繆成貴 時(shí)維靜 魏偉　秦梅頌　陳浩 張兵

[摘要] 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)宿州地方特色藥材王棗子中總黃酮（total flavonoids of Isodon amethystoides，TFIA）對佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）具有一定的治療作用，并且這種治療作用可能是通過對miR152表達(dá)的上調(diào)實(shí)現(xiàn)的，該文進(jìn)一步研究TFIA對AA大鼠病理機(jī)制影響的分子機(jī)制。采用完全弗氏佐劑制備AA大鼠，TFIA灌胃治療，采用Realtime qPCR檢測TFIA灌胃治療對AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast like synoviocytes，F(xiàn)LS）中miR152、甲基化酶DNMT1及甲基化結(jié)合蛋白MeCP2構(gòu)成的負(fù)調(diào)控環(huán)路的影響，對miR152下游經(jīng)典Wnt信號通路的影響，對AA大鼠病理基因fibronectin表達(dá)的影響。TFIA灌胃治療顯著抑制DNMT1表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了AA大鼠病理中存在的由miR152，DNMT1和MeCP2構(gòu)成的負(fù)調(diào)控環(huán)路，向治療組FLS轉(zhuǎn)染miR152 inhibitors后，DNMT1表達(dá)顯著恢復(fù)。TFIA灌胃治療顯著上調(diào)SFRP4表達(dá)，抑制經(jīng)典Wnt信號通路關(guān)鍵基因βcatenin，Cmyc和ccnd1表達(dá)，顯著抑制AA病理基因fibronectin表達(dá)，向治療組FLS轉(zhuǎn)染miR152 inhibitors后，逆轉(zhuǎn)了TFIA灌胃治療對SFRP4，βcatenin，Cmyc，ccnd1和fibronectin表達(dá)的影響。TFIA可能通過miR152表達(dá)的上調(diào)抑制DNMT1表達(dá)，上調(diào)SFRP4表達(dá)，抑制經(jīng)典Wnt信號關(guān)節(jié)基因βcatenin，Cmyc，ccnd1表達(dá)，抑制RA基因fibronectin表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 王棗子總黃酮； 佐劑性性關(guān)節(jié)炎； miR152； 成纖維樣滑膜細(xì)胞； 經(jīng)典Wnt信號通路

Molecular mechanism of total flavonoids in Isodon amethystoides

on adjuvant arthritis in rats

MIAO Chenggui1*， SHI Weijing1， WEI Wei1， QIN Meisong1， CHEN Hao1， ZHANG Bing2

（1. Food and Drug College， Anhui Science and Technology University， Fengyang 233100， China；

2. The First Affiliated Hospital， Anhui Medical University， Heifei 230032， China）

[Abstract] Our preliminary study showed that the total flavonoids in Isodon amethystoides（TFIA）， a local medicinal herb in Suzhou， had a certain therapeutic effect on adjuvant arthritis， and this therapeutic effect may be achieved through the upregulation of miR152 expression. In this paper， the molecular mechanism of TFIA on the pathogenesis of adjuvant arthritis（AA） rats was further studied. AA rats were prepared with complete Freund′s adjuvant， and then treated with TFIA by intragastric administration. Realtime qPCR was used to detect the effects of TFIA on the negative regulatory loop of miR152， methylase DNMT1 and methylCpG binding protein MeCP2 in fibroblast like synoviocytes（FLS） of AA rats， as well as the effects of TFIA on the classic Wnt signaling pathway and the expression of fibronectin gene in AA rats. Intragastric administration of TFIA significantly inhibited the expression of DNMT1 and reversed the negative regulatory loop composed of miR152， DNMT1 and MeCP2 in the pathology of AA rats. After transfection of miR152 inhibitors into the FLS in treatment group， DNMT1 expression was significantly restored. TFIA significantly upregulated the expression of SFRP4 and inhibited the expression of βcatenin， Cmyc and ccnd1， the key genes of canonical Wnt signaling pathway. TFIA also significantly inhibited the expression of fibronectin， an AA gene. The effect of TFIA on the expression of SFRP4， βcatenin， Cmyc， ccnd1 and fibronectin was reversed after transfection with miR152 inhibitors in the treatment group FLS. TFIA may inhibit the DNMT1 expression， upregulate the SFRP4 expression， inhibit the expression of classical Wnt signaling genes βcatenin， Cmyc， and ccnd1 as well as the RA gene fibronectin expression through the upregulation of miR152 expression.endprint

[Key words] total flavonoids of Isodon amethystoides； adjuvant arthritis； miR152； fibroblast like synoviocytes； canonical Wnt signal pathway

王棗子Isodon amethystoides為香茶菜屬草本植物，是安徽省宿州市埇橋區(qū)當(dāng)?shù)爻Ｓ玫牡胤教厣兴幉?，?shí)踐證明王棗子具有較好的抗炎解毒、醒酒保健等功效[12]。黃酮類成分是中草藥中常見的含量較高的藥效成分，課題組研究表明王棗子莖葉中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，并且王棗子中總黃酮（total flavonoids of I. amethystoides，TFIA）對RA模型大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠具有一定的治療作用。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性的、自身免疫性疾病，主要發(fā)病部位是人手足等小關(guān)節(jié)部位，病理變化主要包括成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast like synoviocytes，F(xiàn)LS）異常增殖、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、軟骨不可逆的損害、關(guān)節(jié)變形等，嚴(yán)重的可影響關(guān)節(jié)功能，甚至造成終身殘廢[3]?，F(xiàn)有的研究表明，F(xiàn)LS異常增殖在RA發(fā)病機(jī)制中扮演了關(guān)鍵角色[4]。AA大鼠病理特點(diǎn)與RA極為相似，是常用的RA病理和治療研究的模型動(dòng)物[5]，本課題組亦采用AA大鼠作為RA研究的模型動(dòng)物探討RA的病理機(jī)制。通過對AA大鼠病理機(jī)制的研究，課題組發(fā)現(xiàn)與對照相比，AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中miR152表達(dá)顯著降低，同時(shí)DNMT1和MeCP2表達(dá)顯著升高。AA大鼠病理中存在著miR152過表達(dá)抑制DNMT1表達(dá)，高表達(dá)的DNMT1和MeCP2協(xié)同抑制miR152表達(dá)的雙向負(fù)調(diào)控環(huán)路。過表達(dá)的miR152通過抑制DNMT1表達(dá)抑制經(jīng)典Wnt信號通路活性，進(jìn)而抑制AA大鼠病理發(fā)展[67]。

RA發(fā)病年齡有年輕化的趨勢，RA病因仍然未能完全闡明[8]，積極探討中藥在RA病理中的作用及分子機(jī)制對RA的預(yù)防和治療有重要的積極意義。課題組前期研究結(jié)果顯示，經(jīng)TFIA灌胃治療后，TFIA灌胃治療能顯著抑制AA大鼠足爪腫脹度，顯著抑制IL1表達(dá)，顯著抑制AA大鼠FLS增殖活力。與對照組相比，AA組FLS中miR152表達(dá)顯著降低，過表達(dá)的miR152顯著抑制IL1表達(dá)，抑制FLS增殖。TFIA對AA大鼠足爪腫脹具有一定的抑制作用，并且這種抑制作用可能是通過miR152表達(dá)的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。本文課題組以AA大鼠為研究模型，采用Realtime qPCR等方法檢測TFIA灌胃治療對AA大鼠FLS中miR152，DNMT1及MeCP2構(gòu)成的負(fù)調(diào)控環(huán)路的影響，對miR152下游經(jīng)典Wnt信號通路的影響，對AA大鼠病理基因fibronectin表達(dá)的影響，探討TFIA治療RA的分子機(jī)制。

1 材料

TFIA：取王棗子干燥莖葉，充分烘干并粉碎。使用95%乙醇提取并減壓濃縮，濃縮物再用水溶解，然后調(diào)pH至2.0，最后乙醚萃取，得到的有機(jī)相精制濃縮備用。經(jīng)測定TFIA質(zhì)量分?jǐn)?shù)>85%；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas）；miR152引物（德國Qiagen）；miR152 inhibitors及NSmiRNA（上海吉瑪）；QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒（德國Qiagen公司）；脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000，OptiMEM（美國Invitrogen公司）；新生胎牛血清（美國Hyclone）。

2 方法

2.1 AA大鼠制備 雄性SD大鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號），體質(zhì)量160～180 g，適用性飼養(yǎng)4 d后隨機(jī)分組，即空白對照組、AA組、TFIA 100 mg·kg-1給藥治療組、給藥陰性對照組、轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染陰性對照組等，每組大鼠10只?？瞻讓φ战M采用足跖底部注射方法注射0.1 mL生理鹽水，其余各組足跖底部注射完全弗氏佐劑0.1 mL制備AA大鼠。

2.2 AA大鼠關(guān)節(jié)炎評分 采用常規(guī)的大鼠關(guān)節(jié)炎評分方法評價(jià)AA大鼠是否制備成功。具體如下：大鼠鼻子出現(xiàn)紅腫或結(jié)節(jié)評為1分，尾巴出現(xiàn)紅腫或結(jié)節(jié)評為1分，1只耳朵出現(xiàn)紅腫或結(jié)節(jié)評為1分，1只足爪出現(xiàn)癥狀評為1分。每只大鼠最高得分8分。

2.3 大鼠滑膜FLS原代培養(yǎng) 采用組織塊方法培養(yǎng)FLS。SD大鼠注射完全弗氏佐劑后第4天給藥治療，第28天處死動(dòng)物，無菌條件下分離大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，小剪刀剪碎成1～3 cm3大小滑膜組織塊。長玻璃吸管轉(zhuǎn)移組織塊進(jìn)入無菌一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，貼壁擺放整齊，每瓶細(xì)胞加入3 mL含胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)反扣培養(yǎng)7 h，使細(xì)胞貼壁緊密，然后反正培養(yǎng)6 d，每隔3 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)基。然后棄凈瓶內(nèi)培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加胰酶0.5 mL消化細(xì)胞0.5 min，使用移液器充分吹打貼壁細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，按1∶2比例傳達(dá)培養(yǎng)，本試驗(yàn)所用細(xì)胞為傳代3～5代FLS。

2.4 miR152 inhibitors細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在FLS傳代3～5代內(nèi)，待FLS鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶壁90%以上，細(xì)胞長勢良好時(shí)，棄凈瓶內(nèi)培養(yǎng)基，加生理鹽水3 mL洗滌2次，然后加胰酶0.5 mL消化細(xì)胞0.5 min。使用移液器無菌條件下充分吹打制備1×105 個(gè)/mL的FLS懸液，接種FLS于6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度適中，然后置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)5% CO2，37 ℃條件培養(yǎng)至FLS鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶壁75%左右用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。采用lipofetaminTM 2000轉(zhuǎn)染試劑向各組FLS轉(zhuǎn)染miR152 inhibitors及陰性對照序列NSmiRNA，轉(zhuǎn)染步驟參照轉(zhuǎn)染試劑盒提供的方法。

2.5 Realtime qPCR檢測 Trizol試劑常規(guī)提取各試驗(yàn)組FLS的總RNA，參照Fermentas試劑盒提供的逆轉(zhuǎn)錄步驟逆轉(zhuǎn)錄各組試驗(yàn)大鼠FLS的cDNA。Realtime qPCR引物購自德國Qiagen公司，參照Qiagen公司試劑盒提供的定量擴(kuò)增步驟，采用Realtime qPCR方法檢測各靶基因在不同樣本中的表達(dá)。擴(kuò)增條件為95 ℃ 15 min，然后94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。endprint

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以±s表示，組間比較采用OneWay ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 TFIA灌胃治療對DNMT1表達(dá)的影響 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中miR152表達(dá)顯著降低，DNA甲基化酶DNMT1和甲基化結(jié)合蛋白MeCP2表達(dá)顯著升高，過表達(dá)的miR152抑制DNMT1表達(dá)，并且過表達(dá)的DNMT1和MeCP2反過來能協(xié)同抑制miR152表達(dá)，過表達(dá)的miR152通過抑制DNMT1表達(dá)抑制經(jīng)典Wnt信號通路活性，進(jìn)而抑制AA大鼠病理發(fā)展。同時(shí)，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TFIA灌胃治療能夠顯著恢復(fù)AA大鼠滑膜中miR152的表達(dá)，鑒于miR152與DNMT1，MeCP2之間的相互調(diào)控關(guān)系，TFIA灌胃治療是否會(huì)對DNA甲基化酶DNMT1的表達(dá)產(chǎn)生影響？課題組分離各試驗(yàn)組AA大鼠滑膜組織，培養(yǎng)FLS，采用Realtime qPCR檢測TFIA灌胃治療對DNMT1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示TFIA灌胃治療后，與AA大鼠組相比，治療組的DNMT1表達(dá)均值由1.508 1降低至1.309 2，顯著降低。向治療組AA大鼠FLS轉(zhuǎn)染miR152 inhibitors后，DNMT1表達(dá)均值由1升高至1.208 6，又顯著升高，提示TFIA通過對miR152表達(dá)上調(diào)抑制了DNMT1表達(dá)，見圖1。

3.2 TFIA灌胃治療對經(jīng)典Wnt信號通路上游負(fù)調(diào)控因子SFRP4表達(dá)的影響 SFRP4是經(jīng)典Wnt信號通路上游負(fù)調(diào)控因子，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SFRP4在AA發(fā)病過程中發(fā)生了甲基化修飾致使其表達(dá)顯著降低。課題組采用Realtime qPCR檢測TFIA灌胃治療對SFRP4表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與AA組相比，治療組FLS中SFRP4表達(dá)均值由0.710 8升高至0.838 2，顯著升高。向治療組AA大鼠FLS轉(zhuǎn)染miR152 inhibitors后，SFRP4表達(dá)由1降低至0.881 4，又顯著降低，提示TFIA可能通過對miR152，DNMT1表達(dá)的調(diào)控影響了SFRP4表達(dá)，見圖2。

3.3 TFIA灌胃治療對經(jīng)典Wnt信號通路表達(dá)的影響 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號通路在AA發(fā)病過程被激活了，及信號通路關(guān)鍵基因βcatenin，Cmyc，ccnd1表達(dá)都顯著上調(diào)。課題組采用Realtime qPCR檢測TFIA灌胃治療對經(jīng)典Wnt信號通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，TFIA灌胃治療后經(jīng)典Wnt信號通路活性降低，即βcatenin表達(dá)均值由1.907 2降低至1.710 9，Cmyc表達(dá)均值由1.415 5降低至1.200，8，ccnd1表達(dá)均值由1.682 2降低至1.308 5，都顯著被抑制。向治療組AA大鼠FLS轉(zhuǎn)染miR152 inhibitors后，βcatenin表達(dá)均值由1升高至1.150 7，Cmyc表達(dá)均值由1升高至1.161 3，ccnd1表達(dá)均值由1升高至1.090 6，都顯著升高了。結(jié)合前期研究結(jié)果，TFIA可能是通過對miR152，DNMT1表達(dá)的調(diào)控影響了經(jīng)典Wnt信號通路活性，見圖3。

3.4 TFIA灌胃治療對AA病理基因fibronectin表達(dá)的影響 fibronectin是AA大鼠及RA疾病發(fā)生的標(biāo)志性基因，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)AA病理基因fibronectin在AA發(fā)病過程顯著高表達(dá)。課題組采用Realtime qPCR檢測TFIA灌胃治療對fibronectin表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與AA組相比，治療組fibronectin均值由1.507 3降低至1.310 9，顯著降低。向治療組AA大鼠FLS轉(zhuǎn)染miR152 inhibitors后，fibronectin由1上調(diào)至1.106 6，顯著升高，見圖4。提示TFIA影響了AA大鼠的發(fā)病機(jī)制，并且這種影響是通過對miR152，DNMT1及經(jīng)典Wnt信號通路的影響實(shí)現(xiàn)的。

4 討論

王棗子主要用于治療清熱解毒、腹瀉等，具有較好的抗菌消炎、調(diào)節(jié)免疫力等作用，為宿州市埇橋區(qū)當(dāng)?shù)厝罕姀V泛使用的地方特色藥材。經(jīng)鑒定，王棗子屬于唇形科香茶菜屬草本植物，并且在安徽、江蘇、湖北等地都有分布?，F(xiàn)代藥理研究王棗子中齊墩果酸含量豐富，并且有降血糖、降血脂、強(qiáng)心、抗心律失常等功效[910]。鑒于草本植物中含有豐富的黃酮類成分[11]，本課題組從王棗子中總黃酮作為切入點(diǎn)，研究王棗子總黃酮TFIA對RA的作用。前期研究顯示TFIA具有一定的治療RA模型動(dòng)物AA大鼠的作用，并且這種治療作用可能是通過對AA大鼠滑膜細(xì)胞FLS中miR152表達(dá)的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。本文采用完全弗氏佐劑制備AA大鼠，組織塊方法培養(yǎng)FLS，研究TFIA通過對miR152的調(diào)控對miR152下游其他靶基因及相關(guān)的信號通路，特別是經(jīng)典Wnt信號通路的影響，探討TFIA治療AA的分子機(jī)制。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在AA大鼠病理機(jī)制中存在著低表達(dá)的miR152受DNA甲基化酶DNMT1和甲基化結(jié)合蛋白MeCP2共同抑制，過表達(dá)的miR152能夠抑制DNMT1表達(dá)的雙向負(fù)調(diào)控環(huán)路，并且過表達(dá)的miR152通過對DNMT1的抑制上調(diào)經(jīng)典Wnt信號通路上游負(fù)調(diào)控因子SFRP4表達(dá)，進(jìn)而抑制經(jīng)典Wnt信號通路的開放、抑制AA病理基因fibronectin的表達(dá)[68]。

本課題組前期發(fā)現(xiàn)TFIA灌胃治療AA大鼠后恢復(fù)了miR152的表達(dá)，因此本課題組預(yù)測TFIA可以通過對miR152表達(dá)的上調(diào)影響DNMT1、經(jīng)典Wnt信號及fibronectin的表達(dá)。本文采用細(xì)胞培養(yǎng)、Realtime qPCR等研究方法研究TFIA通過對miR152的調(diào)控對miR152下游其他靶基因及相關(guān)的信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA大鼠灌胃治療顯著抑制DNA甲基化酶DNMT1表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了AA大鼠病理中存在的由miR152和DNMT1和MeCP2構(gòu)成的負(fù)調(diào)控環(huán)路。向治療組FLS轉(zhuǎn)染miR152 inhibitors后，DNMT1表達(dá)顯著恢復(fù)，即TFIA通過對miR152的上調(diào)達(dá)到抑制DNMT1的作用。AA大鼠灌胃治療顯著上調(diào)SFRP4表達(dá)，抑制經(jīng)典Wnt信號通路關(guān)鍵基因βcatenin，Cmyc和ccnd1的表達(dá)，顯著抑制AA病理基因fibronectin的表達(dá)。向治療組FLS轉(zhuǎn)染miR152 inhibitors后，逆轉(zhuǎn)了灌胃治療對SFRP4和fibronectin的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了對經(jīng)典Wnt信號通路的影響。本文研究結(jié)果提示TFIA灌胃起到的治療AA作用可能是通過對miR152，DNMT1及MeCP2構(gòu)成的負(fù)調(diào)控環(huán)路及經(jīng)典Wnt信號通路的影響實(shí)現(xiàn)的。endprint

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[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint