陳 淳，林建偉，李國平，任卓超，李亞清，嚴建平，王良興

(1.浙江省人民醫(yī)院呼吸內科，杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院呼吸內科，浙江 杭州 310014；2. 浙江大學附屬邵逸夫醫(yī)院心血管內科，浙江 杭州 310014；3. 浙江省立同德醫(yī)院呼吸內科，浙江 杭州 310012；4. 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸內科，浙江 溫州 325000)

白藜蘆醇調控大鼠急性肺栓塞后肺動脈高壓及MCP-1表達的機制研究

陳 淳1，林建偉2，李國平3，任卓超1，李亞清1，嚴建平1，王良興4

(1.浙江省人民醫(yī)院呼吸內科，杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院呼吸內科，浙江 杭州 310014；2. 浙江大學附屬邵逸夫醫(yī)院心血管內科，浙江 杭州 310014；3. 浙江省立同德醫(yī)院呼吸內科，浙江 杭州 310012；4. 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸內科，浙江 溫州 325000)

目的觀察單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)與急性肺栓塞(pulmonary thromboembolism，PTE)后肺動脈高壓形成的關系；探討中藥單體白藜蘆醇調控急性PTE后肺動脈高壓及其對MCP-1表達的影響及機制。方法采用自體血栓回輸法復制Sprague-Dawley大鼠急性PTE模型；將大鼠隨機分成5組(正常組、溶劑組、急性PTE組、抗體Cl142組、白藜蘆醇組)，每組觀察1、4、8 h 3個時點；急性PTE模型復制前1 h，分別對MCP-1中和抗體C1142組及白藜蘆醇組進行藥物預處理；在1、4、8 h時間點檢測各組肺動脈平均壓力(mean pulmonary artery pressure，MPAP)和MCP-1 mRNA及蛋白表達情況。結果① 在相同時點，急性PTE組MPAP和MCP-1 mRNA、蛋白表達均較溶劑對照組明顯升高(P<0.05)；② 在相同時點，白藜蘆醇組MPAP和MCP-1 mRNA、蛋白表達較急性PTE組明顯降低(P<0.05)；③ 在相同時點，抗體C1142組MCP-1 mRNA、蛋白表達較急性PTE組明顯降低(P<0.05)。結論急性PTE后MCP-1的大量表達參與急性PTE后肺動脈高壓的形成，白藜蘆醇可通過下調MCP-1表達，降低急性PTE后肺動脈壓力。

白藜蘆醇；急性肺栓塞；肺動脈高壓；單核細胞趨化蛋白-1；炎癥因子；炎癥反應

急性肺栓塞(pulmonary thromboembolism，PTE)為臨床常見病、危重病[1]。急性PTE嚴重肺損傷和肺動脈高壓是其引起死亡的直接原因。傳統(tǒng)觀念認為，急性PTE性肺動脈高壓形成與血栓的機械阻塞作用關系密切[1]。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)，急性PTE血栓的機械阻塞程度與肺動脈壓力的增高并不一致，即使機械性阻塞已基本解除，仍存在著肺動脈壓力持續(xù)升高的現(xiàn)象[2]。又有研究證實，急性PTE時栓塞血管周圍大量炎癥細胞浸潤，其釋放的細胞因子可進一步加重肺動脈內皮的損傷，在PTE性肺動脈高壓的形成中起到不可忽視的作用[3]。單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是活化和聚集單核炎癥細胞至血管內皮細胞的重要介導者。MCP-1屬于趨化因子家族，趨化因子是具有趨化白細胞作用的一類蛋白質或多肽，可分為4類，即CXC趨化因子、CC型趨化因子、C趨化因子及CNC趨化因子。MCP-1是CC亞族其中一員，位于第17號染色體上，由多種細胞產生，包括單核細胞、內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞、脂肪細胞和系膜細胞等[4]。它能夠趨化和活化諸如肥大細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞、自然殺傷細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等炎性細胞[5]，使各種炎性細胞向病變部位聚集，通過與各細胞上的CC趨化蛋白受體2(C-C chemokine receptor type 2，CCR2)受體結合而發(fā)揮生物學作用。Eagleton等[6]發(fā)現(xiàn)，在PTE早期，肺動脈壁中MCP-1表達明顯升高同時快速趨化炎癥細胞浸潤至肺動脈壁周圍?？梢?，在啟動血管的炎癥反應及血管內皮細胞損傷中MCP-1是關鍵的炎癥趨化因子，MCP-1與栓塞性肺動脈高壓形成密切相關。

中藥單體白藜蘆醇(resveratrol, RES)是一種植物多酚，具有抗氧化、抗腫瘤及抗炎癥效應[7]。Cullen等[8]報道，白藜蘆醇可抑制血管內皮細胞MCP-1的合成和分泌。又有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可抑制MCP-1在血管炎癥動物模型中釋放[9]。因此，本研究通過復制大鼠急性PTE模型，應用MCP-1中和抗體C1142及中藥單體白藜蘆醇對急性PTE后MCP-1表達的影響，評價MCP-1是否參與急性PTE性肺動脈高壓的形成，以及白藜蘆醇是否通過下調MCP-1的表達，從而降低急性PTE后肺動脈高壓。

1 材料

1.1動物SPF級標準健康♂Sprague-Dawley(SD)大鼠150只，體質量300～350 g，溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物合格證為SCXK(浙)2005-0019。動物采用標準顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進食、飲水。

1.2試劑與儀器多克隆兔抗鼠MCP-1抗體(Abcam)；白藜蘆醇(Sigma)；SYBR Green Real-time PCR Master(Toyobo)；C1142(Centocor)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、TRIzol(Gibco)。PowerLab生理記錄儀(AD Instruments)；Bio-Rad PCR System S1000(Bio-Rad)；聚乙烯導管1106(中國浙江寧波安來生命科學軟件及器械公司)。

2 方法

2.1實驗分組150只SD大鼠按完全隨機設計分為正常對照(C組)、溶劑對照組(S組)、急性PTE組(PTE組)、急性PTE+白藜蘆醇組 (PTE+Res組)和急性PTE+C1142(C1142)組，各組又分為1、4、8 h共3個時點，每個時間點各10只大鼠。

2.2急性PTE大鼠模型建立所有大鼠頸部剃除毛發(fā)，并對皮膚進行消毒，分離左頸動脈并接入19G頭皮針留取0.5 mL血液使血栓形成。待血栓凝固后將其切成約11 mm×1 mm×3 mm大小的栓子。分離右頸靜脈并插入裝有血栓的聚乙烯導管-1106并與PowerLab連接。為最大程度地降低血栓輸注過程中大鼠的致死率，設置血栓(180 mg·kg-1)輸注時間大于5 min。并根據(jù)信號采集器顯示的右心室壓力控制在40 mmHg以保證最適宜的血栓輸入量[10]。C組和S組分別輸注等量的0.9%生理鹽水和1% DMSO代替血栓，其余操作相同。分別在各組大鼠血栓輸注后1、4、8 h，采用改良右心導管法 進行肺動脈平均壓力(mean pulmonary artery pressure，MPAP)測量。以上操作均在無菌條件下進行。

2.3C1142及白藜蘆醇藥物干預PTE+C1142組在復制急性肺栓塞模型前1 h尾靜脈注射C1142 2 mg·kg-1(溶于1% 的DMSO)；PTE+RES組復制急性PTE模型前1 h尾靜脈注射白藜蘆醇2.5 mg·kg-1(溶于1%的DMSO)；C組于大鼠尾靜脈注入等量無菌生理鹽水；S組大鼠尾靜脈注射等量1% DMSO溶液；以上操作均在無菌條件下完成。

2.4標本收集各組大鼠均行下腔靜脈取血后處死，切取部分肺組織，予4%多聚甲醛固定作免疫組化檢測MCP-1蛋白表達，部分肺組織放人無菌去酶凍存管中，經過液氮速凍后再于-70℃冰箱保存，并行real-time PCR及Western blot檢測肺組織MCP-1。

2.5免疫組化檢測MCP-1蛋白表達將肺組織經4%多聚甲醛固定后用石蠟包埋切片，將切片放入含兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體室溫下孵育2 h，再與辣根過氧化物酶標記的二抗共同孵育1 h，最后用含二氨基聯(lián)苯的底物顯色，蘇木精復染。一抗用PBS代替作為空白對照組。黃色代表陽性，并按黃色深淺代表陽性強弱。

2.6Realtime-PCR檢測MCP-1mRNA表達使用TRIzol從100 mg快速冰凍組織中萃取總RNA。RNA濃度定量在波長260 nm處的吸光度，RNA純度在波長260 nm和280 nm(A260/280)被檢測。取1 μg總RNA與2 μL 5×RT Buffer、0.5 μL RT Enzyme Mix、0.5 μL Primer Mix在Bio-Rad PCR system S1000上進行逆轉錄。將逆轉錄終產物溶于10 μL去RNA酶水中備用。MCP-1上游引物序列5′-GTCTCTGTCACGCTTCTG-3′，下游引物5′-TGCTGGTGATTCTCTTGTAG-3′。內參GAPDH上游引物序列5′-AGAACATCATCCCTGCATCC-3′，下游引物序列5′- TGGATACATTGGGGGTAGGA-3′。PCR參數(shù)設置如下：95℃ 2 min, 95℃ 15 s，62℃ 1 min 40個循環(huán)。所有PCR結果由ABI7500 System SDS軟件分析，實驗數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCT方法分析。

2.7Westernblot檢測MCP-1蛋白表達所有肺組織蛋白濃度均使用BCA法檢測，采用15%的分離膠和5%的濃縮膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分別用兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體(1 ∶500)4℃封閉過夜后，再與辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(1 ∶5 000)孵育2 h；化學發(fā)光、顯影、定影；將膠片進行掃描，用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析各組蛋白表達。

3 結果

3.1動物一般情況大鼠自體PTE模型制備完成共90只，其中自體栓塞成功且經右心導管法成功測得肺動脈壓力(Fig 1)者為82只大鼠，成功率為91.1%(82/90),中途死亡數(shù)8只，死亡率為8.9%(8/90)。大鼠表現(xiàn)有呼吸加快加深、口唇發(fā)紺、兩肺出現(xiàn)彌漫性干濕啰音等PTE體征。大體組織見肺膨脹不全，多散在出血灶，肺組織光鏡見肺動脈內有注入的血栓，同時見肺血管壁肌層組織水腫，提示急性PTE模型復制成功。

Fig 1 The waveform chart of pulmonary artery pressure in rats

3.2白藜蘆醇及C1142對急性PTE大鼠MPAP的影響Fig 2結果顯示，S組MPAP較C組有降低趨勢，但兩組間數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義；急性PTE組MPAP明顯高于S組，RES組MPAP明顯低于急性PTE組，C1142組MPAP明顯低于急性PTE組，它們之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig 2 Mean pulmonary artery pressure in fivegroups at 1, 4, and 8 h time points(±s,n=10)

At 4 and 8 h, MPAP levels were similarly elevated.*P<0.05vssolvent;#P<0.05vsPTE

3.3各組大鼠MCP-1蛋白在肺組織內的表達變化各相同時間點，各組大鼠肺組織免疫組織化學法MCP-1蛋白表達結果如Fig 3所示，C、S組大鼠肺組織內未見明顯MCP-1蛋白表達；急性PTE組MCP-1蛋白表達較S組表達明顯增高，兩組間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；RES組及C1142組MCP-1蛋白表達較急性PTE組降低，兩組間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.4各組MCP-1mRNA在肺組織中表達情況各相同時間點，各組大鼠肺組織MCP-1 mRNA表達結果如Fig 4所示，S組MCP-1 mRNA 2-ΔΔCT值設為1；急性PTE組MCP-1 mRNA表達的CT值較S組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；RES組及C1142組MCP-1 mRNA CT值均較急性PTE組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig 3 Localization of MCP-1 protein in lung tissuesby immunohistochemistry(×100)

3.5各組MCP-1蛋白表達差異各相同時間點，各組大鼠肺組織Western blot法檢測MCP-1蛋白表達結果見Fig 5、6。S組MCP-1蛋白表達與C組比較差異無統(tǒng)計學意義；急性PTE組MCP-1蛋白表達較S組明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；RES組及C1142組MCP-1蛋白表達均較急性PTE組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig 4 Effects of resveratrol or C1142 on expressionof MCP-1 mRNA in rats by Real-time PCR(±s,n=10)

MCP-1 mRNA levels were expressed as CT-value and normalized to the expression of GAPDH mRNA. The value of MCP-1 mRNA in the solvent group was 1.*P<0.05vssolvent;#P<0.05vsPTE

Fig 5 Effect of resveratrol on protein expressionof MCP-1 in rats by Western blot(±s,n=10)

Rats were treated with resveratrol, and levels of MCP-1 protein expression were measured by Western blot at 1, 4, and 8 h time points. β-actin was used to normalize protein loading.*P<0.05vssolvent;#P<0.05vsPTE

4 討論

近年來研究證實，在啟動血管的炎癥反應中MCP-1可能是關鍵的炎癥趨化因子，是活化和聚集炎癥細胞至血管內皮的重要介導者[11]。又有報道指出，在大鼠PTE模型中觀察到MCP-1在肺組織、肺動脈內皮細胞中均有大量表達，表明MCP-1可能與PTE后炎癥細胞浸潤及肺動脈高壓形成過程中密切相關[12]。

Fig 6 Effect of C1142 on protein expressionof MCP-1 in rats by Western blot(±s,n=10)

Rats were treated with C1142, and levels of MCP-1 protein expression were measured by Western blot at 1, 4, and 8 h time points. β-actin was used to normalize protein loading.*P<0.05vssolvent;#P<0.05vsPTE

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，急性PTE 1、4 h組血栓幾乎阻塞了整個肺動脈管腔，由于血栓機械阻塞作用MPAP明顯增高；急性PTE 8 h組血栓對血管的機械阻塞作用較4 h組減少，但MPAP值卻未降低，差異無統(tǒng)計學意義。急性PTE后，由于體內纖溶系統(tǒng)迅速激活[13]，血栓開始溶解，為何肺動脈壓力仍持續(xù)增高？目前認為可能與PTE后，栓塞血管周圍大量炎性細胞浸潤，其釋放的細胞因子加重肺動脈內皮的損傷有關[13]，而MCP-1是活化和聚集單核炎癥細胞至血管內皮細胞的重要介導者。Eagleton等[6]發(fā)現(xiàn)，在PTE后肺動脈壁中MCP-1表達量明顯升高。本實驗也觀察到急性PTE組8 h組的MCP-1蛋白及mRNA表達明顯增高。因此，本研究推測急性PTE后MCP-1的表達與急性PTE后肺動脈高壓形成相關。為進一步探討MCP-1表達與MPAP關系，本實驗在1、4、8 h分別加用MCP-1特異性中和抗體C1142進行干預。實驗結果顯示，各相同時間點，C1142組MPAP值均較急性PTE組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義。表明除血栓對肺動脈的機械阻塞作用外，急性PTE后MCP-1的表達增高參與肺動脈高壓的形成。因此，抑制MCP-1表達是降低急性PTE后肺動脈壓力的一種有效手段。

中藥單體白藜蘆醇屬芪類化合物, 目前已經在21個科、31個屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇，其中，葡萄、虎杖和花生中白藜蘆醇含量較高。化學名為3,4′,5-三羥基-1,2-二苯乙烯(3,4′,5- trihydrolystilbene)，分子式C14H12O3，相對分子質量為228.25，有順、反兩種結構。單體白藜蘆醇為無色針狀晶體溶于丙酮、乙醇、甲醇等有機溶劑，難溶于水。溶點為256℃～258℃。自從1997年Jang等[7]在《Science》發(fā)表中藥單體白藜蘆醇具有抗腫瘤作用后，該藥備受關注。其藥理作用包括抗癌、心血管保護作用、抗氧化及抗自由基作用[15-16]。其抗炎效應也已被證實。Park等[17]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在動脈粥樣硬化形成中可明顯下調MCP-1的表達，預防血管壁泡沫細胞生成。Zhu等[18]亦證實了白藜蘆醇可減少在TNF-α誘導下MCP-1的大量表達。本實驗利用在體大鼠急性PTE模型，探究白藜蘆醇對急性PTE后MCP-1表達及肺動脈高壓的效應。實驗結果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過下調急性PTE后MCP-1 mRNA和蛋白水平，從而明顯降低急性PET后肺動脈高壓，減少栓塞后肺損傷。然而，目前關于白藜蘆醇如何下調急性PTE后MCP-1表達，降低肺動脈壓力的機制仍尚不明確。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)是生物細胞內一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。多項研究表明，MAPKs信號轉導通路將細胞外刺激信號轉導至細胞質及其核內，在引起生物學反應(如細胞分化、增殖、轉化、凋亡等)過程中具有十分重要的作用。p38 MAPK通路是1993年發(fā)現(xiàn)的信號轉導通路，屬于MAPKs成員之一，一旦它被激活，細胞質中的非磷酸化p38 MAPK轉化為磷酸化p38 MAPK，而后移位到細胞核內。既往研究證實p38 MAPK是MCP-1產生的關鍵上游分子，抑制p38 MAPK通道可以減少MCP-1的大量表達[19,20]。Gresele等[21]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在急性缺血性心臟疾病中可通過p38 MAPK信號轉導通路減少大量炎癥趨化因子產生。Chakraborty等[22]亦報道白藜蘆醇可通過抑制p38 MAPK信號轉導通路激活減少炎癥反應發(fā)生。SB203580是p38 MAPK的特異性的吡啶異咪噠唑類抑制劑的突出代表。本實驗后續(xù)實驗將加用p38 MAPK通路特效抑制劑SB203580預孵育，繼續(xù)探究在急性PTE后白藜蘆醇是否可通過抑制p38MAPK信號轉導通路減少MCP-1的大量表達，抑制急性PTE后肺動脈高壓的分子機制。 綜上所述，本研究顯示除血栓的機械性阻塞作用外，MCP-1的大量表達也參與急性PTE后肺動脈高壓的形成；白藜蘆醇通過下調急性PTE后MCP-1表達，從而降低肺動脈高壓。白藜蘆醇可能成為一種新型的預防急性PTE后肺動脈高壓形成的藥物。

(致謝：本實驗主要在溫州醫(yī)科大學科研平臺中心完成，在此對實驗室各位老師及同學的幫助表示衷心的感謝！)

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Resveratroldown-regulatesacutepulmonarythromboembolism-inducedpulmonaryarteryhypertensionandmonocytechemoattractantprotein-1inrats

CHEN Chun1, LIN Jian-wei2, LI Guo-ping3,REN Zhuo-chao1,LI Ya-qing1, YAN Jian-ping1, WANG Liang-xing4

(1.DeptofRespiratoryMedicine,ZhejiangProvincialPeople′sHospital,People′sHospitalofHangzhouMedicalCollege,Hangzhou310014,China;2.DeptofCardiology,SirRunRunShawHospital,ClinicalMedicineofZhejiangUniversity,Hangzhou310016,China;3.DeptofRespiratoryMedicine,TongdeHospitalofZheJiangProvince,Hangzhou310012,China;4.DeptofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalCollege,WenzhouZhejiang325000,China)

AimTo investigate the relationship between monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1) and pulmonary artery hypertension after acute pulmonary thromboembolism(PTE), and to explore the effects and mechanisms of resveratrol with MCP-1 in the acute PTE as well.MethodsThe acute PTE model of Sprague-Dawley rats was replicated using self-thrombosis. The rats were randomly divided into five groups(Normal, Solvent, acute PTE, antibody Cl142, and resveratrol ), and 1h, 4h, 8h and 3 points were observed in each group. A model of acute PTE was established by infusion of an autologous blood clot into the pulmonary artery through a polyethylene catheter.Resveratrol or Cl142, dissolved in 1% dimethyl sulfoxide(DMSO), was administered to the animals through caudalvein 1 h prior to the beginning of acute PTE modeling. Rats in normal control group and solvent control group were injected with normal saline and 1% DMSO respectively. The mean pulmonary artery pressure(MPAP) and the mRNA and protein expression of MCP-1 were measured at each time point.Results① The acute PTE group MPAP, MCP-1 mRNA and protein expression were significantly higher than those of the control group(P<0.05) at the same time;② The resveratrol group′s MPAP and MCP-1 mRNA, protein expression were significantly lower than those of the acute PTE group(P<0.05) at the same time;③ The Cl142 group MPAP and MCP-1 mRNA, protein expression were markedly reduced in the acute PTE group(P<0.05) at the same time.ConclusionsThe large expression of MCP-1 after acute PTE is involved in the formation of pulmonary hypertension after acute PTE. Resveratrol can reduce the pressure of pulmonary artery after acute PTE by down-regulating the MCP-1 expression.

resveratrol; acute pulmonary thromboembolism; pulmonary artery hypertension; monocyte chemoattraetantprotein-1; inflammatory factor; inflammatory response

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.021

A

：1001-1978(2017)10-1436-06

R-332；R284.1；R364.5；R544；R563.502.2；R977.6

時間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.042.html

2017-05-21,

2017-08-24

國家自然科學基金資助項目(No 30871138)

陳 淳(1982-)，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：肺栓塞后肺動脈高壓機制，E-mail：candy.355@163.com； 林建偉(1983-)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：心血管電生理學，共同第一作者，E-mail:weiyi920@163.com； 嚴建平(1958-)，男，主任醫(yī)師，研究方向：呼吸危重癥疾病，通訊作者，E-mail:yjp.1234@163.com； 王良興(1963-)，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：肺動脈高壓的機制及防治，通訊作者，E-mail:185078785@qq.com