增效率(E)是通過標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率來確定的,兩者符合公式E=10(-1/Slope)-1.如果一個(gè)反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.32,則該反應(yīng)的擴(kuò)增效率E=100%[24].一般認(rèn)為擴(kuò)增效率(E)在90%～110%之間是可接受的.

表1 特征生物標(biāo)記引物Table 1 Primers used in qPCR assay

2 結(jié)果與討論

2.1 擬桿菌特異性生物標(biāo)記的驗(yàn)證

以各動(dòng)物糞便中提取的 DNA為模板,選取已有的人、反芻動(dòng)物、豬及雞源擬桿菌特異性引物進(jìn)行 qPCR擴(kuò)增.各引物擴(kuò)增的統(tǒng)計(jì)結(jié)果及靈敏度和特異性分析見表2和表3.

采用人源特異性引物(1#～4#)分別對各糞便樣品進(jìn)行qPCR擴(kuò)增時(shí),1#～4#引物特異性較強(qiáng),但靈敏度除1#達(dá)到 100%以外,其他均較差.反芻動(dòng)物引物(5#-8#)中,5#的靈敏度及特異性分別為92.9%和99.1%,效果較好.6#、7#引物特異性(均為88.2%)較強(qiáng),但靈敏度(分別為78.6%和 46.4%)較差.8#引物的特異性較強(qiáng)(97.4%),而靈敏度僅 25%.對豬源擬桿菌特異性引物(9#、10#)驗(yàn)證時(shí),9#引物的靈敏度及特異性為93.8%和 96.4%,該引物的靈敏度較 10#引物高出71.9%.雞源特異性引物11#具有較好的靈敏度(85%)及較強(qiáng)的特異性(92.3%),分別比12#引物高出 25%和 11.2%.綜合以上結(jié)果,人源特異性引物1#(qHS601F/qBac725R)、反芻動(dòng)物特異性引物5#(BacB2-590F/ Bac708Rm)、豬源特異性引物 9#(Bac41F/Bac163R)及雞源特異性引物 11#(qC160F-HU/qBac265R-HU)同時(shí)具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性,適用于目標(biāo)研究區(qū)域.

表2 擬桿菌特異性引物的擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Amplification results obtained with specific Bacteroidales biomarkers

表3 擬桿菌特異性引物靈敏度與特異性分析Table 3 Sensitivity and specificity of the specific Bacteroidales biomarkers analyzed

PCR技術(shù)自出現(xiàn)以來,就因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便等特點(diǎn)而倍受青睞.但PCR技術(shù)須依賴一系列后處理過程對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析,這些處理過程可能會(huì)造成假陽性污染,同時(shí)針對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行處理分析也會(huì)干擾原始模板和終產(chǎn)物之間的定量關(guān)系[25].而在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qPCR)技術(shù)則是利用反應(yīng)體系中添加的熒光染料,通過積累熒光信號對整個(gè)擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測[26],相較于PCR技術(shù)而言具有更好的靈敏度和特異性,而且能夠避免后處理過程對擴(kuò)增產(chǎn)物的污染,是一種絕對定量技術(shù).目前國內(nèi)大多數(shù)關(guān)于引物適用性的研究都是先通過 PCR定性分析,然后應(yīng)用于qPCR進(jìn)行定量.該方法忽略了PCR與qPCR技術(shù)之間靈敏度與特異性的差異,導(dǎo)致可能會(huì)在引物驗(yàn)證階段使得部分適用引物被漏選.本研究為對比兩種方法驗(yàn)證引物時(shí)的差異,分別通過PCR和 qPCR技術(shù)對采集到的 20個(gè)雞糞樣品采用11#(禽類)引物進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果如表4所示.

表4 PCR及qPCR方法對雞源特異性引物的驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Chicken-specific primer verification resultsthrough PCR and qPCR method

引物的靈敏度及特異性是否符合目標(biāo)研究區(qū)域目前仍沒有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn),在進(jìn)行微生物污染源解析時(shí),不同引物在不同的區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出的靈敏度、特異性及衰減特征都可能發(fā)生變化.Ahmed[27]在總結(jié)多種人源特異性擬桿菌引物效果時(shí)指出,當(dāng)引物的靈敏度和特異性均大于 80%,該引物表現(xiàn)較好.若引物的靈敏度小于80%,而特異性大于 90%,該引物同樣可以接受.從表4可以觀察到,采用11#引物在20個(gè)雞糞樣本中通過PCR及qPCR方法得到的陽性樣本數(shù)分別為15個(gè)和17個(gè),普通PCR驗(yàn)證的靈敏度及特異性均小于80%,而qPCR驗(yàn)證的靈敏度及特異性分別為85%和90.2%,適用于目標(biāo)研究區(qū)域.說明qPCR方法較普通PCR而言,具有更高的檢出率,對不同引物的特異性擴(kuò)增也更強(qiáng),在引物驗(yàn)證階段及后續(xù)的實(shí)際應(yīng)用中,具有明顯優(yōu)勢.

然而,采用qPCR作為驗(yàn)證手段時(shí),分析結(jié)果是以到達(dá)閾值的循環(huán)次數(shù)(Cq值)和熔解曲線為基礎(chǔ),難以像普通PCR進(jìn)行定性分析時(shí)具有簡單而統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn).例如,Shanks等[28]在微生物源解析研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)引物 HF183/BacR287的 Cq= 33.5時(shí)達(dá)到了該引物的最低定量限(LLOQ),Cq＞33.5時(shí)由于DNA模板濃度過低而導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果的平行性較差.而引物 HumM2的 LLOQ則為Cq=34.7,說明不同引物的 LLOQ也不相同,這會(huì)給qPCR驗(yàn)證造成一定的困擾.而本研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)各引物的Cq值大于32.0時(shí),會(huì)出現(xiàn)復(fù)孔之間Cq值誤差較大,甚至未能得到擴(kuò)增結(jié)果等現(xiàn)象.因此,在本文所述的目標(biāo)研究區(qū)域中,各引物可將Cq=32.0所對應(yīng)的拷貝數(shù)作為最低定量限來驗(yàn)證引物的特性.但這一標(biāo)準(zhǔn)是否適用于其它區(qū)域,尚須通過大量樣本進(jìn)行驗(yàn)證.

2.2 水體常規(guī)微生物與理化指標(biāo)分析

對廣州、珠海的部分城市水體進(jìn)行常規(guī)水質(zhì)監(jiān)測,結(jié)果如表 5所示.各采樣點(diǎn)所在河段(圖 1)均受到了不同程度的污染.在廣州市附近監(jiān)測河段中,G1～G4采樣點(diǎn)COD、氨氮、糞大腸菌群濃度超標(biāo)較為嚴(yán)重.尤其在 G4東塱采樣點(diǎn)周圍,存在繁華的商業(yè)區(qū),人口較為密集,且有游船往來,其中氨氮已超出 V 類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB3838-2002)2.5倍,糞大腸菌群(CFC)、大腸埃希氏菌(CEC)較G1～G3也高出1～2個(gè)數(shù)量級,說明G4點(diǎn)受糞便污染較為嚴(yán)重.G5～G8依次位于流溪河的上、中、下游,因此COD、氨氮的濃度分布特征總體呈現(xiàn)出沿河流方向逐漸增加的趨勢.河流末端G8采樣點(diǎn)的氨氮、COD濃度均已超出Ⅴ類水標(biāo)準(zhǔn).然而G7處的CFC、CEC較G8高出1～2個(gè)數(shù)量級,更遠(yuǎn)大于G6,這說明G7采樣點(diǎn)附近存在糞便污染源,并在河水的稀釋作用下,至G8點(diǎn)處污染程度已略有下降.G9位于廣州市中心區(qū)域,該河段常年受市政污水影響,各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)超標(biāo)嚴(yán)重,同時(shí)由CFC、CEC檢測結(jié)果可以看出,糞便污染可能是導(dǎo)致該區(qū)域水質(zhì)較差的主要原因之一.

由于珠海市選取的Z1～Z5采樣點(diǎn)均位于排污口附近,因此各監(jiān)測指標(biāo)濃度較高.其中,鳳凰河排污口 Z1處污染最為嚴(yán)重,氨氮超出Ⅴ類水標(biāo)準(zhǔn)5.6倍,CFC較Ⅴ類水標(biāo)準(zhǔn)也高出2個(gè)數(shù)量級.此外,Z2～Z5水質(zhì)也不容樂觀,均可列為劣Ⅴ類水質(zhì).值得注意的是,在雞啼門入?？谔?當(dāng)?shù)鼐用駷榉乐刮鬯苯优湃牒?設(shè)立水閘將受污染河段與入海河段隔開.對比閘內(nèi)、閘外的各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)可以發(fā)現(xiàn),閘外Z6采樣點(diǎn)的COD、氨氮較Z5分別下降了78.3%和98.8%,CFC、CEC也均減少了約3個(gè)數(shù)量級,符合Ⅱ類水標(biāo)準(zhǔn).

糞便中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪、N、P等營養(yǎng)物質(zhì).當(dāng)未經(jīng)處理的糞便進(jìn)入地表水,糞便中N、P及部分有機(jī)質(zhì)會(huì)通過腐敗分解等一系列過程殘留于水體中,對環(huán)境造成嚴(yán)重危害[29].因此,當(dāng)水體受到糞便污染時(shí),CFC、CEC等指示微生物的濃度可能與各項(xiàng)理化指標(biāo)存在一定的關(guān)聯(lián).本研究對DO、COD及氨氮三項(xiàng)指標(biāo)與傳統(tǒng)指示微生物進(jìn)行了相關(guān)性分析(見表 6),從中可以看出,CFC、CEC僅與氨氮具有較強(qiáng)的相關(guān)性.這是由于糞便中的 N元素大多以有機(jī)氮及氨態(tài)氮等形式存在,較易流失或侵蝕地表水,引起水體富營養(yǎng)化[30].然而,城市水體中的 N元素超標(biāo)并非均由糞便排放引起,也可能存在N元素等營養(yǎng)物質(zhì)由其它途徑排放至水體中,進(jìn)而為CFC、CEC等兼性菌提供了生長條件,使得當(dāng)水體中氨氮濃度較高時(shí),CFC、CEC與氨氮表現(xiàn)出一定的相關(guān)性.而糞大腸菌群及大腸埃希氏菌在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)環(huán)境中可能繁殖也是其作為指示菌的缺陷之一.因此,N、P等營養(yǎng)元素與CFC、CEC之間的相互作用關(guān)系,尚須通過對傳統(tǒng)指示菌在不同營養(yǎng)水 平下的衰減規(guī)律來進(jìn)一步分析.

表5 各采樣點(diǎn)的水質(zhì)指標(biāo)Table 5 Water quality indicators for different sampling points

表6 傳統(tǒng)指示微生物與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 6 Correlations analysis between traditional fecal indicators and physic-chemical index

2.3 水體中微生物污染的定量源解析特征分析

當(dāng)糞便進(jìn)入地表水中,由于稀釋作用導(dǎo)致擬桿菌濃度隨著水流的遷移而下降.同時(shí),擬桿菌專性厭氧的特性也會(huì)使其在水體中快速衰減,因此擬桿菌作為指示菌通常用于評估近期污染.但在城市水體中,由于人糞可能來自于未經(jīng)處理的生活污水、市政管道的污水溢流或污水處理廠等多種途徑[31],使得人源特異性擬桿菌可以維持在較高濃度水平.從圖2可以觀察到,qHB濃度較qRB平均高出1～2個(gè)數(shù)量級,較qCB高出2～4個(gè)數(shù)量級,說明各水體主要受到人糞污染較為嚴(yán)重,這也與城市水體主要接納生活污水及市政污水的實(shí)際情況相符.而各采樣點(diǎn)檢測到的qRB、qCB也表明水體同時(shí)受到反芻動(dòng)物、禽類糞便的污染.但在實(shí)際采樣過程中發(fā)現(xiàn),除G5、G6及Z4、Z5、 Z6附近有部分養(yǎng)殖場及耕地外,其余采樣點(diǎn)所在河流兩旁主要為商業(yè)區(qū)、居民區(qū),這說明水體中的qRB、qCB可能為上游污染源遷移而來.

圖2 各采樣點(diǎn)指示微生物濃度Fig.2 Indicator microorganisms’ concentration in the each water body

理想的宿主特異性標(biāo)記應(yīng)在污染區(qū)域濃度較高,同時(shí)與傳統(tǒng)指示微生物(CFC、CEC)在腸道外的生存狀態(tài)(或衰減規(guī)律)具有一定的相似性[32].由傳統(tǒng)指示微生物和特異性擬桿菌的相關(guān)關(guān)系可以看出(表7),除qCB與CFC、CEC相關(guān)性較差,傳統(tǒng)指示微生物與各特異性擬桿菌引物及總擬桿菌均具有良好的相關(guān)性.其中,位于較高濃度水平的qHB與qEC、CFC及CEC的相關(guān)性最好,再結(jié)合各特異性標(biāo)記在水體中濃度的大小(qHB＞qRB＞qCB),可以說明水體中宿主特異性標(biāo)記物的濃度水平越高,與傳統(tǒng)指示微生物的相關(guān)性越強(qiáng).這也反映出在以人糞污染為主的區(qū)域內(nèi),qHB作為源解析指示菌的有效性.

基于微生物污染源解析費(fèi)用較高,研究者們認(rèn)為可以先通過傳統(tǒng)指示微生物初步判定水體微生物污染程度,必要時(shí)再采用源解析方法確定糞便污染來源,為水體的針對性治理做出引導(dǎo)[33].然而,若對傳統(tǒng)指示微生物和特異性擬桿菌標(biāo)記進(jìn)行同步監(jiān)測,利用二者在環(huán)境中衰減特征的差異,可以較為全面的分析出污染源源強(qiáng)[34],污染源距監(jiān)測點(diǎn)的距離以及初步判斷污染源排放的時(shí)間段[32].例如,已有研究表明,大腸埃希氏菌等傳統(tǒng)指示微生物在環(huán)境水體中的衰減速率相比擬桿菌而言較為緩慢,可較持久地反映出微生物污染水平.而擬桿菌一旦進(jìn)入環(huán)境水體中,會(huì)呈現(xiàn)出快速衰減的趨勢[35],之后在相對較低的濃度水平下維持 2～6d[32].對照本研究中糞源微生物的檢測結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn) qCB濃度水平已接近其 LLOQ.而qRB盡管較qCB高出1個(gè)數(shù)量級,但濃度也相對較低,同時(shí)由表 7觀察到特異性擬桿菌標(biāo)記與傳統(tǒng)指示微生物(qEC、CFC、CEC)的相關(guān)性強(qiáng)度為qHB＞qRB＞qCB.綜合以上特征,可以判斷出水體中的反芻動(dòng)物、禽類糞便為近期排放,并且排放點(diǎn)距監(jiān)測點(diǎn)距離較遠(yuǎn),對監(jiān)測河段水質(zhì)影響較小.而人糞污染源鄰近各監(jiān)測點(diǎn),且排放量較大.

表7 傳統(tǒng)指示微生物與特異性擬桿菌的相關(guān)性分析Table 7 Correlations analysis between traditional microorganism indicators and specific bacteroides

3 結(jié)論

3.1 識別出基于qPCR技術(shù)的人源1#、反芻動(dòng)物5#、豬源 9#及雞源11#擬桿菌特異性引物在珠三角河網(wǎng)地區(qū)具有較高的靈敏度及較強(qiáng)的特異性.

3.2 CFC、CEC這2種指示微生物的濃度與氨氮具有較好的相關(guān)性(P＜0.05),并且其指示結(jié)果與常規(guī)理化指標(biāo)的評價(jià)結(jié)果基本吻合,能夠反映出水體受市政污水的污染狀況.

3.3 14處城市地表水均受到糞便污染,3種不同來源的糞便對水體的污染強(qiáng)度為 qHB＞qRB＞qCB,人糞為主要污染源.

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Microbial source tracking of fecal contamination in the Pearl River Delta region.

ZHANG Yang1,2, WU Ren-ren2,3*, ZHANG Yi-min1,4*, WU Bing-wen5, WU Xiao-qing2,3, CHEN Zhong-ying2,3, LI Kai-ming2,3(1.College of Resources and Environment Engineering, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China；2.South China Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Guangzhou 510655, China；3.The key Laboratory of Water and Air Pollution Control of Guangdong Province, Guangzhou 510655, China；4.College of Resources and Environment Engineering, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081, China；5.School Environmental Science and Engineering, Zhejiang GongShang University, Hangzhou 310000, China). China Environmental Science, 2017,37(9)：3446～3454

Identification of the host source of microbial contaminants accurately is the basis for targeted treatment in water. To analyze the feature of pollution in the Pearl River Delta Region, qPCR method was applied to choose the suitable specific bacteroides primer, and culture-method was combined which detected the Fecal coliform and Escherichia coli to assess the water quality and the sources of fecal pollution in target area. The results showed that human-specific marker qHS601F/ qBac725R, ruminant-specific marker BacB2-590F/Bac708Rm, porcine-specific marker Bac41F/Bac163R and chicken-specific marker qC160F-HU/qBac265R-HU had higher sensitivity and specificity in the Pearl River Delta region. 14 sampling sites were polluted by human, ruminant and poultry fecal. The intensity of pollution by different source was found to be human＞ruminant＞poultry. And the concentration of qHS601F/qBac725R had a significant correlationship with Fecal coliform, Escherichia coli and EC23S857F/ EC23S857R (P＜0.05).It reflects that the major contribute of pollutant source was human.

qPCR；microbial pollution；bacteroides；specific markers；Pearl River Delta region

X713

A

1000-6923(2017)09-3446-09

2017-03-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41303054),中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)

* 責(zé)任作者, 副研究員, wurenren@scies.org; 教授, zym126135@126.com

張 楊(1988-),男,寧夏銀川人,武漢理工大學(xué)與環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物研究.