黃 娟，廖 君，彭熙煒，劉 洋，成紹武，秦莉花，鄧奕輝，王國佐，賀 旭,2，葛金文

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南 長沙 410208；2. 益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖教研室，湖南 益陽 413000)

◇復(fù)方藥物藥理學(xué)◇

腦泰方對腦缺血/再灌注大鼠海馬區(qū)Nrf2、HO-1和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白表達(dá)的影響

黃 娟1，廖 君1，彭熙煒1，劉 洋1，成紹武1，秦莉花1，鄧奕輝1，王國佐1，賀 旭1,2，葛金文1

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南 長沙 410208；2. 益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖教研室，湖南 益陽 413000)

腦泰方；腦缺血/再灌注損傷；核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子；血紅素加氧酶-1；膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白；鐵代謝失衡

腦缺血/再灌注損傷機(jī)制包括興奮性氨基酸毒性，氧自由基大量生成，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，線粒體損傷，細(xì)胞凋亡和免疫炎癥損傷等[1]。近年來，鐵代謝失衡作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病損傷機(jī)制研究受到廣泛關(guān)注[2]。我們課題組前期研究表明，鐵調(diào)節(jié)失衡可能是導(dǎo)致腦缺血神經(jīng)元損傷的新機(jī)制，而腦泰方(Naotai formula extract，NTE)可通過調(diào)節(jié)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制鐵的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)胞內(nèi)鐵外排，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用[3-5]。氧自由基是導(dǎo)致缺血/再灌注損傷機(jī)制之一[6]。神經(jīng)退行性疾病中線粒體內(nèi)鐵聚集導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷[7]，Liu 等[8]提出氧化應(yīng)激在缺血/再灌注損傷中扮演重要角色，血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是重要的血紅素降解酶，具有抗炎抗凋亡作用。因此，我們推測鐵代謝失衡可能是腦缺血/再灌注損傷的新機(jī)制，本研究擬探討腦缺血/再灌注大鼠海馬組織核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2)、HO-1和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白(hephaestin，Heph)的表達(dá)及腦泰方發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物Sprague-Dawley(SD)♂大鼠80只，體質(zhì)量250 ～280 g，SPF級，8周齡。由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號: SCXK(湘)2013-0004，動物合格證號：43004700023825。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，濕度45%～65%、室溫25℃、自由飲水、攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物腦泰方組方由黃芪、川芎、地龍和僵蠶四味藥組成。黃芪主要成分為黃芪甲苷，具有抗腦缺血/再灌注損傷及氧化應(yīng)激等作用；川芎的主要成分為川芎嗪，具有保護(hù)血管內(nèi)皮、抗缺血/再灌注損傷、抗氧化應(yīng)激等作用；地龍?zhí)崛∫壕哂锌寡踝杂苫?、脂質(zhì)過氧化、炎性因子損傷作用；僵蠶提取物具有抗凝、抗血栓、促纖溶等作用。藥材均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。藥材經(jīng)水煎、醇提后制成浸膏粉(由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑教研室提取)，臨用時(shí)以生理鹽水調(diào)成所需濃度。

1.3儀器與試劑Real-Time PCR儀(7500，ABI)；凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳槽(Bio-Rad)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)；Nrf2多克隆抗體(批號：sc-722)、HO-1多克隆抗體(批號:sc-1796)、Heph多克隆抗體(批號:sc-49969S)均購自Santa Cruz；PVDF膜(Millipore公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(GE Healthcare)；去鐵酮(加拿大奧貝泰克制藥有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(上海如吉生物科技有限公司)；水合氯醛(國藥集團(tuán))；線栓(2636 A4，北京西濃)。2方法

2.1分組及給藥方法隨機(jī)數(shù)字表法將80只大鼠分為5組，每組16只，分別為假手術(shù)組(Sham，灌胃生理鹽水)、模型組(I/R，灌胃生理鹽水)、腦泰方低、中、高劑量組(NTE+I/R, 灌胃劑量分別是4.5、9、18 g·kg-1) 。藥物劑量按公式計(jì)算：大鼠劑量/g=成人每日劑量(g)×大鼠體重與體表面積比值/人體重與體表面積比值[9]。每只大鼠術(shù)前灌胃3 d、術(shù)后灌胃2 d，每日1次，于術(shù)后d 3處死取材。

2.2動物造模采用改良的線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型[10]。阻塞右側(cè)大腦中動脈2 h后拔出線栓，造成腦缺血/再灌注模型，假手術(shù)組只分離血管，不插入線栓。麻醉清醒后，采用神經(jīng)行為學(xué)評分判斷模型是否成功。

2.3指標(biāo)檢測

2.3.1神經(jīng)行為學(xué)評分 大鼠缺血/再灌注后72 h評分，采用Zea Longa等[11]制定5級4分制評分標(biāo)準(zhǔn)。0 分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：向?qū)?cè)傾倒；4 分：不能自發(fā)行走，意識喪失；分值越高，說明動物行為障礙越嚴(yán)重。

3 結(jié)果

3.1神經(jīng)行為學(xué)評分結(jié)果缺血/再灌注后72 h，與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)行為學(xué)評分明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，NTE中、高劑量組神經(jīng)行為學(xué)評分明顯降低(P<0.01)，NTE低劑量組與模型組比較差異無顯著性(P>0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Effects of Naotai formula extract (NTE) on neurologicaldeficit scores of I/R in rats (±s, n=16)

**P<0.01vssham;##P<0.01vsI/R

3.2TTC染色結(jié)果TTC染色后，與假手術(shù)組比較，模型組呈現(xiàn)較大梗死面積(P<0.01)；與模型組比較，NTE各劑量組梗死范圍明顯縮小(P<0.01)，見Fig 2。

Fig 2 Effects of naotai formula extracton infarct volume of I/R in rats(±s,n=6)

A:Coronal sections of 2,3,5-triphenyltetrazolium-stained brains；B：Infarct volume.**P<0.01vssham;##P<0.01vsI/R.

3.3Real-timePCR檢測結(jié)果與模型組比較，各NTE劑量組HO-1 mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，NTE中、高劑量組Heph mRNA 表達(dá)明顯增加(P<0.05)。各NTE劑量組中Nrf2 mRNA表達(dá)增高，但與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見Fig 3。

Fig 3 Effects of naotai formula extract on hippocampus Nrf2(A), HO-1 (B) and Heph (C) mRNA levels of I/R in rats(±s, n=5)

#P<0.05vsI/R

3.4Westernblot檢測結(jié)果假手術(shù)組中Nrf2、HO-1和Heph蛋白呈少量表達(dá)，模型組中Nrf2蛋白表達(dá)增加，HO-1和Heph蛋白表達(dá)降低，但與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各NTE組能不同程度上調(diào)Nrf2、HO-1和Heph蛋白表達(dá)，其中NTE中、高劑量組Nrf2和Heph蛋白的表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05，P<0.01)；各NTE劑量組HO-1的表達(dá)較模型組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見Fig 4。

Fig 4 Effects of naotai formula extract on hippocampus Nrf2(A), HO-1(B) and Heph (C) protein levels of I/R in rats(±s, n=5)

#P<0.05，##P<0.01vsI/R

4 討論

腦缺血/再灌注后因自由基大量生成、興奮性氨基酸毒性、鈣超載及炎癥反應(yīng)等原因?qū)е履X損傷[12-13]。近年來也有研究表明，腦缺血/再灌注損傷與自噬、鐵代謝等相關(guān)。腦缺血/再灌注后鐵過載的兩條途徑： IL-6表達(dá)上調(diào)，激活JAK/STAT3通路使鐵調(diào)素增加，而鐵調(diào)素可以使膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)下降，因此鐵外排減少，造成鐵沉積；再灌注后低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)上調(diào)，使轉(zhuǎn)鐵蛋白受體增加，導(dǎo)致鐵在缺血組織中的沉積[14]。腦缺血/再灌注后腦鐵超載能通過氧化損傷或直接的神經(jīng)毒性等機(jī)制加重神經(jīng)損傷，引起細(xì)胞鐵死亡[15]。

Keap1-Nrf2/ARE信號通路在抗氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮重要的作用。在生理狀態(tài)下，Nrf2與果蠅肌動蛋白結(jié)合蛋白(Keap1)結(jié)合位于胞質(zhì)中，從而不能進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)受到氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2與Keap1解離進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)組件ARE結(jié)合，從而啟動下游抗氧化基因和 HO-1 的轉(zhuǎn)錄，提高細(xì)胞的的抗氧化應(yīng)激能力。 Keap1-Nrf2/ARE通路可以靶向調(diào)節(jié)與鐵代謝密切相關(guān)的蛋白，如鐵蛋白和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝[16]。HO-1作為一種與鐵代謝相關(guān)的應(yīng)激蛋白，HO-1可以將血紅素分解成為膽綠素、CO和鐵，應(yīng)激狀態(tài)下能對抗氧化應(yīng)激起到保護(hù)作用，而慢性過表達(dá)時(shí)可以促使鐵沉積，通過Fenton反應(yīng)，生成毒性更大的羥自由基[17]。Heph在皮質(zhì)、紋狀體、海馬、黑質(zhì)、腦干等部位均有表達(dá)[18]，在腦鐵代謝中發(fā)揮重要的作用。Heph屬于鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，具有亞鐵氧化酶活性，能將二價(jià)鐵氧化成三價(jià)，與膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同調(diào)節(jié)鐵釋放，減輕鐵過載誘發(fā)的氧化損傷。已有研究報(bào)道，大鼠腦缺血/再灌注后損傷區(qū)Nrf2 表達(dá)迅速上調(diào)，而再灌注后3～72 h各時(shí)間點(diǎn)，Nrf2蛋白的表達(dá)變化不明顯；HO-1蛋白的表達(dá)在48 h達(dá)高峰，在72 h逐漸下降[19]。 缺血/再灌注后12 h皮層和紋狀體中Heph蛋白表達(dá)明顯增加，在24 h達(dá)到峰值，在72 h恢復(fù)到正常水平[20]。腦缺血/再灌注后Keap1-Nrf2/ARE信號通路激活，急性期HO-1及Heph表達(dá)增加可減少氧化應(yīng)激損傷，這是一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，但是反應(yīng)持續(xù)時(shí)間短，因此需要藥物干預(yù)缺血/再灌注損傷。腦缺血后，中藥補(bǔ)陽還五湯精簡方干預(yù)可以上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白和基因的表達(dá)，明顯改善其神經(jīng)功能缺失癥狀，減小腦梗死面積，減輕腦組織水腫[21]。黃芪與三七有效成分配伍作用腦缺血/再灌注后小鼠，單用黃芪甲苷組能降低胞質(zhì)Nrf2蛋白含量，胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)升高，同時(shí)上調(diào)HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍的效應(yīng)最明顯[22]。本研究中腦缺血/再灌注后腦泰方干預(yù)，腦泰方各劑量組神經(jīng)行為學(xué)評分較模型組降低，大鼠神經(jīng)功能得到改善，腦梗死體積縮小，缺血/再灌注損傷的海馬組織 HO-1和Heph mRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)， Nrf2蛋白表達(dá)增高，而Nrf2 mRNA表達(dá)上調(diào)不明顯，這與蛋白表達(dá)不相一致，提示Nrf2調(diào)控并非發(fā)生于基因轉(zhuǎn)錄水平，可能是因?yàn)镹rf2轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)而mRNA表達(dá)無明顯改變[23]。

因此，我們推測細(xì)胞內(nèi)鐵代謝失衡是腦缺血/再灌注損傷的機(jī)制，腦泰方可能通過激活Keap1-Nrf2/ARE通路，促進(jìn)HO-1 和Heph表達(dá)，促進(jìn)鐵外排，降低腦鐵沉積，抑制鐵離子介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，具有平衡鐵代謝，保護(hù)神經(jīng)元，恢復(fù)神經(jīng)功能的作用。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室及課題組老師和同學(xué)的幫助。)

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EffectsofNaotaiformulaonexpressionofNrf2,HO-1andhephaestininhippocampusofcerebralischemia/reperfusionrats

HUANG Juan1, LIAO Jun1, PENG Xi-wei1, LIU Yang1, CHENG Shao-wu1, QIN Li-hua1, DENG Yi-hui1, WANG Guo-zuo1, HE Xu1,2, GE Jin-wen1

(1.KeyLabofHunanProvinceforIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineonPreventionandTreatmentofCardio-CerebralDiseases,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China; 2.DeptofAnatomy,YiyangMedicalCollege,YiyangHunan413000,China)

AimTo investigate the effects of Naotai formula extract(NTE)on the expression of heme oxygenase-1(HO-1) and hephaestin(Heph) in hippocampus of rats after cerebral ischemia/reperfusion by Keap1-Nrf2/ARE signaling pathway.MethodsEighty rats were randomly divided into five groups as follows: sham operation group(Sham), cerebral ischemia/reperfusion group(I/R), low dose group of NTE(4.5 g·kg-1), middle dose group of NTE (9 g·kg-1) and high dose group of NTE(18 g·kg-1). Rats were pretreated by intragastric administration for three consecutive days, and then subjected to middle cerebral artery occlusion (MCAO) 2 hours before reperfusion. The rats were administered with intragastric administration for two days. After cerebral ischemia reperfusion 72 hours, the behavioral activity of rats was recorded by Zea Longa neurological score, and the infarct volume was measured by TTC staining. The expressions of Nrf2, HO-1 and Heph in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats were observed by real-time quantitative PCR and Western blot, respectively.ResultsCompared with model group, the neurobehavioral scores significantly decreased in NTE high-dose and middle-dose groups (P<0.01); the infarct volume of NTE groups markedly decreased (P<0.01); the expression of HO-1 mRNA apparently increased (P<0.05) in NTE groups; the expression of Heph mRNA significantly increased in NTE middle-dose and high-dose groups (P<0.05); the expression of Nrf2 and Heph protein evidently increased in the NTE middle and high dose groups (P<0.05,P<0.01); and the expression of HO-1 protein also increased in NTE groups(P<0.01).ConclusionsNaotai formula can relieve cerebral ischemia-reperfusion injury. The mechanism might be associated with activating Keap1-Nrf2/ARE signaling pathways, promoting HO-1 generation, advancing the expression of Heph, and then reducing brain iron deposition, to achieve the protection of neurons after cerebral ischemia-reperfusion.

Naotai formula extract(NTE); cerebral ischemia-reperfusion injury; nuclear factor-erythroid 2 related factor; heme oxygenase-1; hephaestin; iron metabolism imbalance

：目的研究益氣活血中藥腦泰方通過Keap1-Nrf2/ARE信號通路對腦缺血/再灌注后大鼠海馬區(qū)血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白(hephaestin，Heph)表達(dá)的影響。方法將80只♂大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腦泰方低劑量組(4.5 g·kg-1)、中劑量組(9 g·kg-1)和高劑量組(18 g·kg-1)。各組大鼠術(shù)前連續(xù)灌胃給藥3 d，每日1次，再行大腦中動脈線栓法腦缺血/再灌注模型制備術(shù)，術(shù)后連續(xù)灌胃給藥2 d。術(shù)后72 h采用Zea Longa神經(jīng)功能學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)記錄大鼠行為活動，TTC染色法測定腦梗死體積，real-time PCR檢測大鼠海馬區(qū)Nrf2、HO-1、Heph的mRNA表達(dá)，Western blot檢測 Nrf2、HO-1、Heph的蛋白表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，腦泰方中、高劑量組的神經(jīng)行為學(xué)評分明顯下降(P<0.01)，各腦泰方組腦梗死體積明顯縮小(P<0.01)；HO-1 mRNA表達(dá)均增加(P<0.05)。腦泰方中、高劑量組Heph mRNA表達(dá)增加(P<0.05)；Nrf2和Heph蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05，P<0.01)。各腦泰方組HO-1蛋白表達(dá)增高(P<0.01)。結(jié)論腦泰方能減輕腦缺血/再灌注損傷，其機(jī)制可能是通過激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路，促進(jìn)HO-1生成，上調(diào)Heph的表達(dá)，減少腦鐵沉積，發(fā)揮腦缺血/再灌注后神經(jīng)元的保護(hù)作用。

時(shí)間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.054.html

2017-05-16,

2017-08-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81303078)；湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No 2014SK2007)；湖南省教育廳優(yōu)秀博士學(xué)位論文獲得者科研項(xiàng)目(No YB2016B030)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(No CX2015B331)

黃 娟(1991-)，女，碩士生，研究方向：心腦血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合防治，E-mail：674630362@qq.com； 廖 君(1978-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腦缺血的中醫(yī)藥防治，通訊作者，E-mail：84085006@qq.com； 葛金文(1964-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心腦血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合防治，通訊作者，E-mail：40831556@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.027

A

：1001-1978(2017)10-1467-06

R-332；R282.71；R322.81；R743.310.22；R977.3；R977.6