張文龍+許晨+陳俊

[摘要] 目的 觀察一氧化氮對(duì)豚鼠形覺剝奪性（FDM）近視的影響，探討一氧化氮對(duì)近視視網(wǎng)膜的調(diào)控作用。 方法 以豚鼠作為實(shí)驗(yàn)材料，建立FDM模型，分為A組（無FDM處理）、B組（FDM誘導(dǎo)10 d）、C組（FDM誘導(dǎo)20 d）、D組（FDM誘導(dǎo)10 d+NOS抑制劑注射）、E組（FDM誘導(dǎo)20 d+NOS抑制劑注射）、F組（FDM誘導(dǎo)10 d+褪黑素注射）和G組（FDM誘導(dǎo)20 d+褪黑素注射），每組各15只。檢測(cè)各組的屈光度、眼軸長(zhǎng)度和視網(wǎng)膜組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）表達(dá)水平。 結(jié)果 與A組相比，隨著FDM誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，近視程度明顯加深，眼軸明顯延長(zhǎng)，同時(shí)iNOS水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與FDM誘導(dǎo)相比，使用NOS抑制劑處理可以降低近視程度，抑制眼軸增長(zhǎng)，降低iNOS的水平（P < 0.05）。 結(jié)論 FDM豚鼠視網(wǎng)膜iNOS表達(dá)水平上升，而NOS抑制劑處理能夠有效抑制近視的發(fā)生。因此抑制一氧化氮的合成降低了豚鼠形覺剝奪性近視發(fā)生。

[關(guān)鍵詞] 形覺剝奪性近視；誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶；NOS抑制劑；豚鼠

[中圖分類號(hào)] R77 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）08（b）-0022-04

[Abstract] Objective To observe the effect of nitric oxide on formation of deprivation myopia （FDM） in guinea pig， in order to investigate the regulation of nitric oxide on retinopathy of myopia. Methods Guinea pigs were used to establish the FDM model. They were divided into group A （FDM-untreated）， group B （FDM induced 10-day）， group C （FDM induced 20-day）， group D （FDM induced 10-day plus NOS inhibitor injected）， group E （FDM induced 20-day plus NOS inhibitor injected）， group F （FDM induced 10-day plus melatonin injected）， group G （FDM induced 20-day plus melatonin injected）， with 15 guinea pigs in each group. The myopic refraction， axial length in each group and expression level of iNOS in the retina of guinea pigs were observed. Results Compared to group A， myopia increased and the axial length prolonged significantly， and the level of iNOS increased obviously in FDM-induced group， with statistically significant difference （P < 0.05）. Compared to FDM-induced group， the level of iNOS significantly reduced （P < 0.05）， and the degree of myopia and the axial length were severely inhibited in guinea pigs treated with FDM plus NOS inhibitor injected. Conclusion The expression of iNOS in retina in FDM guinea pigs increases， while NOS inhibitor can effectively inhibite the occurrence of myopia. The synthesis of nitric oxide promotes FDM in guinea pig.

[Key words] Form-deprivation myopia； iNOS； NOS inhibitor； Guinea pigs

近視是最常見的視力障礙，是世界上視力障礙的主要原因[1]。其發(fā)病機(jī)制一直是眼科研究的重要課題，但是其發(fā)病的確切機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。

通過形式剝奪或眼鏡鏡片操縱，能夠改變眼睛生長(zhǎng)和屈光不正[2]。近視剝離（formation of deprivation，F(xiàn)D）首先在猴子模型中實(shí)現(xiàn)，通過縫合眼瞼形成[3]。在許多動(dòng)物研究中，F(xiàn)D也可以通過在眼睛上佩戴的半透明漫射鏡或擴(kuò)散鏡片。通常，眼睛戴上擴(kuò)散鏡片可以軸向過度伸長(zhǎng)，誘導(dǎo)近視的形成（通過穿戴擴(kuò)散鏡片引起的近視與人眼疾病如角膜炎或角膜混濁引起的近視相似，因此將此用作近視模型，以了解那些因素導(dǎo)致軸向近視。

其中，形覺剝奪性（form-deprivation myopia，F(xiàn)DM）是目前常用的一種建立動(dòng)物近視模型的手段，通過用縫合眼瞼或戴彌散鏡片或半透明眼罩來嚴(yán)重破壞動(dòng)物的形體視覺所引起的近視[4]。目前的研究表明，F(xiàn)DM能夠影響視網(wǎng)膜上多種神經(jīng)遞質(zhì)與生長(zhǎng)因子水平[5]。一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種小分子內(nèi)源性反應(yīng)氣體，近期的研究發(fā)現(xiàn)NO可以作為視網(wǎng)膜的神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)，不僅參與視覺生理，還參與了FDM的形成過程[6]，強(qiáng)烈或間歇（閃爍）照明增加了其合成和釋放[7]。當(dāng)應(yīng)用于視網(wǎng)膜時(shí)，NO供體模擬能夠增加照明的適應(yīng)效應(yīng)[8]，而一氧化氮合成酶（nitric oxide synthetase， NOS）催化L-精氨酸合成NO，其抑制劑模擬照明減少的功能效應(yīng)[9]。因此本文檢測(cè)了NOS在FDM中發(fā)揮的重要作用，以進(jìn)一步證明NO在FDM豚鼠模型中的調(diào)控作用。endprint

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇出生15 d 清潔級(jí)豚鼠，雄性（180 g左右）由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（滬）0014。將豚鼠置于干凈的環(huán)境中，自由獲取食物和水，適應(yīng)1周后用于本研究。所有程序均按照浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的指導(dǎo)方針進(jìn)行。

1.2 建立FDM模型以及玻璃體注射

將豚鼠隨機(jī)分為7組，每組各15只。A組：無FDM處理；B組：FDM誘導(dǎo)10 d；C組：FDM誘導(dǎo)20 d；D組：FDM誘導(dǎo)10 d+NOS抑制劑注射；E組：FDM誘導(dǎo)20 d+NOS抑制劑注射；F組：FDM誘導(dǎo)10 d+褪黑素注射；G組：FDM誘導(dǎo)20 d+褪黑素注射。依據(jù)參考文獻(xiàn)[10]建立豚鼠FDM模型。豚鼠的頭部被乳膠球覆蓋，留下左眼、鼻子、嘴巴和耳朵暴露在空氣中。每天用微量注射器向其玻璃體內(nèi)注射預(yù)定藥物，注射體積均為10 μL。NOS抑制劑NG-（1-Iminoethyl）-L-ornithine（L-NIO）和L-NG-monomethyl arginine（L-NMMA）使用濃度為0.3 m mol/L，褪黑素使用劑量為2 mg/kg。

1.3 眼屈光和軸向長(zhǎng)度測(cè)量

分別在實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)后1周和2周進(jìn)行眼屈光測(cè)量。在測(cè)量前1 h時(shí)，將0.25%托品酰胺滴入眼睛以麻痹睫狀肌。視網(wǎng)膜檢查由驗(yàn)光師在黑暗的房間中以雙盲方式進(jìn)行。用1%氟烷氧輕度麻醉動(dòng)物，通過A掃描超聲（AVISO Echograph class I-Type Bat；Quantel Medical，F(xiàn)rance）測(cè)量軸向長(zhǎng)度。

1.4 蛋白質(zhì)印跡（Western bolt）分析

用pH 7.0含有10 mmol/L磷酸鈉，0.15 mol/L NaCl，1%NP-40，1 mmol/L Na3VO4，50 mmol/L NaF和蛋白酶抑制劑的冷裂解緩沖液裂解視網(wǎng)膜組織中。12 000×g離心15 min。收集上清液，使用MicroBCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。12.5%變性SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。將iNOS抗體與PVDF膜進(jìn)行溫育，隨后用HRP標(biāo)記的IgG孵育，進(jìn)行顯色。使用圖像軟件ImageJ對(duì)Western blot進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組屈光度的比較

A、B、C、D、E、F、G組屈光度依次為（1.72±0.20）、（-2.68±0.42）、（-5.68±0.51）、（-1.38±0.44）、（-3.44±0.64）、（-1.32±0.32）、（-3.09±0.64）D，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與A組比較，B組、C組屈光度明顯下降，且C組屈光度低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與B組比較，D組、F組屈光度有所提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與C組比較，E組、G組屈光度有所提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 各組眼軸比較

A、B、C、D、E、F、G組眼軸依次為6.97±0.13、7.50±0.19、8.21±0.31、7.17±0.20、7.68±0.22、7.12±0.31和7.59±0.24，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與A組比較，B組、C組眼軸增長(zhǎng)，且C組眼軸長(zhǎng)于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與B組比較，D組、F組眼軸有所縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與C組比較，E組、G組眼軸有所縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.3 屈光度與FDM眼軸的相關(guān)性分析

FDM眼軸和屈光度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.968，P < 0.01）。見圖1。

2.4 檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中iNOS的表達(dá)量

隨著FDM時(shí)間的延長(zhǎng)，視網(wǎng)膜組織中iNOS水平上升，B組iNOS是A組的（1.58±0.02）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；C組達(dá)到（2.40±0.07）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。抑制劑處理可以有效抑制iNOS的上升，D組iNOS是A組的（1.25±0.04）倍，F(xiàn)組是A組的（1.16±0.07）倍；E組iNOS是A組的（1.39±0.08）倍，F(xiàn)組是A組的（1.69±0.05）倍。見圖2。

3 討論

本研究檢測(cè)了一氧化氮合成酶是否參與調(diào)控豚鼠FDM模型，通過使用之前已經(jīng)報(bào)道的兩種NOS抑制劑的混合物，可以很好地阻斷豚鼠NOS的合成，抑制FDM的發(fā)生。該研究中所使用的NOS抑制劑在之前很少被報(bào)道，因此，為之后NOS抑制劑的選擇提供了有意義的參考。

首先，NO在眼中作為神經(jīng)調(diào)節(jié)器和血管擴(kuò)張劑發(fā)揮著重要作用，但它也調(diào)控著眼睛生長(zhǎng)和平滑肌松弛，對(duì)于近視來說尤其關(guān)鍵[11]。NO在神經(jīng)、心血管系統(tǒng)以及炎性反應(yīng)中同樣作為重要的信號(hào)分子。由于其不成對(duì)的電子，NO是一個(gè)自由的不帶電的自由基。NO生產(chǎn)不足和過量生產(chǎn)都可導(dǎo)致各種眼睛疾病。所以用NO供體和抑制劑治療或預(yù)防這些眼睛疾病，例如近視等，是近年來研究的熱點(diǎn)[11]。首先，通過使用NO抑制劑或者確定幾種NOS同工型的活性來嘗試探究NO在近視的發(fā)生和發(fā)展中的作用。在兩個(gè)最廣泛使用的動(dòng)物近視模型中：FDM和晶狀體誘導(dǎo)近視（lens-induced myopia，LIM）玻璃體內(nèi)注射N-ω-硝基-L-精氨酸甲基酯（L-NAME；NOS抑制劑）抑制近視發(fā)展。這表明NO調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜途徑，導(dǎo)致LIM和FDM。類似的研究表明，使用L-NAME不僅對(duì)于脈絡(luò)膜，而且對(duì)鞏膜蛋白多糖的合成也具有調(diào)節(jié)作用[12]。豚鼠模型NO激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，從而增加cGMP水平。FDM組，視網(wǎng)膜NOS活性在FD后7 d低于對(duì)照組，然而在FDM 14和21 d后高于對(duì)照組。cGMP的濃度表現(xiàn)出與NOS活性相似的變化，這暗示著NOS活性非?？赡芡ㄟ^cGMP介導(dǎo)[13]。endprint

NO是通過NOS合成的，目前已知有3種NOS，包括神經(jīng)元型NOS（nNOS/NOS1），內(nèi)皮型NOS（eNOS/NOS3） 以及誘導(dǎo)型（iNOS/NOS2）。其中nNOS和eNOS組成型表達(dá)，需要鈣的激活，而iNOS受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其活性不依賴鈣[14]。iNOS僅在內(nèi)毒素，炎癥和某些細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1（IL-1），IL-6，腫瘤壞死因子（TNF）等的病理狀態(tài)下才能誘導(dǎo)。一旦誘導(dǎo)，iNOS會(huì)長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生大量的NO，使NO轉(zhuǎn)化為NO2，亞硝酸鹽，過氧亞硝酸鹽和自由基，以誘導(dǎo)病理生理作用，如視神經(jīng)變性，導(dǎo)致青光眼、視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）、近視、白內(nèi)障和葡萄膜炎。 為了治療和預(yù)防這些眼睛疾病，可以嘗試使用iNOS活性或 iNOS誘導(dǎo)的抑制劑[15]。褪黑素是由松果體和視網(wǎng)膜產(chǎn)生的， 當(dāng)褪黑素與其受體作用之后能夠調(diào)節(jié)房水的產(chǎn)生，調(diào)控眼壓。眼壓是近視程度重要的調(diào)節(jié)因素，當(dāng)然近視還受到神經(jīng)遞質(zhì)、環(huán)境以及基因等因素的共同作用。因此，褪黑素是目前已知的重要的調(diào)節(jié)近視的因子[16]。目前的研究表明，褪黑素能有效抑制NOS的活性，減輕NO引起的視網(wǎng)膜氧化損傷，從而抑制體內(nèi)NO的過度產(chǎn)生及其活性氮分子的水平[17]。FDM最突出的變化是眼軸的延長(zhǎng)和眼球增大。L-NMMA作為非特異性NOS抑制劑，是L-精氨酸類似物，L-NIO對(duì)eNOS的特異性比iNOS特異性高4倍[18]。L-NIO和L-NMMA對(duì)iNOS的抑制效果已經(jīng)在其他研究中報(bào)道，包括人類骨關(guān)節(jié)炎[19]、血小板聚集[20]等方面。本文中聯(lián)合使用L-NIO和L-NMMA作為NOS抑制劑，能夠有效抑制iNOS的蛋白水平，同時(shí)抑制FDM的程度和眼軸的長(zhǎng)度。

綜上所述，檢測(cè)屈光度和眼軸長(zhǎng)度等指標(biāo)表明，加入NOS抑制劑能夠顯著抑制豚鼠FDM近視程度，闡明了NO合成酶調(diào)控了豚鼠FDM的發(fā)生與發(fā)展。

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