丁 康，張 輝，譚妍妍，朱維娜，李芷薇，陸 蔚，李睿瑛，趙 敏，丁 洋， 李 猛， 黃士財(cái)，丁義江，張?zhí)K閩

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 1. 肛腸科、2. 檢驗(yàn)科、3. 中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210001；南京中醫(yī)藥大學(xué) 4. 藥學(xué)院，5. 第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

基于蛋白芯片技術(shù)探討丁氏潰結(jié)灌腸液對(duì)結(jié)腸炎大鼠腸道組織差異蛋白表達(dá)的影響

丁 康1，張 輝2，譚妍妍1，朱維娜3，李芷薇4，陸 蔚5，李睿瑛5，趙 敏5，丁 洋5， 李 猛5， 黃士財(cái)5，丁義江1，張?zhí)K閩1

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 1. 肛腸科、2. 檢驗(yàn)科、3. 中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210001；南京中醫(yī)藥大學(xué) 4. 藥學(xué)院，5. 第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

目的基于蛋白芯片技術(shù)探討丁氏潰結(jié)灌腸液對(duì)結(jié)腸炎大鼠腸道組織相關(guān)靶點(diǎn)的影響，闡釋丁氏潰結(jié)灌腸液改善腸道炎癥反應(yīng)及腸纖維化的可能機(jī)制。方法大鼠隨機(jī)分為陽(yáng)性藥組、模型組、正常組、丁氏潰結(jié)灌腸液組，5只/組。除正常組之外，其他3組均給予3.5%硫酸葡聚糖鈉(dextran sulfate sodium, DSS)喂養(yǎng)，結(jié)腸炎造模成功后，陽(yáng)性藥組使用美沙拉秦灌腸，丁氏潰結(jié)灌腸液組使用丁氏潰結(jié)灌腸液灌腸，每天1次，連續(xù)4周，停藥1 d后，取大鼠結(jié)腸黏膜組織，采用GSR-CAA-67抗體蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)各組大鼠腸道組織炎癥反應(yīng)及腸纖維化相關(guān)蛋白的變化，篩選出各組差異性表達(dá)的蛋白。結(jié)果通過蛋白芯片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)共有8種有意義的差異蛋白，其中模型組和空白組對(duì)照組對(duì)比篩選出的8種蛋白包括IFN-γ、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)、TIMP-2、TIM-1、 IL-6、TIMP-1、TNF-α、IL-22，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另一方面，丁氏潰結(jié)灌腸液與美沙拉秦均對(duì)IL-6、TIMP-1有明顯的抑制作用(P<0.05)，丁氏潰結(jié)灌腸液對(duì)TNF-α、IL-22有抑制作用(P<0.05)，美沙拉秦組則沒有相同作用(P>0.05)。結(jié)論丁氏潰結(jié)灌腸液具有多靶點(diǎn)的作用，可能通過改善腸道炎癥反應(yīng)及腸纖維化達(dá)到治療潰瘍性結(jié)腸炎的目的。

蛋白芯片；丁氏潰結(jié)灌腸液；差異蛋白；潰瘍性結(jié)腸炎；大鼠；腸纖維化

丁氏潰結(jié)灌腸液為國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)“丁氏中醫(yī)診療法”第八代傳人丁澤民教授的經(jīng)典方，具有清熱利濕解毒、活血化瘀、怯腐生肌之功效，以中醫(yī)治法理論為依據(jù)，藥物組成主要包括金銀花、地榆、白及、珠黃散(乳香、珍珠粉、輕粉等)[1-2]，針對(duì)不同潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)患者、不同發(fā)病特點(diǎn)均可進(jìn)行治療，其在全國(guó)肛腸中心運(yùn)用于臨床50余年，有極好的療效。前期的研究發(fā)現(xiàn)，丁氏潰結(jié)灌腸液有著良好的療效[3-4]，并且揭示了其有可能治療的靶點(diǎn)和炎癥因子相關(guān)，具有較好的抗炎、修復(fù)黏膜和促進(jìn)潰瘍愈合的作用[5]。但缺乏完善的中醫(yī)理論的科學(xué)內(nèi)涵研究，從而限制了其推廣應(yīng)用，進(jìn)一步的研究希望通過高密度、高通量、高特異性的蛋白芯片技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，全面考察丁氏潰結(jié)灌腸液通過改善哪些差異性靶點(diǎn)的表達(dá)而起作用。1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康 SD 大鼠，20 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，♀♂各半，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001。

1.2藥物與試劑硫酸葡聚糖鈉(dextran sulfate sodium, DSS)購(gòu)自美國(guó) MP 公司，批號(hào)：MP16011090；ELISA 試 劑 盒 購(gòu) 自 Multisciences 公司，批號(hào)：237450922；GSR-CAA-67試劑盒購(gòu)自RayBiotech公司，藥物為南京市中醫(yī)院院內(nèi)制劑丁氏潰結(jié)灌腸液(處方包括：金銀花 120 g、地榆 120 g、白及 40 g、復(fù)方珠黃散 20 g)，蘇藥制字：Z040001781；美沙拉秦灌腸液由德國(guó)Falk公司生產(chǎn)60 g/4 g，批號(hào)：H20100253。

1.3方法

1.3.1造模與分組 20只SD大鼠隨機(jī)選取5只大鼠作為空白對(duì)照組，其余15只大鼠通過DSS法建立急性期潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模型。將DSS用蒸餾水配制成3.5%的溶液，造模組大鼠自由飲用，現(xiàn)喝現(xiàn)配，連飲7 d，空白對(duì)照組大鼠飲用純水。造模組大鼠出現(xiàn)腹瀉、便血、體重下降等癥狀，說明模型復(fù)制成功。造模成功后，將UC模型大鼠隨機(jī)分為3組，分別為模型組、美沙拉秦灌腸液組和潰結(jié)灌腸液組，每組5只。停飲DSS，各組飲水恢復(fù)正常，開始灌腸給藥。按非標(biāo)準(zhǔn)體重動(dòng)物的校正系數(shù)表，人與大鼠換算系數(shù)為6.17，折算大鼠用藥量為6 g·kg-1灌腸，美沙拉秦灌腸液組予美沙拉秦灌腸液2.4 g·kg-1灌腸，灌腸量均10mL·kg-1。模型組大鼠給予等劑量生理鹽水灌腸，空白對(duì)照組自由喂養(yǎng)，不予灌腸處理。灌腸3 d后，除空白對(duì)照組外，其余各組復(fù)飲4% DSS 5 d，同時(shí)繼續(xù)灌腸治療，7 d后停飲DSS，恢復(fù)正常飲水，再繼續(xù)灌腸治療6 d，按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程將大鼠處死后，取20個(gè)腸道組織樣本，采用RayBiotech試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2采用GSR-CAA-67蛋白芯片技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

1.3.2.1芯片檢測(cè)原理及指標(biāo) 見Fig 1、Tab 1。

1.3.2.2蛋白芯片實(shí)驗(yàn)步驟 ① 組織裂解：按100 mg組織加入500 μL裂解液，冰上裂解；在冰上用高速分散切割機(jī)進(jìn)行破碎組織，離心取上清。②芯片操作流程：每個(gè)孔中加100 μL的樣品稀釋液，添加100 μL的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品到孔中，在搖床4℃過夜孵育。使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板機(jī)清洗玻片。檢測(cè)抗體混合物的孵育Cy3-鏈霉親和素的孵育，采用激光掃描儀例如Inno Scan300掃描信號(hào)，采用Cy3或者綠色通道(激發(fā)頻率=532nm)。

2 結(jié)果

通過GSR-CAA-67芯片篩查共驗(yàn)證B7-2、β-NGF、CINC-1、CINC-2、CINC-3、CNTF、Fractalkine、GM-CSF、ICAM-1、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、LIX、L-Selectin、MCP-1、PDGF-AA、Prolactin R、RAGE、TCK-1、TIMP-1、TNF-α、VEGF、4-1BB、Activin A、Adiponectin、B7-1、CD48、CTACK、Decorin、Eotaxin、EphA5、Erythropoietin、FGF-BP、Flt-3L、Galectin-1、Galectin-3、Gas 1、GFR alpha-1、gp130、HGF、IL-1 R6、IL-1 rα、IL-2 Rα、IL-3、IL-7、IL-17F、IL-22、JAM-A、MIP-1α、Neuropilin-1、Neuropilin-2、Nope、Notch-1、Notch-2、P-Cadherin、Prolactin、RANTES、SCF、TIM-1、TIMP-2、TREM-1、TWEAK R共67種蛋白，其中篩選出8種在模型組與空白對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白(Tab 2、Fig 2)。

Tab 1 Protein array indicators (according to names alphabetically)

Fig 1 Detection principle of protein array

針對(duì)8種差異蛋白進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及作圖，F(xiàn)ig 3顯示，模型組與空白對(duì)照組比較，有4種蛋白IFN-γ、EPO、TIMP-2和TIM-1差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而丁氏潰結(jié)灌腸液及美沙拉秦組與模型組比較沒有明顯的變化(P>0.05)，提示兩種藥物對(duì)上述靶點(diǎn)沒有改善作用。Fig 4結(jié)果顯示，模型組和空白組與對(duì)照組比較，有另外4種蛋白IL-6、TIMP-1、TNF-α和IL-22差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，丁氏潰結(jié)灌腸液與美沙拉秦均對(duì)IL-6、TIMP-1蛋白表達(dá)有明顯抑制作用(P<0.05)，此外，丁氏潰結(jié)灌腸液對(duì)TNF-α、IL-22蛋白表達(dá)也有明顯抑制作用(P<0.05)，美沙拉秦組則沒有類似作用(P<0.05)。3討論

丁氏潰結(jié)灌腸液是國(guó)家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)丁氏診療法所涉及方藥的重要組成部分，本課題組長(zhǎng)期開展此復(fù)方的臨床研究，取得了較滿意的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)治療后UC患者的膿血便、黏液便和潰瘍病變均明顯改善。與陽(yáng)性藥物對(duì)比，患者在大便次數(shù)、Sourtherland DAI評(píng)分、有效率方面的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明丁氏潰結(jié)灌腸液在療效上不劣于陽(yáng)性藥，可為臨床提供一種副作用小、安全可靠的補(bǔ)充治療方法。鑒于丁氏潰結(jié)灌腸液在UC的治療上取得了明顯的療效，課題組跟蹤南京中醫(yī)院治療UC處方中發(fā)現(xiàn)此制劑使用量極大，近5年的年用量均在萬(wàn)瓶以上，且呈逐年增加之勢(shì)，經(jīng)濟(jì)效益明顯，其確切的療效深受廣大患者的認(rèn)同，下一步需要對(duì)其治療機(jī)制進(jìn)行科學(xué)研究。高密度、高通量、高特異性的蛋白芯片技術(shù)在生物標(biāo)志物的篩查、疾病機(jī)制探究等方面應(yīng)用廣泛，能避免盲目挑選細(xì)胞因子，省時(shí)省力并節(jié)省寶貴的樣品。本課題組希望通過此技術(shù)全面考察丁氏潰結(jié)灌腸液是通過改善哪些蛋白靶點(diǎn)的表達(dá)從而發(fā)揮作用。

Tab 2 Difference expression of proteins in rat intestinal tissues(±s)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel

Fig 2 Fluorescence signal intensity picture

Fig 3 Tendency of differences in protein(IFN-γ, erythropoietin, TIM-1, TIMP-2)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

UC患者具有慢性復(fù)發(fā)和遷延難愈的特點(diǎn)，其慢性非特異性炎癥引發(fā)了機(jī)體對(duì)結(jié)腸壁反復(fù)的修復(fù)，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成分泌增加，降解減少，在組織內(nèi)過度沉積，導(dǎo)致原有正常結(jié)構(gòu)和組織形態(tài)改變，腸道縮短，腸纖維化形成[6]。長(zhǎng)期嚴(yán)重的組織纖維化，將導(dǎo)致大量的組織細(xì)胞被膠原纖維與 ECM 所替代，從而引發(fā)臟器功能下降，并引起腸腔狹窄和腸壁順從性喪失，患者腹痛、腹瀉等癥狀加重， 既然腸纖維化是 UC發(fā)病過程中常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，其發(fā)生發(fā)展是個(gè)復(fù)雜多變的過程，針對(duì)于此的治療非常重要。UC 的治療主要應(yīng)用柳氮磺胺吡啶(SASP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體和白細(xì)胞介素-10 (IL-10)等，均對(duì)于纖維化無能為力。腸纖維化的形成與ECM合成增加的病理改變、腸道肌層的過度生長(zhǎng)密切相關(guān)，而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)平衡對(duì)維持ECM的正常代謝至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs可降解過多生成的ECM，TIMPs則導(dǎo)致ECM降解異常，因此，MMPs與TIMPs的失衡則導(dǎo)致腸纖維化[7]。己發(fā)現(xiàn)的TIMPs 酶有4種，TIMP-1 (28 ku)廣泛存在于組織和體液中，能被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，在腸纖維化的發(fā)生中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，DSS造模后TIMP-1表達(dá)明顯上升，MMPs活性被抑制，進(jìn)一步導(dǎo)致腸道纖維化的發(fā)生，而中藥可能是通過抑制 TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)而降低對(duì)MMPs的抑制，有利于 MMPs對(duì)ECM的降解，阻止腸纖維化的發(fā)生，從而達(dá)到治療的目的，可以彌補(bǔ)通過改善纖維化的過程治療UC的空白。

UC的發(fā)生與感染、環(huán)境、免疫以及遺傳等多種因素有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚，有報(bào)道，免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中炎癥細(xì)胞因子在UC的發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用[8]。 促炎細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-6等的過度產(chǎn)生和抑炎因子如 IL-22 等生成不足，IL-22又具有雙向作用，在某些環(huán)境下表現(xiàn)出抗炎活性，而在另一些環(huán)境中可表現(xiàn)為放大炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞因子導(dǎo)致腸道內(nèi)環(huán)境紊亂是促使UC發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[9]。TNF-α 是炎癥性腸病，特別是潰瘍性結(jié)腸炎病理進(jìn)

Fig 4 Tendency of differences in protein(IL-6, TIMP-1, TNF-α, IL-22)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel

程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，通過表達(dá)黏附分子、成纖維增殖因子、凝血因子以及啟動(dòng)細(xì)胞毒性、凋亡和急性期反應(yīng)等過程發(fā)揮作用。IL-6是一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中啟動(dòng)了細(xì)胞表面信號(hào)復(fù)合體(包括 IL-6、sIL-6R及共享信號(hào)受體gp130)發(fā)揮作用。亦有研究表明，中藥的提取物可減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠體重下降，改變腸損傷程度，其機(jī)制與降低TNF-α、IL-6水平有關(guān)[10]。在UC發(fā)病機(jī)制及隨后的UC相關(guān)結(jié)腸腫瘤形成中，IL-6主要通過STAT3信號(hào)通路發(fā)揮重要作用[11]。IL-22/JAK-STAT通路也是UC發(fā)病機(jī)制中的重要信號(hào)通路，STAT3的磷酸化是IL-22在上皮細(xì)胞屏障表面介導(dǎo)效應(yīng)的基本途徑。已經(jīng)證實(shí)了在口服葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)結(jié)腸炎腸上皮細(xì)胞，STAT3活化更依賴IL-22[12]。也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-22/STAT3信號(hào)通路與UC及其致癌作用相關(guān)，IL-22及受體在UC及不典型增生患者結(jié)腸黏膜中表達(dá)升高，并且使STAT3磷酸化[13]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組和空白對(duì)照組相比，炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-22差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，丁氏潰結(jié)灌腸液對(duì)IL-6、TNF-α、IL-22的異常表達(dá)均有抑制作用，表明丁氏潰結(jié)灌腸液可通過改善腸道炎癥反應(yīng)起到治療UC的作用。

總之，本研究初步發(fā)現(xiàn)國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)丁氏潰結(jié)灌腸液可能通過改善腸道炎癥反應(yīng)及腸纖維化，達(dá)到治療UC的目的，進(jìn)一步的研究將對(duì)可能機(jī)制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及深入探討。

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EffectofDing’sherbenemaprescriptiononintestinaltissuerelateddifferencestargetinratcolitisusingproteinarraytechnology

DING Kang1, ZHANG Hui2, TAN Yan-yan1, ZHU Wei-na3, LI Zhi-wei4, LU Wei5, LI Rui-ying5, ZHAO Min5, DING Yang5, LI Meng5, HUANG Shi-cai5, DING Yi-jiang1, ZHANG Su-min1

(1.NationalCenterofColorectalSurgery, 2.ClinicalLaboratory, 3.CentralLaboratory,theThirdAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210001,China; 4.SchoolofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine, 5.theFirstClinicalMedicalCollege,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

AimTo investigate the effect of Ding’s herb enema prescription on intestinal tissue related target in rat colitis induced by dextran sulfate sodium(DSS), and to elucidate the mechanism of Ding’s herb enema prescription in improving the intestinal inflammation and intestinal fibrosis.MethodsRats were fed with 3.5% DSS. The rats were randomly divided into positive drug group, model group, Control group, and Ding’s herb enema prescription group. The positive drug group was treated with mesalazine enema, and Ding’s herb enema prescription group was treated with Ding’s herb enema prescription. The colon mucosa was taken once a day for 6 weeks. The changes of intestinal inflammatory response and intestinal fibrosis related proteins were detected by GSR-CAA-67 antibody protein array, and the differentially expressed proteins were screened out.ResultsEight proteins showed statistical differences, including IFN-γ, erythropoietin(EPO), TIMP-2, TIM-1, IL-6, TIMP-1, TNF-α, IL-22 (P<0.05). On the other hand, Ding’s herb enema prescription and mesalazine significantly antagonized the effect of IL-6 and TIMP-1 (P<0.05). The antagonized effect of Ding's embolization enema on TNF-α and IL-22 was also significant(P<0.05), but mesalazine had no similar effect (P>0.05).ConclusionsDing’s herb enema prescription has the effect of multiple targets, which may improve the intestinal inflammatory response and intestinal fibrosis to achieve the purpose of treatment of ulcerative colitis(UC).

protein array; Ding’s herb enema prescription; differences protein; ulcerative colitis; rat colitis induced by DSS; intestinal fibrosis

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.028

A

：1001-1978(2017)10-1473-06

R-332；R289.1；R322.45；R394-33；R452；R574.62；R977.6

時(shí)間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.056.html

2017-06-10,

2017-08-26

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No BK-20151082)；南京市衛(wèi)計(jì)委重點(diǎn)項(xiàng)目(No ZKX16056)；江蘇省普通高校專業(yè)學(xué)位研究生實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(No SJZZ16_0174)；2016年度博士后科研資助項(xiàng)目(No BSH201501)

丁 康(1980-)，男，博士，研究方向：炎癥性腸病臨床及基礎(chǔ)，E-mail：dingkang1980@163.com； 張?zhí)K閩(1956-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：炎癥性腸病臨床及基礎(chǔ)，通訊作者，E-mail：51422503@qq.com； 丁義江(1946-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：國(guó)家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)丁氏痔科醫(yī)術(shù)的傳承及發(fā)展，通訊作者，E-mail：49280159@qq.com