黃威,竇華亭,吳厚玖,王華,孫志高,馬亞琴,黃林華,郭莉,王珺,黃學(xué)根
1(西南大學(xué) 柑桔研究所食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400712)2(重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,重慶,402160)
川陳皮素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
黃威1,2,竇華亭1*,吳厚玖1,王華1,孫志高1,馬亞琴1,黃林華1,郭莉1,王珺1,黃學(xué)根1
1(西南大學(xué) 柑桔研究所食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400712)2(重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,重慶,402160)
納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carrier,NLC)是一種新型的納米脂質(zhì)載體,將其搭載活性物質(zhì)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品的多個(gè)相關(guān)領(lǐng)域。川陳皮素(nobiletin,NOB)是柑橘加工皮渣中提取的一種多甲氧基黃酮類(lèi)化合物,具有多種生理活性,將其制備成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體可提高其溶解度、改善其分散性及生物利用率等。采用高壓均質(zhì)法制備了川陳皮素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NOB-NLC),運(yùn)用單因素試驗(yàn)考察了脂質(zhì)用量、乳化劑用量和乳化劑比例對(duì)NOB-NLC質(zhì)量的影響。采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化了制備條件,確定的最適宜制備方案為脂質(zhì)用量752.20 mg,乳化劑用量1 072.41 mg和乳化劑比例1.23(卵磷脂與泊洛沙姆188的質(zhì)量比值),依據(jù)最適宜處方制備的NOB-NLC平均粒徑為(132.63±7.28)nm,多分散指數(shù)為(0.253±0.015),Zeta電位為(-38.1±2.17)mV,包封率為(80.25±3.66)%。掃描電子顯微鏡顯示所制備N(xiāo)OB-NLC呈球形或類(lèi)球形,且大小具有良好的均一度。針對(duì)食品體系的應(yīng)用,探究了貯藏條件對(duì)NOB-NLC穩(wěn)定性的影響,結(jié)果表明在溫度為25℃且pH為3.50~7.50的條件下貯藏40 d時(shí),其粒徑變化小,分散體系穩(wěn)定性好,可應(yīng)用于pH值為3.50~7.50的食品體系當(dāng)中。
納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體;川陳皮素;Box-Behnken試驗(yàn);表征;穩(wěn)定性
我國(guó)作為柑橘種植面積及產(chǎn)量第一的國(guó)家,其柑橘消費(fèi)量也是巨大的,柑橘在鮮食和加工過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生大量的皮渣,皮渣的研究與利用成為柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的一個(gè)問(wèn)題。研究指出,柑橘皮渣中含有多種功能性成分,其中多甲氧基黃酮類(lèi)物質(zhì)作為柑橘的特征黃酮,因其多種生物學(xué)功效及生理活性已經(jīng)越來(lái)越受到了研究者的重視[1-2]。川陳皮素(nobiletin,NOB),又稱(chēng)蜜橘黃酮,是柑橘多甲氧基黃酮類(lèi)化合物中含量較高的單體物質(zhì)。川陳皮素具有廣泛的生物活性,包括抗氧化性、較強(qiáng)的自由基清除能力、調(diào)節(jié)糖和脂肪代謝能力等[3]。但川陳皮素結(jié)構(gòu)中的羥基都被甲氧基化,導(dǎo)致其在水中的溶解度極小,在體系中分散性差、生物利用率低,這極大的限制了其在實(shí)踐中的應(yīng)用[4],如果能改善其溶解性及生物利用率,將為其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用帶來(lái)巨大的便利。而國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該方面的研究較少,有報(bào)道將川陳皮素制成納米乳、川陳皮素自組裝前體脂質(zhì)體、用殼聚糖搭載川陳皮素以及川陳皮素固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles,SLN)等[5-7]。然而,納米乳存在絮凝、物質(zhì)釋放、膜滲透性不理想以及貯藏穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn)[8];脂質(zhì)體制備成本高、荷載低,且其物質(zhì)釋放也較快[9];雖然SLN在包封率、物質(zhì)釋放等方面有了明顯提高,但其貯藏期間的多晶型轉(zhuǎn)換會(huì)導(dǎo)致包封物質(zhì)泄露以及搭載能力不高也限制了其應(yīng)用[10]。
納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carrier,NLC)是一種新型的納米脂質(zhì)載體系統(tǒng),相對(duì)于SLN,它又被稱(chēng)作第二代納米脂質(zhì)載體系統(tǒng)。它采用2種或2種以上的固體和液體脂質(zhì)原料經(jīng)過(guò)先加熱融化后冷卻而制得。NLC具有良好的生物相容性,搭載空間大、長(zhǎng)期穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn),且可避免SLN存在的搭載物質(zhì)泄漏的問(wèn)題。目前,將NLC用于搭載活性物質(zhì),已經(jīng)在食品檢測(cè)、食品包裝、功能食品等領(lǐng)域有了比較廣泛的應(yīng)用[11-13],但國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道其用于搭載NOB的研究。
本文采用高壓均質(zhì)法制備N(xiāo)OB-NLC,并對(duì)NOB-NLC的表觀形態(tài)、平均粒徑、多分散指數(shù)、包封率、Zeta電位及其穩(wěn)定性進(jìn)行研究,希望為進(jìn)一步擴(kuò)大NOB在食品方面的應(yīng)用,同時(shí)提高柑橘加工產(chǎn)品附加值。
1.1材料與試劑
川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品,含量≥95%,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;川陳皮素,含量≥94%,西安利時(shí)生物科技有限公司;中鏈甘油三酯、單硬脂酸甘油酯,含量≥95%,嘉法獅(上海)貿(mào)易有限公司;泊洛沙姆188,含量≥95%,巴斯夫(中國(guó))有限公司;大豆卵磷脂,PC≥95%,上海太偉藥業(yè)有限公司;乙腈、甲醇為色譜純;其他試劑為分析純。
1.2儀器與設(shè)備
UniCen MR型低溫高速離心機(jī),德國(guó)Herolab公司;AH100D型高壓均質(zhì)機(jī),加拿大ATS公司(最大壓力:180 MPa,額定流量:15 dm3/h);Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀,美國(guó)Dionex公司;ZEN-3600型激光粒度分析儀,英國(guó)Malvern Instruments公司;JEM-2100型透射電鏡,日本電子株式會(huì)社;Direct-QTM超純水系統(tǒng),Amicon Ultra-4超濾離心管(500 μL,100 kDa),密理博(上海)貿(mào)易有限公司;SRH-S300型高剪切均質(zhì)機(jī),上海世赫機(jī)電設(shè)備有限公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 川陳皮素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
本試驗(yàn)采用高壓均質(zhì)法制備N(xiāo)OB-NLC[14]。稱(chēng)取一定量的單硬脂酸甘油酯、中鏈甘油三酯及大豆卵磷脂,(75±3)℃水浴加熱作為油相;待油相融化混勻后,加入川陳皮素(占總脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%),攪拌使其溶解均勻作為混合油相。將泊洛沙姆188溶解在超純水中(100 mL),加熱到相同溫度后,將混合油相注入水相中,高剪切作用下(10 000 r/min),攪拌均勻即得初乳。冷卻至室溫,用高壓均質(zhì)機(jī)(70 MPa)將其均化,均質(zhì)時(shí)間4 min 17 s(10次循環(huán)),迅速冷卻至室溫,得到NOB-NLC。
1.3.2 包封率的測(cè)定
1.3.2.1 液相色譜條件
色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);流動(dòng)相:V(純水)∶V(乙腈)= 55∶45;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):333 nm;流速:1 mL/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:20 μL。
1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
準(zhǔn)確稱(chēng)取NOB標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,定容于10 mL容量瓶,配置成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的NOB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取NOB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10、50、100、200、400、600、800 μL,用甲醇定容至1 mL,得到濃度為5、25、50、100、200、300、400 μg/mL的NOB標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.3.2.1條件進(jìn)行測(cè)定,以NOB峰面積(A)為橫坐標(biāo),以NOB標(biāo)準(zhǔn)容液質(zhì)量濃度(C)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為公式(1),方程相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 4,表明NOB在5~400 μg/mL濃度之間存在良好的線性關(guān)系[15]。
C=1.224 4A-0.562 3
(1)
1.3.2.3 包封率的測(cè)定
精密量取一定質(zhì)量的NOB-NLC置于超濾離心管上室,于4℃下,3 000 g離心20 min。將離心后的濾出液用甲醇溶解并定容至1 mL,按照1.3.2.1條件進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)公式(1)計(jì)算出游離的NOB的質(zhì)量(mfree)。另取NOB-NLC 1mL,甲醇破乳,定容至10 mL,測(cè)定得到NOB-NLC中NOB的總質(zhì)量(mtotal)[16]。包封率(encapsulation efficiency,EE)的計(jì)算公式如下:
(2)
1.3.3 平均粒徑(particle size)及多分散指數(shù)(poly ̄disper ̄sity index,PDI)、Zeta電位的測(cè)定
用激光粒度分析儀測(cè)定其平均粒徑、多分散指數(shù)、及Zeta電位值,測(cè)定溫度為25 ℃;其中平均粒徑、多分散指數(shù)測(cè)試角度為173°[17]。
1.3.4 NOB-NLC的形態(tài)特征分析
取NOB-NLC適量,加水稀釋?zhuān)缓蟮渭由倭坑谔寄ゃ~網(wǎng)上(230孔),室溫下干燥24 h,再滴加質(zhì)量濃度為20 mg/L的磷鎢酸水溶液染色,自然干燥后,在透射電子顯微鏡下(transition electron microscopy,TEM)觀察NOB-NLC的大小和形態(tài)特征,觀測(cè)電壓200 kV[18]。
1.3.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)
NOB-NLC的制備受高壓均質(zhì)時(shí)間、高壓均質(zhì)功率、融化溫度及油相與水相的比、乳化劑與脂質(zhì)質(zhì)量比、脂質(zhì)用量等多種因素影響。本試驗(yàn)固定NOB與脂質(zhì)總質(zhì)量比1∶20及其他因素(詳見(jiàn)1.3.1),通過(guò)改變脂質(zhì)用量(固體脂質(zhì)和液體脂質(zhì)的質(zhì)量和:120、420、720、1 020、1 320、1 620 mg)、乳化劑用量(卵磷脂與泊洛沙姆188的質(zhì)量和:360、540、720、960、1 200、1 440 mg)和乳化劑比例(卵磷脂與泊洛沙姆188的質(zhì)量比值:0.5、1、2、3、4、5)來(lái)考察各單因素對(duì)NOB-NLC制備的影響。
1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
在 “紡紗工藝設(shè)計(jì)與質(zhì)量控制”課程實(shí)施案例教學(xué)法,要根據(jù)教學(xué)大綱和培養(yǎng)方案,要理論聯(lián)系實(shí)際,培養(yǎng)學(xué)生利用理論知識(shí)解決實(shí)際問(wèn)題的能力。
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)各因素對(duì)NOB-NLC的影響進(jìn)行綜合考慮,根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選擇脂質(zhì)用量(X1)、乳化劑用量(X2)和乳化劑比例(X3)為自變量,NOB-NLC的平均粒徑(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析,來(lái)確定NOB-NLC最佳制備工藝條件,因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。利用Design-Expert 8.0.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并建立如公式(3)的模型。
Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b12X1X2+b13X1X3+b23X2X3+b11X12+b22X22+b33X32
(3)
1.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)
1.3.7.1 溫度對(duì)NOB-NLC貯藏穩(wěn)定性的影響
將NOB-NLC溶液置于瓶中密封,分別置于4,25,37 ℃的條件下避光貯藏,分別在第0、10、20、30、40天取樣,檢測(cè)樣品的外觀、平均粒徑、多分散指數(shù),分析NOB-NLC溶液的物理穩(wěn)定性。
1.3.7.2 pH值對(duì)NOB-NLC貯藏穩(wěn)定性的影響
考慮到大部分食品體系的pH值范圍為3.50~7.50,故將此作為考察NOB-NLC的穩(wěn)定性的pH范圍。用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液配置pH值分別為3.50、4.50、5.50、6.50、7.50的緩沖溶液,用不同pH值的緩沖溶液稀釋NOB-NLC溶液,測(cè)定平均粒徑、多分散系數(shù);密封后在25 ℃下避光貯藏40 d后,再次檢測(cè)樣品。
1.3.8 數(shù)據(jù)分析方法
OriginPro 9.0統(tǒng)計(jì)分析所得數(shù)據(jù),并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖;用SPSS Statiscics 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,利用鄧肯式多重比較及t-檢驗(yàn)法對(duì)差異顯著性進(jìn)行比較分析,p< 0.05表示差異顯著,p< 0.01表示差異極顯著,n=3。
2.1單因素試驗(yàn)
2.1.1 脂質(zhì)用量對(duì)NOB-NLC平均粒徑的影響
由圖1中結(jié)果可知,隨著脂質(zhì)用量的增加,粒徑呈現(xiàn)出總體上升的變化趨勢(shì)(p<0.05)。脂質(zhì)用量為720 mg時(shí)其粒徑接近200 nm,而脂質(zhì)用量為1 440 mg時(shí),其粒徑達(dá)到300 nm。有報(bào)道指出,脂質(zhì)含量與納米體系的粒徑大小、粒子形狀等性質(zhì)存在一定的相關(guān)性,并且固體和液體脂質(zhì)的比例也是一個(gè)重要的影響因素[19]。另一方面,F(xiàn)LOURY等的研究也指出,隨著脂質(zhì)含量的增加,乳化劑的作用效率降低,從而會(huì)導(dǎo)致納米乳液粒徑增加[20]。故將工藝優(yōu)化試驗(yàn)的脂質(zhì)用量選在420~1 020 mg。
圖1 脂質(zhì)用量對(duì)NOB-NLC粒徑的影響Fig.1 Influence of lipid mass on particle size of NOB-NLC注:Duncan法進(jìn)行多重比較。標(biāo)注相同小寫(xiě)字母者表示組間差異不顯著(p>0.05);標(biāo)注不同小寫(xiě)字母者表示組間差異顯著(p<0.05)。圖2同。
2.1.2 乳化劑用量對(duì)NOB-NLC平均粒徑的影響
圖2表明隨著乳化劑用量從360 mg增加至960 mg時(shí),NOB-NLC粒徑呈現(xiàn)降低的趨勢(shì);而當(dāng)乳化劑用量繼續(xù)增加時(shí),粒徑開(kāi)始增加(p<0.01)。
圖2 乳化劑用量對(duì)NOB-NLC粒徑的影響Fig.2 Influence of surfactant mass on particle size of NOB-NLC
乳化劑的濃度對(duì)粒徑的影響可以通過(guò)“乳化劑缺陷區(qū)”和“乳化劑豐富區(qū)”2種不同的機(jī)制進(jìn)行說(shuō)明[21]。當(dāng)乳化劑用量在360~960 mg時(shí),納米體系中的乳化劑處于缺陷狀態(tài),體系中沒(méi)有足夠的乳化劑將均質(zhì)過(guò)程形成的小顆粒進(jìn)行全面覆蓋,未被乳化劑覆蓋的納米顆粒團(tuán)聚形成小油滴,最后再聚集形成較大的粒子,此時(shí),增加乳化劑的用量會(huì)改善這種情況,從而使得粒徑減小。當(dāng)乳化劑用量大于960 mg時(shí),乳化劑的含量已足夠覆蓋全部納米顆粒,此時(shí),再向納米體系中添加乳化劑時(shí),它發(fā)揮的乳化作用就比較小了,粒徑反而出現(xiàn)了上升的趨勢(shì),這可能與乳化劑和脂質(zhì)等其他物質(zhì)的比例變化有關(guān)。綜合以上分析,將乳化劑用量選在720~1 440 mg之間。
2.1.3 乳化劑比例對(duì)NOB-NLC平均粒徑的影響
圖3表明乳化劑比例對(duì)粒徑變化有較大的影響,呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)(p<0.01)。當(dāng)乳化劑比例超過(guò)2時(shí),NOB-NLC粒徑大小隨著比例的增加而急劇增加。卵磷脂的作用是可以在液滴表面形成界面膜,膜性質(zhì)較穩(wěn)定,同時(shí)還可以提供負(fù)電荷屏障,因此使得制備的NLC放置更穩(wěn)定且包封率也較高。泊洛沙姆188是一種非離子型表面活性劑,它是聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物,其聚氧乙烯鏈段具親水性,聚氧丙烯鏈段具疏水性,能改變納米載體表面疏水性,使得NLC的穩(wěn)定性增加。但其用量不宜過(guò)大,如超過(guò)一定范圍,體系黏度增加,NLC易形成膠束;同時(shí)使得粒子間相互碰撞機(jī)會(huì)增加,導(dǎo)致粒子聚合甚至膠凝,體系的穩(wěn)定性變差。綜合考慮將乳化劑比例在0.5~2進(jìn)行優(yōu)化。
圖3 乳化劑比例對(duì)NOB-NLC粒徑的影響Fig.3 Influence of surfactant ratio on particle size of NOB-NLC注:Duncan法進(jìn)行多重比較。標(biāo)注相同小寫(xiě)字母者表示組間差異不顯著(p>0.05);標(biāo)注不同小寫(xiě)字母者表示組間差異顯著(p<0.05);標(biāo)有不同大寫(xiě)字母者表示組間差異極顯著(p<0.01)。
2.2響應(yīng)面試驗(yàn)
2.2.1 試驗(yàn)?zāi)P偷慕⒓捌滹@著性檢驗(yàn)
由表2數(shù)據(jù)可知,平均粒徑取值在132.07 nm和193.27 nm之間水平排列,平均值171.40 nm,試驗(yàn)值與觀測(cè)值之間具有較好的一致性。分析數(shù)據(jù)得到NOB-NLC平均粒徑(Y)對(duì)脂質(zhì)用量(X1)、乳化劑用量(X2)和乳化劑比例(X3)的二次多項(xiàng)回歸模型如下式(4),公式中3個(gè)因素前的系數(shù)均為負(fù),表示粒徑隨脂質(zhì)用量、乳化劑用量和乳化劑比例的增加而減少。
Y=563.67-0.45X1-0.36X2-106.19X3+1.16E-005X1X2+0.011X1X3-2.76E-003X2X3+2.80E-004X12+1.64E-004X22+40.79X32
(4)
2.2.2 響應(yīng)面分析
對(duì)響應(yīng)面方差分析結(jié)果做響應(yīng)曲面及等值線圖(圖4~圖6),響應(yīng)曲面圖是一個(gè)變量在零水平時(shí),其余2個(gè)變量對(duì)NOB-NLC平均粒徑交互作用的影響。等值線圖越圓,表明交互作用對(duì)NOB-NLC平均粒徑的影響越小,等值線圖越扁平,表示因素間的交互影響越大。從以下的響應(yīng)面及等值線圖中可以看出,任意2個(gè)單因素之間均不存在明顯的交互作用,最佳工藝點(diǎn)均落在試驗(yàn)考察的區(qū)域范圍內(nèi)。
表3 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析
注:*為差異顯著(p<0.05),**為差異極顯著(p<0.01)。
圖4表示的是當(dāng)乳化劑比例為1.25時(shí),脂質(zhì)用量與乳化劑用量交互作用對(duì)NOB-NLC平均粒徑的影響。當(dāng)乳化劑用量一定時(shí),隨著脂質(zhì)用量的增加,粒徑呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì);而當(dāng)脂質(zhì)用量一定時(shí),隨著乳化劑用量的增大,平均粒徑也呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì),但是變化幅度較脂質(zhì)用量稍?。恢|(zhì)用量與乳化劑用量交互作用對(duì)粒徑大小影響不顯著(p>0.05)。
圖4 脂質(zhì)用量與乳化劑用量交互影響NOB-NLC平均粒徑的響應(yīng)面圖與等值線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effects of lipid mass and surfactant mass on particle size of NOB-NLC
圖5為乳化劑用量1 080 mg時(shí),脂質(zhì)用量與乳化劑比例交互作用對(duì)NOB-NLC平均粒徑影響的響應(yīng)面圖與等值線圖。由圖可知:當(dāng)脂質(zhì)用量一定時(shí),粒徑隨著乳化劑比例的增加呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì);當(dāng)乳化劑比例一定時(shí),隨著脂質(zhì)用量的增大,NOB-NLC粒徑呈現(xiàn)出現(xiàn)反拋物線式的變化,說(shuō)明脂質(zhì)用量存在一個(gè)最低值。在脂質(zhì)用量為600~900 mg,乳化劑比例0.8~1.6時(shí),響應(yīng)值最小。
圖5 脂質(zhì)用量與乳化劑比例交互影響NOB-NLC平均粒徑的響應(yīng)面圖與等值線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of lipid mass and surfactant ratio on particle size of NOB-NLC
圖6中所顯示的是脂質(zhì)用量為720 mg時(shí),乳化劑用量與乳化劑比例交互作用對(duì)NOB-NLC平均粒徑的影響。由圖6可看出,當(dāng)乳化劑比例一定時(shí),隨著乳化劑用量的增加,粒徑呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì),變化較明顯;乳化劑比例呈現(xiàn)類(lèi)似的趨勢(shì)。乳化劑用量在900~1 250 mg,乳化劑比例0.8~1.6時(shí),響應(yīng)值最小,即平均粒徑最小。
圖6 乳化劑用量與乳化劑比例交互影響NOB-NLC平均粒徑的響應(yīng)面圖與等值線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of surfactant mass and surfactant ratio on particle size of NOB-NLC
2.2.3 工藝優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
根據(jù)所建立的模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)化分析,得到NOB-NLC平均粒徑最小的工藝參數(shù)為:脂質(zhì)用量752.20 mg,乳化劑用量1 072.41 mg,乳化劑比例1.23,在此條件下,NOB-NLC平均粒徑的預(yù)測(cè)值為138.46 nm,按照此工藝參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn),制備的NOB-NLC平均粒徑為(132.63±7.28)nm,與模型預(yù)測(cè)值誤差4.21%。
2.3NOB-NLC外觀、形態(tài)、粒徑、Zeta電位分析
由圖7-a可以看出,制備的NOB-NLC的外觀呈現(xiàn)半透明狀態(tài),有淡藍(lán)色乳光;透射電子顯微鏡結(jié)果顯示顯示(圖7-b) 優(yōu)化后的NOB-NLC微觀形態(tài)為球形或近似球形,粒徑大小均一,且粒子之間沒(méi)有出現(xiàn)粘連、團(tuán)聚現(xiàn)象。
NOB-NLC的平均粒徑為(132.63±7.28)nm(圖8-a),多分散指數(shù)為0.253±0.015,表明粒徑分布范圍較小。Zeta電位為(-38.1±2.17)mV(圖8-b),Zeta電位的絕對(duì)值大于30 mV,體系穩(wěn)定性較好。樣品包封率為(80.25±3.66)%,表明所制備的樣品對(duì)NOB有較好的搭載效果。
圖7 NOB-NLC的外觀及透射電子顯微鏡圖像(標(biāo)尺表示200 nm)Fig.7 The extrinsic feature (a) TEM photomicrographs of NOB-NLC (b). (Scale bar represents 200 nm)
圖8 NOB-NLC的平均粒徑及Zeta電位Fig.8 The particle size (a) and zeta potential (b) of NOB-NLC
2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)
2.4.1 溫度對(duì)NOB-NLC貯藏穩(wěn)定性的影響
由圖9可知,當(dāng)貯藏溫度提高到37℃時(shí),貯藏40 d后,載體體系的粒徑和多分散指數(shù)均有顯著的增大(p< 0.01),粒徑從132.63 nm增加至550.76 nm,多分散指數(shù)從0.253增加至0.691,體系穩(wěn)定性大大下降。原因可能是當(dāng)NOB-NLC貯藏在37℃時(shí),與4、25℃相比,其整個(gè)體系的運(yùn)動(dòng)能量較高,加速納米粒子之間的碰撞,從而導(dǎo)致納米粒子之間團(tuán)聚的幾率增加,使得其粒徑增大[22]。在4 ℃下隨時(shí)間的延長(zhǎng),其平均粒徑約增大了360%(p< 0.01),粒度分布范圍變寬(p< 0.01),系統(tǒng)穩(wěn)定性降低,可能是由于溫度過(guò)低,使得脂質(zhì)的沉淀結(jié)晶加劇,體系穩(wěn)定性被破壞,導(dǎo)致了絮凝。在貯藏期內(nèi),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),25℃下貯藏的NOB-NLC的粒徑以及多分散指數(shù)小于其他兩組,載體體系穩(wěn)定性最好。NOB-NLC在25 ℃下放置時(shí),外觀基本未發(fā)生變化,到第40天時(shí)體系仍澄清透明,但在4、37 ℃下其外觀變化明顯,到40天時(shí)體系較貯藏開(kāi)始時(shí)明顯渾濁,因此,NOB-NLC應(yīng)盡可能室溫條件下貯藏。
圖9 溫度對(duì)NOB-NLC的平均粒徑(a)及多分散指數(shù)(b)的影響Fig.9 Effect of temperature on particle size (a) and PDI (b) of NOB-NLC注:t-檢驗(yàn)法進(jìn)行分析,同一貯藏時(shí)間中其他兩組與25℃組相比,**表示差異極顯著(p<0.01),*表示差異顯著(p<0.05),不標(biāo)者表示差異不顯著(p>0.05)。
2.4.2 pH值對(duì)NOB-NLC貯藏穩(wěn)定性的影響
圖10中給出了樣品在不同pH條件下貯藏0 d及40 d后,NOB-NLC的粒徑及多分散指數(shù)隨時(shí)間的變化關(guān)系。由圖可知,在pH值為3.50~7.50內(nèi),試驗(yàn)開(kāi)始時(shí),不同pH下NLC的粒徑差別不大(p>0.05),樣品保持穩(wěn)定,多分散指數(shù)基本低于0.30(p>0.05),粒徑分布比較均一,載體體系穩(wěn)定。40 d貯藏結(jié)束時(shí),在不同pH下貯藏的NOB-NLC,其粒徑與多分散指數(shù)都呈現(xiàn)了上升的趨勢(shì),不同pH之間的平均粒徑和多分散指數(shù)的差異達(dá)到了極顯著水平(p< 0.01),特別是在pH值為5.50時(shí)尤為明顯,可能是由于在這一pH條件下,由于體系正電荷的作用使粒子帶電量到達(dá)等電點(diǎn)附近,因斥力減小而發(fā)生了聚集。貯藏結(jié)束后,NOB-NLC平均粒徑在400 nm以下,多分散指數(shù)小于0.50,體系外觀良好,故NOB-NLC可以應(yīng)用于pH值為3.50~7.50的食品體系當(dāng)中。
圖10 溫度對(duì)NOB-NLC的平均粒徑及多分散指數(shù)的影響(圖a表示0 d時(shí)測(cè)定結(jié)果;圖b表示40 d時(shí)測(cè)定結(jié)果)Fig.10 Effect of pH on particle size and PDI of NOB-NLC. (Fig.a represents for 0 d results; Fig.b represents for 0 d results)注:Duncan法進(jìn)行多重比較。標(biāo)注相同小寫(xiě)字母者表示組間差異不顯著(p>0.05);標(biāo)注不同小寫(xiě)字母者表示組間差異顯著(p<0.05);標(biāo)注不同大寫(xiě)字母者表示組間差異極顯著(p<0.01)。
本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法,以平均粒徑為響應(yīng)值,優(yōu)化了川陳皮素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備工藝。結(jié)果顯示,脂質(zhì)含量對(duì)平均粒徑的影響顯著(p<0.05),因素間的交互作用不顯著(p>0.05),通過(guò)響應(yīng)面法建立多元二次模型極顯著(p<0.01),得到了最佳的處方工藝為脂質(zhì)用量752.20 mg,乳化劑用量1 072.41 mg,乳化劑比例1.23,NOB-NLC平均粒徑的預(yù)測(cè)值為138.46 nm;在此條件下制備N(xiāo)OB-NLC,得到的納米載體平均粒徑為(132.63±7.28)nm,多分散指數(shù)為(0.253±0.015),Zeta電位為(-38.1±2.17)mV,包封率為(80.25±3.66)%;通過(guò)透射電子顯微鏡觀察,粒子大小分布均勻,結(jié)構(gòu)完整;在25℃條件下,pH范圍3.50~7.50,40 d貯藏期內(nèi),顯示出良好的穩(wěn)定性。本試驗(yàn)制備的川陳皮素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體體系穩(wěn)定,各項(xiàng)考察指標(biāo)均比較理想,可將其作為NOB的一種新的載體形式,應(yīng)用于食品添加劑、功能食品等方面,為川陳皮素下一步的研究和開(kāi)發(fā)利用奠定了良好基礎(chǔ)。
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Preparationandstabilityevaluationfornobiletinnanostructuredlipidcarriers
HUANG Wei1,2,DOU Hua-ting1*,WU Hou-jiu1,WANG Hua1,SUN Zhi-gao1,MA Ya-qin1,HUANG Lin-hua1,GUO Li1,WANG Jun1,HUANG Xue-gen1
1(Citrus Research Institute,Southwest University,Beibei,Chongqing 400712,China) 2(College of Forestry and Life Science,Chongqing University of Arts and Sciences,Yongchuan,Chongqing 402160,China)
Nanostructured Lipid Carriers (NLC) are a new lipid nanoparticle system and are wildly used in many fields of food science and process.Nobiletin,a citrus polymethoxylated flavone is extracted from citrus fruit peels,and has many health benefits.Nanostructured NLC can increase its water-solubility and bioavailability.High pressure homogenization was used to prepare nobiletin nanostructured lipid carrier (NOB-NLC).Single factor design was chosen to study the influence of the amount of lipid,emulsifier and emulsifier ratio on the quality of NOB-NLC.Response surface design was used to optimize the preparation parameters.The optimal condition was: 752.20 mg lipid,1072.41 mg emulsifier and 1.23 drug-lipid ratio.NLC -NOB exhibited spherical shape with diameter of (132.63±7.28) nm,polydispersity index (0.253±0.015),zeta potential (-38.1±2.17)mV and an entrapment efficiency (80.25±3.66)%.The scanning electron microscope showed that the NOB-NLC were spherical shape.The influence of storage conditions on the stability of NOB-NLC was studied.The results indicated that NOB-NLC was stable after storage in dark at 25 ℃,pH 3.5-7.5 for 40 d,and the particle size is relatively consistent.It is available to the food systems with pH range of 3.50-7.50.
nanostructured lipid carriers; nobiletin; Box-Behnken design; characterization; stability
10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013503
博士研究生,助教(竇華亭教授為通訊作者,E-mail:hdou ̄33880@yahoo.com)。
公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303076-07);重慶市2016年基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究一般項(xiàng)目(cstc2016 ̄jcyjA ̄0552)
2016-11-28,改回日期:2017-01-17