武鳳梅 何佳

哈爾濱瀚邦醫(yī)療科技有限公司 150028

RP-HPLC法測定枸櫞酸離子檢驗條件研究

武鳳梅 何佳

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目的：考察血液制品與磺基水楊酸的反應溫度對枸櫞酸離子含量檢驗結(jié)果的影響。方法：首先通過實驗確定樣品溫度對枸櫞酸離子含量的結(jié)果的影響，再根據(jù)確定的反應溫度，依據(jù)《中國藥典》（2015年版）進行方法學研究。結(jié)果：樣品與磺基水楊酸的反應溫度為37℃時，方法學研究符合相關(guān)規(guī)定。結(jié)論：為保證樣品與磺基水楊酸反應完全，結(jié)果真實可靠，樣品與磺基水楊酸的反應溫度設定為37℃。

枸櫞酸離子；血液制品與磺基水楊酸的反應溫度

《中國藥典》2015版三部[1]中枸櫞酸離子含量測定法有三個方法，其中第二法高效液相法是用示差折光檢測器，通過苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基質(zhì)的陽離子交換色譜柱（H+）將血液制品中的枸櫞酸離子分離出來，在實驗過程中磺基水楊酸與樣品反應條件直接影響枸櫞酸離子的分離效果，不同檢驗條件對檢驗枸櫞酸離子含量結(jié)果影響較大[2-5]。本試驗通過對不同溫度條件及反應時間的考察，確定血液制品樣品與磺基水楊酸的反應具體條件。

1.儀器與試劑

高效液相色譜儀：示差折光檢測器（島津RID-10A），

試劑：枸櫞酸鈉（SIGMA）：批號：BCBP0175V

硫酸、磺基水楊酸為國產(chǎn)分析純試劑

2.色譜條件

2.1.色譜條件：陽離子交換色譜柱（H+）：BIO（300mm× 7.8mm，9um）；流動相為0.004mol/L硫酸，流速0.8ml/min；柱溫50℃。

3.溶液的配制及樣品處理：

3.1.對照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)減壓干燥至恒重的枸櫞酸鈉0.735g，置100ml量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，精密量取5ml、10ml、15ml，分別置25ml量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得相對應的5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L枸櫞酸離子對照品溶液[6,7]。分別精密量取20uL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；

3.2.供試品溶液的制備：取血液制品的供試品溶液 1ml，置15ml離心管中，精密加入1.5%磺基水楊酸溶液 1ml，搖勻，37℃靜置2h，以每分鐘2000離心10分鐘，取上清液，過濾，同法測定。

3.3.以對照品溶液的枸櫞酸離子濃度對其相應的峰面積作直線回歸，求得直線回歸方程，計算出供試品溶液中枸櫞酸離子含量（mmol/L），再乘以相應的供試品稀釋倍數(shù)2，計算出供試品中枸櫞酸離子含量（mmol/L）。

4.實驗過程

4.1.實驗目的：考慮到季節(jié)變化對室溫的影響較大，考察樣品與1.5%磺基水楊酸的反應溫度是否會影響檢驗結(jié)果。

4.1.1.考察25℃、37℃、50℃時，對實驗結(jié)果是否產(chǎn)生影響，以某血液制品的不同批號的樣品為例：

表1 三批樣品與磺基水楊酸的不同反應溫度對實驗結(jié)果的影響

上述實驗數(shù)據(jù)可以看出，樣品與 1.5%磺基水楊酸的反應溫度會對實驗結(jié)果有影響，而反應溫度為40℃時的實驗結(jié)果，更接近理論值，因此對反應溫度為37℃時繼續(xù)進一步研究。

4.2.線性關(guān)系考察：按照“3.1”項下的步驟對和對照品進行處理，并取不同濃度的對照品 20ul進樣分析，其線性回歸方程為y=44906.6x+584.732 r=1.0

因此對照品的濃度適用于該濃度的樣品測定。

4.3.精密度：取中間濃度的枸櫞酸離子對照品，連續(xù)進樣 5次，枸櫞酸離子的保留時間RSD＜0.1%，峰面積的RSD＜0.1%，精密度符合色譜條件的規(guī)定。

4.4.重復性：按“3.2”的操作處理某一批樣品，重復6次，計算同一批次樣品的6個實驗結(jié)果，6個數(shù)據(jù)的枸櫞酸離子的含量RSD為0.8%。重復性良好。

4.5.準確度：在樣品中，加入80%、100%、120%的對照品溶液，計算回收率，結(jié)果如下表：

表2 回收率實驗數(shù)據(jù)

準確度良好。

4.6.中間精密度：不同化驗員對同一批次樣品進行檢驗，同一化驗員不同時間對同一批次樣品進行檢驗，相對偏差均符合規(guī)定。

5.結(jié)果與結(jié)論：根據(jù)以上方法學實驗表明，枸櫞酸離子含量的實驗數(shù)據(jù)與樣品和磺基水楊酸在37℃條件下，反應2h的實驗數(shù)據(jù)的準確度更準確[8]，因此反應條件定位37℃、2h。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].四部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：通則3108.

[2]王欣美,毛秀紅,王柯.離子色譜法同時測定中藥注射劑中亞硫酸鹽及枸櫞酸含量的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2012(3):64-66.

[3]顏金良,王立.離子色譜法同時測定血清和尿中草酸及枸櫞酸含量研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2010(3):478-480.

[4]王荔,宋國新,鄧春暉.陰離子交換離子色譜法測定卷煙紙中乙酸鹽、磷酸鹽和檸檬酸鹽含量[J].理化檢驗:化學分冊,2009(7):815-817.

[5]朱雪妍.離子色譜法測定血栓通注射液中輔料氯化鈉和枸櫞酸鈉的含量[J].藥物分析雜志,2015(7):1236-1239.

[6]寧洪鑫,王偉,楊穎,等.HPLC法測定注射液A中枸櫞酸根和醋酸根的含量[J].天津藥學,2006,18(5):8-9.

[7]張偉,任連杰,張彤,等.高效陰離子交換色譜法測定人凝血因子Ⅷ中枸櫞酸離子的含量[J].中國生物制品學雜志,2014,27(1):125-128.

[8]王敏力,楊鵬云,侯繼鋒.RP-HPLC法定量測定枸櫞酸離子含量[J].藥物分析雜志,2011(4):788-791.

R473.5

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1672-5018（2017）03-221-01