馬如風(fēng)，王麗麗，左加成，朱如愿，劉海霞，柳辰玥，李 琳，陳貝貝，趙丹丹，莫芳芳，牛建昭，高思華，張東偉

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 1. 中醫(yī)學(xué)院, 2. 中藥學(xué)院, 3. 糖尿病研究中心，北京 100029)

姜黃素通過調(diào)節(jié)組織蛋白酶K改善高脂誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠骨結(jié)構(gòu)和骨質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)研究

馬如風(fēng)1，王麗麗1，左加成1，朱如愿1，劉海霞1，柳辰玥2，李 琳1，陳貝貝1，趙丹丹3，莫芳芳3，牛建昭1，高思華3，張東偉3

(北京中醫(yī)藥大學(xué) 1. 中醫(yī)學(xué)院, 2. 中藥學(xué)院, 3. 糖尿病研究中心，北京 100029)

目的探討姜黃素對(duì)高脂誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠骨結(jié)構(gòu)和骨質(zhì)量的影響及其與組織蛋白酶K(cathepsin K)表達(dá)的相關(guān)性。方法用姜黃素(50 mg·kg-1)干預(yù)高脂飼料誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠骨質(zhì)疏松模型12周后，取小鼠股骨和脛骨，分別用HE染色、茜素紅染色和番紅O /固綠染色觀察骨組織微結(jié)構(gòu)變化、骨代謝以及骨發(fā)育情況；用免疫組化法和Western blot法檢測(cè)小鼠骨組織中組織蛋白酶K蛋白的表達(dá)。結(jié)果病理形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，姜黃素能明顯改善高脂誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠的骨組織微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)軟骨發(fā)育和改善骨鈣化程度；骨生物力學(xué)結(jié)果表明，姜黃素能明顯提高高脂誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠的骨強(qiáng)度；免疫組化和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，姜黃素能夠明顯抑制小鼠骨組織中的組織蛋白酶K表達(dá)。結(jié)論姜黃素能提高高脂誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠的骨強(qiáng)度，改善骨微結(jié)構(gòu)，其發(fā)揮骨保護(hù)作用機(jī)制之一可能與抑制組織蛋白酶K的表達(dá)相關(guān)。

姜黃素；骨微結(jié)構(gòu)；骨生物力學(xué)；骨鈣化；組織蛋白酶K；C57BL/6J小鼠

糖尿病性骨質(zhì)疏松(diabetic osteoporosis, DOP)是一種由糖尿病誘發(fā)的慢性骨代謝疾病，臨床研究表明，1/2～2/3的糖尿病患者伴有骨強(qiáng)度的下降，其中有近1/3的患者可診斷為骨質(zhì)疏松[1]。糖尿病誘發(fā)骨代謝紊亂，使骨骼變脆而缺少韌性，尤其是在發(fā)病后期稍遇外力則易發(fā)生骨折[2-3]。DOP的發(fā)病機(jī)制涉及到破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)、成骨細(xì)胞活性減弱、骨微循環(huán)異常、氧化應(yīng)激以及晚期糖基化終末產(chǎn)物增加等因素[2,4-5]。有研究證明，糖尿病大鼠[6]和糖尿病絕經(jīng)期婦女[7]骨組織中組織蛋白酶K的表達(dá)水平明顯升高，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的活化和骨吸收增強(qiáng)。因此，組織蛋白酶K在DOP的發(fā)生和發(fā)展過程中有重要的作用。

姜黃首載于唐代《新修本草》中，具有行氣活血、通經(jīng)止痛、祛風(fēng)痹痛等功效。姜黃素(Curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)等根莖中提取的一種酚類化合物，是中藥郁金、姜黃的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、防治糖尿病[8]及其并發(fā)癥[9-10]的作用。本實(shí)驗(yàn)室和其他實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果均表明，姜黃素能降低2型糖尿病模型動(dòng)物的血糖水平，改善胰島素抵抗[11-13]，但是姜黃素是否具有改善DOP的作用目前還未知。因此，為了探索姜黃素對(duì)DOP的作用和可能的作用機(jī)制，本研究擬以高脂飼料誘導(dǎo)C57BL/6J模型為基礎(chǔ)，觀察姜黃素治療12周后，小鼠骨組織的病理變化和生物力學(xué)變化，以及其對(duì)骨質(zhì)疏松關(guān)鍵酶組織蛋白酶K的調(diào)節(jié)作用。1材料

1.1儀器萊卡石蠟切片機(jī)(德國(guó))；Olympus BX53倒置熒光顯微鏡(日本)；博勒飛質(zhì)構(gòu)儀CT3(美國(guó))；Azure c300化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó))。

1.2試劑與藥物姜黃素(上海升華醫(yī)藥科技有限公司)；ECL超敏發(fā)光液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；鹽酸吡格列酮片(pioglitazone，北京太平洋藥業(yè)有限公司，批號(hào)：140908，規(guī)格：15 mg/片)；茜素紅、番紅O、固綠(Sigma-Aldrich，美國(guó))；Cathepsin K抗體(H-130，sc28867, Santa Cruz)。

1.3動(dòng)物♂ SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，平均體質(zhì)量20 g，購(gòu)自斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2011-0004。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，合格證號(hào)SCXK(京)2011-0024，室溫22℃，相對(duì)濕度(55±5)%，光暗周期12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)期間小鼠給予自由飲水。2方法

2.1高脂動(dòng)物模型的構(gòu)建將C57BL/6J ♂小鼠用高脂飼料(20%蔗糖、2.5%膽固醇、10%豬油、1%膽酸鈉、66.5%基礎(chǔ)飼料，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司)喂養(yǎng)1個(gè)月后，選取血糖≥11.1 mmol·L-1的小鼠30只，隨機(jī)等分為模型組(Model group)、陽性藥吡格列酮組(pioglitazone group)和姜黃素組(curcumin group)，同時(shí)設(shè)正常組(Normal group)小鼠10只，普通飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，正常組和模型組小鼠給予去離子水灌胃，陽性藥組小鼠給予吡格列酮(10 mg·kg-1)，姜黃素組小鼠給予姜黃素(50 mg·kg-1)，連續(xù)給藥12周。除正常組外，其余各組小鼠均給予高脂飼料喂養(yǎng)。

2.2取材及樣品制備12周后，小鼠用1%戊巴比妥(0.04 mL·kg-1)腹腔麻醉處死。然后分離兩側(cè)股骨和脛骨，剝離附著的肌肉組織。將右側(cè)股骨、脛骨用生理鹽水浸濕的紗布包被，置-80℃?zhèn)溆?，左?cè)股骨先置于10%中性福爾馬林中固定72 h后，用15% EDTA鈉(pH 7.4)溶液脫鈣，脫鈣液每2周更換1次，連續(xù)脫鈣3個(gè)月后沖水，包埋，切片備用。

2.3骨生物力學(xué)的測(cè)定用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)各組小鼠股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)。將小鼠股骨置于跨距為7 mm的2個(gè)支撐點(diǎn)上，標(biāo)本的寬面朝上水平放置，使探頭以10 mm·min-1的速度緩慢下降，標(biāo)本斷裂后繼續(xù)運(yùn)行2 mm停止。根據(jù)探頭下降的距離與載荷，結(jié)合骨斷端直徑，計(jì)算出第一循環(huán)硬度、硬度形變量、峰值壓力等骨生物力學(xué)參數(shù)。

2.4骨組織HE染色將股骨石蠟切片(5 μm)常規(guī)HE染色，透明，封片，顯微鏡下觀察病理變化并拍照。

2.5茜素紅染色(AlizarinRedSStain) 按郭魚波等[14]描述的實(shí)驗(yàn)方法，將股骨石蠟切片常規(guī)脫蠟；茜素紅染色2 min；用丙酮和丙酮-二甲苯混合液分別分色20 s；透明，封片，顯微鏡下觀察并拍照。用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析Alizarin Red S Stain的相對(duì)IOD值。

2.6番紅O/固綠染色(SafraninO/FastGreenStain) 將股骨石蠟切片常規(guī)脫蠟，蘇木精染色5 min，自來水沖洗3 min，1% HCl-乙醇分化2 s，去離子水洗3次，0.05% Fast Green染色5 min后，用1%醋酸洗30 s，0.1% Safrain O染色5 min后，95%乙醇洗3次，100%乙醇洗2次，透明，封片，顯微鏡下觀察，拍照。用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析Safranin O/Fast Green Stain的相對(duì)IOD值。

Fig 1 HE staining of femoral metaphysis in mice(×100)

A:Normal;B:Model;C:Pioglitazone;D:Curcumin

Fig 2 Alizarin red S staining offemoral metaphysis in mice(±s,n=7)

Alizarin red S staining(A×100) and its analysis(B). 1:Normal;2:Model;3:Pioglitazone;4:Curcumin.#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

2.7免疫組織化學(xué)染色參照Guo等[15]描述的實(shí)驗(yàn)方法，將股骨石蠟切片常規(guī)脫蠟，骨組織抗原修復(fù)液(上海舜百生物科技有限公司)進(jìn)行抗原修復(fù)后，用3% H2O2室溫孵育30 min，然后用10%山羊血清封閉30 min，滴加1 ∶200稀釋的Cathepsin K抗體，4℃孵育過夜，然后滴加辣根酶標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察，拍照。用Image Pro Plus 6.0分析軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)定陽性細(xì)胞的平均吸光度(A)。

2.8Westernblot參照Guo等[15]描述的實(shí)驗(yàn)方法，用RIPA裂解液提取在液氮里研碎的骨組織蛋白后，取80 μg蛋白溶液，加到12%的SDS-PAGE電泳膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，分別將膜與Cathepsin K(1 ∶500)和β-actin(1 ∶1 000)抗體4℃孵育過夜。次日，將膜與相應(yīng)的二抗室溫共孵育1 h，然后用ECL超敏發(fā)光液顯色，Azure c300化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，并用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行半定量灰度值分析。

Fig 3 Safrain O/Fast Green stainingof femoral epiphysis in mice(±s,n=7)

Safranin O/fast green staining(A×100) and its analysis(B). 1:Normal; 2:Model; 3:Pioglitazone; 4:Curcumin.#P<0.05vsnormal group；*P<0.05vsmodel group

Fig 4 Femur bone biomechanics in mice(±s,n=7)

Three-point bending examination results of the hardness variable(A), first cycle hardness(B) and peak pressure(C).#P<0.05vsnormal group；*P<0.05vsmodel group.

3 結(jié)果

3.1姜黃素對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠股骨病理形態(tài)學(xué)的影響實(shí)驗(yàn)小鼠的股骨組織切片HE染色結(jié)果如Fig 1所示。光鏡(×100)下觀察發(fā)現(xiàn)，正常小鼠股骨干骺端鏡下骨小梁呈網(wǎng)狀，排列整齊，骨微結(jié)構(gòu)完整。與正常組小鼠相比，模型組小鼠股骨干骺端脂滴增多，骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂、變細(xì)、斷裂。與模型組小鼠相比，陽性藥組和姜黃素組小鼠的骨小梁排列相對(duì)整齊，骨微結(jié)構(gòu)形態(tài)明顯改善，脂滴明顯減少，骨小梁增粗排列較規(guī)則，但與正常組小鼠相比，姜黃素組小鼠骨組織結(jié)構(gòu)仍然未恢復(fù)到正常狀態(tài)。

3.2姜黃素對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠股骨組織鈣化的影響在成骨細(xì)胞分化過程中，鈣離子與茜素紅反應(yīng)后，沉積形成鈣結(jié)節(jié)。鈣結(jié)節(jié)數(shù)量反映了成骨細(xì)胞的活化程度和骨形成速度。茜素紅染色(Fig 2A)和圖像分析結(jié)果(Fig 2B)顯示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠股骨成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量減少(P<0.05)；與模型組小鼠相比，陽性藥組和姜黃素組小鼠的鈣結(jié)節(jié)和數(shù)量明顯增加，分布也相對(duì)比較均勻(P<0.05)。3.3姜黃素對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠軟骨組織修復(fù)的影響骨組織軟骨中的糖胺聚糖可以被番紅O染成紅色，鈣化骨則可以被固綠染成綠色。如Fig 3A的Safrain O/Fast Green染色所示，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠可見到形態(tài)不均勻的紅色，正常組、陽性藥組、姜黃素組小鼠可見到形態(tài)相對(duì)均勻的紅色。圖像分析結(jié)果(Fig 3B)表明，同正常組小鼠相比，模型組小鼠股骨的糖胺聚糖含量明顯減少(P<0.05)。同模型組小鼠相比，給予姜黃素和吡格列酮連續(xù)治療12周后，高脂飲食小鼠股骨干骺端的糖胺聚糖含量明顯增加(P<0.05)，分布也相對(duì)比較均勻。

3.4姜黃素對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠股骨生物力學(xué)的影響各組小鼠股骨生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果見Fig 4。與正常組小鼠相比，模型組小鼠股骨的硬度形變量、第一循環(huán)硬度和峰值壓力均明顯降低(P<0.05)。與模型組小鼠相比，經(jīng)吡格列酮和姜黃素治療12周后的高脂飲食小鼠股骨硬度形變量、第一循環(huán)硬度和峰值壓力均升高(P<0.05)。

Fig 5 Effect of curcumin on expression of cathepsin K in mouse bone tissues

A, B: Immunohistochemical staining and the analyses of cathepsin K level in the femurs of mice. a1, a2: Normal; b1, b2: Model; c1, c2: Pioglitazone; d1, d2: Curcumin. C: Western blot images and the analyses of cathepsin K level in the tibias of mice.#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

3.5姜黃素對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠骨組織中組織蛋白酶K表達(dá)的影響如Fig 5所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠骨組織中的組織蛋白酶K的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組小鼠相比，經(jīng)姜黃素和吡格列酮治療12周后的高脂飲食小鼠組織蛋白酶K的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，且免疫組化法和Western blot的檢測(cè)結(jié)果一致。

4 討論

糖尿病患者糖脂代謝異常，可通過不同的途徑影響骨代謝，從而導(dǎo)致DOP的發(fā)生?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為1型糖尿病可以導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[16]，2型糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[17]，糖尿病病程、性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、糖尿病合并癥及部分治療糖尿病的藥物等因素，均可導(dǎo)致骨基質(zhì)轉(zhuǎn)換下降、鈣鹽丟失、骨脆性增加、骨微結(jié)構(gòu)退變，由此誘發(fā)骨質(zhì)量下降及骨折的發(fā)生率明顯增高，進(jìn)而誘發(fā)骨質(zhì)疏松[18]。

近年來，具有膠原酶活性的組織蛋白酶K越來越受到關(guān)注。組織蛋白酶K參與多種疾病的發(fā)病過程中，且與骨質(zhì)疏松的關(guān)系最為密切，是破骨細(xì)胞中目前發(fā)現(xiàn)的最主要、表達(dá)水平最高、溶骨活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解[19]。在骨降解中，活化的破骨細(xì)胞能分泌酸性物質(zhì)溶解骨表面的礦物質(zhì)，同時(shí)骨膠原或骨基質(zhì)也被破骨細(xì)胞分泌的組織蛋白酶K降解。研究表明，破骨細(xì)胞中組織蛋白酶K的膠原蛋白酶活性過高是導(dǎo)致骨和軟骨組織等處骨基質(zhì)和骨軟骨膠原蛋白的過度降解，進(jìn)而誘發(fā)骨質(zhì)疏松的主要原因[20]。

國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)，姜黃素能明顯地改善胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂，能在一定程度上預(yù)防和治療2型糖尿病及其慢性并發(fā)癥。Arun等[12]和Mahesh等[13]研究表明，姜黃素能明顯降低糖尿病模型大鼠的血糖水平。Suryanarayana等[21]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以延緩由鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠白內(nèi)障的進(jìn)展及成熟。體外研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過刺激破骨細(xì)胞的凋亡，抑制骨吸收[22]，還可以抑制破骨細(xì)胞的形成和分化[23]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究[15]也發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶K的過度表達(dá)與糖尿病小鼠骨質(zhì)的惡化關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明，姜黃素連續(xù)治療12周后，可以明顯改善高脂喂養(yǎng)小鼠的骨微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)骨鈣化和軟骨的發(fā)育；提高小鼠股骨的第一循環(huán)硬度、硬度形變量，峰值壓力，增強(qiáng)骨生物力學(xué)性能。免疫組化法和Western blot研究結(jié)果表明，姜黃素能夠明顯抑制股骨和脛骨組織中Cathespin K的蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而保護(hù)高脂誘發(fā)的骨質(zhì)惡化，以上結(jié)果同研究報(bào)道相一致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究證明，姜黃素能改善高脂喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠的骨微結(jié)構(gòu)、骨鈣沉積水平和骨生物力學(xué)性能，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)誘發(fā)骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵因子組織蛋白酶K，進(jìn)而發(fā)揮改善高脂飲食小鼠骨代謝作用的。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在北京中醫(yī)藥大學(xué)逸夫科研樓高思華團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)指導(dǎo)老師和實(shí)驗(yàn)參與人員表示感謝！)

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Anexperimentalstudyofeffectofcurcuminonimprovementofbonemicroarchitectureandbonequalityinhigh-fat-dietC57BL/6JmiceanditsassociationwithcathepsinK

MA Ru-feng1, WANG Li-li1, ZUO Jia-cheng1, ZHU Ru-yuan1, LIU Hai-xia1, LIU Chen-yue2, LI Lin1,CHEN Bei-bei1, ZHAO Dan-dan3, MO Fang-fang3, NIU Jian-zhao1, GAO Si-hua3, ZHANG Dong-wei3

(1.PreclinicalMedicineSchool,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.CollegeofTraditionalChineseMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;3.DiabetesResearchCenter,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

AimTo investigate the effect of curcumin against high-fat-diet induced C57BL/6J mice bone changes and the correlation between the expression of cathepsin K and curcumin.MethodsCurcumin treated C57BL/6J mice had been on high fat diet for 12 weeks. The HE, Alizarin red S staining and Safranin O/fast green staining of femur were employed to evaluate bone microstructure, bone metabolism and bone development. The expressions of cathepsin K were assessed by Western blot and immunohistochemical staining.ResultsHistopathological results showed that curcumin could improve the destruction of trabecular bone structure, cartilage development and bone calcification. Biomechanical results proved that curcumin could improve the bone strength of the type 2 diabetic mice induced by high fat. The results of immunohistochemistry and Western blot assay indicated that curcumin could significantly inhibit the expression of cathepsin K in bone tissues of mice.ConclusionCurcumin can increase bone strength, improve bone microstructure, and enhance the degree of bone calcification, which may be achieved by inhibiting the expression of cathepsin K.

curcumin; bone microarchitecture; bone mechanical strength; bone calcification: cathepsin K; C57BL/6J diabetic mice

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.023

A

：1001-1978(2017)10-1446-06

R-332；R282.71；R336；；R587.2；R681.01；R977.3

時(shí)間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.046.html

2017-05-20,

2017-08-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81273995，81274140)；國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(No 20122X09103201)；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃資助項(xiàng)目(No B07007)；北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 7172126)

馬如風(fēng)(1988-)，男，碩士生，研究方向：代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制，E-mail：marufeng5188@126.com； 張東偉(1974-)，男，博士，副研究員，研究方向：中藥活性成分的篩選和作用機(jī)制，通訊作者，Tel：010-64286915，E-mail：zhdw1006@163.com