徐潔瓊，曾茂茂，秦昉，何志勇，陳潔

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

熱加工處理對β-乳球蛋白與茶多酚間相互作用的影響

徐潔瓊，曾茂茂，秦昉，何志勇*，陳潔

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

利用熒光光譜技術(shù)分析β-乳球蛋白與EGCG、EGC間的相互作用，通過測定其結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、熱力學(xué)常數(shù)及β-乳球蛋白的構(gòu)象變化，探究不同熱處理加工條件(80 ℃/20 min、100 ℃/5 min)和加熱方式(蛋白與茶多酚混合加熱、蛋白單獨加熱)對β-乳球蛋白與茶多酚間相互作用的影響。結(jié)果表明，熱加工處理對β-乳球蛋白構(gòu)象及與EGCG、EGC的結(jié)合強度有不同影響。β-乳球蛋白熱變性致結(jié)構(gòu)展開，從而表現(xiàn)出與EGCG、EGC的結(jié)合能力增強。EGCG、EGC均能與β-乳球蛋白自發(fā)形成復(fù)合物而發(fā)生相互作用，結(jié)合強度EGCG明顯大于EGC。對比EGCG、EGC與β-乳球蛋白混合加熱和β-乳球蛋白單獨加熱，發(fā)現(xiàn)80 ℃混合加熱后的結(jié)合強度均大于80 ℃蛋白單獨加熱，分別增加55.56%和42.78%，而100 ℃混合加熱后的結(jié)合強度均小于100 ℃蛋白單獨加熱，分別減小14.44%及74.22%。熱加工處理能改變EGCG、EGC與β-乳球蛋白的結(jié)合力類型。

β-乳球蛋白；兒茶素；相互作用；熱處理；熒光光譜

牛乳蛋白中主要含有酪蛋白及乳清蛋白，分別約占80%及20%[1]，而β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分。綠茶中兒茶素占其茶多酚總量的近80%，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)和表兒茶素(epicatechin，EC)則為主要的綠茶多酚[2]，其對許多慢性及退化性疾病具有藥理和保健功能，例如癌癥、心血管疾病、肥胖、糖尿病和神經(jīng)退行性過程等[3-7]。奶茶飲料同時富含牛乳蛋白和茶多酚，故近年來深受消費者喜愛。但奶茶加工和貯藏過程中茶多酚與蛋白質(zhì)的互作，造成奶茶乳液體系不穩(wěn)定甚至產(chǎn)生渾濁沉淀，對茶多酚的抗氧化性及游離茶多酚含量具有一定影響。KANAKIS[8]研究了天然β-乳球蛋白與茶多酚間的相互作用，結(jié)果表明β-乳球蛋白與茶多酚間有不同大小的結(jié)合強度。YUKSEL[9]研究了牛乳蛋白與茶多酚間的相互作用，發(fā)現(xiàn)茶多酚能使蛋白質(zhì)表面的疏水性降低且利用等溫滴定量熱法確定其為非共價鍵作用。HE[10]利用熒光光譜法研究了β-乳球蛋白與EGCG在不同pH和熱處理后的相互作用，發(fā)現(xiàn)pH和溫度會影響兩者間的相互作用強度。蛋白與茶多酚間的相互作用對奶茶產(chǎn)品的抗氧化性、粒徑及渾濁程度等健康品質(zhì)有一定影響。THONGKAEW[11]研究證明乳清分離蛋白與多酚間存在相互作用，并能增強蛋白質(zhì)的沉淀能力。WANG[12]研究EGCG與乳白蛋白互作形成的復(fù)合物的抗氧化性大于乳白蛋白對照組，且在pH 7.0及pH 8.0下，復(fù)合物液滴的平均徑直小于乳白蛋白對照組。本實驗利用熒光光譜方法研究工業(yè)熱加工處理對奶茶體系中β-乳球蛋白與EGCG和EGC分子相互作用的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料

β-乳球蛋白(純度>98%)，美國Sigma公司；EGCG、EGC(純度>95%)，南京春秋生物工程有限公司；其他所用試劑均為分析純，國藥控股化學(xué)試劑有限公司。

1.2實驗儀器

Fluoromax-4型熒光光譜儀，美國HORIBA公司；HWS-12 水浴鍋，上海一恒科技有限公司；超純水系統(tǒng)，南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.3溶液配制

用三羥甲基氨基甲烷(Tris)和HCl配制pH 6.4的Tris-HCl緩沖液；Tris-HCl緩沖液配制20 mmol/L的β-乳球蛋白儲備液，儲備液保存于4 ℃冰箱；Tris-HCl緩沖液分別配制1.0 mmol/L的EGCG及EGC溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

1.4五組乳球蛋白-多酚復(fù)合物溶液制備

常溫組：β-乳球蛋白液直接與多酚混合；單80組：β-乳球蛋白液80 ℃水浴加熱20 min后，立即冰水浴冷卻再與相應(yīng)多酚混合；單100組：β-乳球蛋白液100 ℃沸水浴加熱5 min后，立即冰水浴冷卻再與相應(yīng)多酚混合；混80組：β-乳球蛋白與相應(yīng)濃度多酚混合后，再置于80 ℃水浴中加熱20 min后立即冰水浴冷卻；混100組：β-乳球蛋白與相應(yīng)濃度多酚混合后，再置于100 ℃加熱5 min后立即冰水浴冷卻。每組樣品中均含有7個濃度梯度的蛋白-多酚樣品，其中β-乳球蛋白濃度均10 μmol/L，EGCG濃度梯度為0、25、50、100、150、200、250 μmol/L；EGC濃度梯度為0、100、200、400、600、800、1 000 μmol/L。

1.5熒光光譜法

將每組樣品分別置于24、31和38 ℃水浴中保溫30 min，然后設(shè)置激發(fā)波長280 nm，狹縫波長5 nm，在300～450 nm內(nèi)測定相應(yīng)溫度下樣品液的熒光發(fā)射光譜，并以相應(yīng)濃度多酚的緩沖溶液作為空白扣除，得到每組樣品的熒光強度值。

1.6數(shù)據(jù)分析

實驗均重復(fù)做3組，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖，Statistix 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，取顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1熒光光譜

蛋白質(zhì)自身內(nèi)源熒光主要來自于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及苯丙氨酸(Phe)殘基，其中Trp熒光的量子產(chǎn)率和發(fā)射最大波長對環(huán)境的極性和其生物大分子的結(jié)構(gòu)變化非常敏感[13]，因而常被用作內(nèi)源探針研究蛋白質(zhì)與多酚相互作用。當(dāng)激發(fā)波長為280 nm時，蛋白質(zhì)的熒光光譜主要由Trp、Tyr共同貢獻(xiàn)[14]。β-乳球蛋白中含有Trp19和Trp61，其中Trp19埋藏在乳球蛋白的內(nèi)部，接近花萼底端且貢獻(xiàn)80%的總熒光，而Trp61則在一定程度上暴露于極性環(huán)境中，在Cys66-Cys160二硫鍵附近，貢獻(xiàn)一部分的熒光[15-16]。

圖1 EGCG和EGC對β-乳球蛋白的熒光猝滅圖譜Fig.1 Fluorescence emission spectra of 10 μmol/L β-lactoglobulin at 24 ℃ (λex = 280 nm) in the presence of various concentrations of EGCG 注：A～G: EGCG 0, 25, 50, 100, 150, 200, 250 μmol/L (a～g:EGC 0, 100, 200, 400, 600, 800, 1 000 μmol/L) after thermal processings。

從圖1中可看到，EGCG、EGC都對β-乳球蛋白的熒光有猝滅作用，猝滅效果隨多酚濃度的增大而增強，且EGCG猝滅能力大于EGC。這可能與EGCG、EGC的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，EGCG中酯基相連的苯環(huán)上有3個羥基，可能更易發(fā)生氫鍵作用[17]。

β-乳球蛋白在80 ℃和100 ℃加熱后最大熒光強度增加，這可能與在中性環(huán)境下β-乳球蛋白的變性溫度大概在70 ℃左右，80 ℃以上加熱的熱處理使β-乳球蛋白復(fù)合物變性解體，使自消滅的Trp減少有關(guān)[18-20]。β-乳球蛋白常溫、80 ℃及100 ℃處理后的最大發(fā)射波長(λmax)分別為330，331及332 nm。加熱處理后出現(xiàn)輕微的紅移表明β-乳球蛋白的Trp殘基轉(zhuǎn)移到一個更親水或極性微環(huán)境中，主要是由于熱處理引起結(jié)構(gòu)的展開[18]。

分析EGCG對β-乳球蛋白的熒光猝滅表明，常溫、80 ℃及100 ℃蛋白單獨加熱下λmax均表現(xiàn)出先紅移至335 nm，再藍(lán)移至333 nm；而80 ℃及100 ℃混合加熱下λmax則分別緩慢紅移至336 nm和338 nm。當(dāng)EGCG添加濃度為100 μmol/L時，常溫、80 ℃及100 ℃蛋白單獨加熱下其對β-乳球蛋白的猝滅率分別為42.35%、46.72%和46.94%；80 ℃及100 ℃混合加熱的樣品則為66.60%及65.85%，可見β-乳球蛋白加熱后EGCG對β-乳球蛋白的猝滅能力增加，且混合加熱比單加熱猝滅率高。這可能與加熱后β-乳球蛋白變性展開，使有更多的Trp殘基能被EGCG猝滅和EGCG可能被氧化后猝滅能力增強有關(guān)[10]。5種熱加工處理后EGC對β-乳球蛋白熒光的猝滅，使λmax幾乎都紅移至333 nm，表明EGC對β-乳球蛋白Trp殘基的環(huán)境并沒有多大改變。相同濃度下，常溫、80 ℃及100 ℃蛋白單獨加熱樣品的猝滅率分別為10.27%、5.11%和1.29%，可見β-乳球蛋白加熱后EGC對其猝滅率降低，這可能與加熱后β-乳球蛋白變性展開而暴露更多的Trp殘基與EGC猝滅能力弱共同導(dǎo)致有關(guān)；但混合加熱后的猝滅率增大，80 ℃及100 ℃混合加熱樣品分別表現(xiàn)為13.19%和14.25%，可能與EGC受熱氧化后猝滅能力增強有關(guān)。

2.2熒光猝滅機(jī)理的判斷

小分子猝滅劑對蛋白質(zhì)熒光體分子的熒光猝滅作用因猝滅機(jī)理的不同，一般可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[21]。靜態(tài)猝滅是指猝滅劑與熒光體分子之間通過分子間作用力，在基態(tài)時結(jié)合形成一定結(jié)構(gòu)的不發(fā)光的超分子復(fù)合物，因而蛋白質(zhì)熒光體的熒光強度降低。動態(tài)猝滅則與猝滅劑與熒光體分子在激發(fā)態(tài)時的相互作用，以及分子擴(kuò)散和碰撞有關(guān)，可用Stern-Volmer 方程描述[22]，見公式(1)：

(1)

式中：F0和F分別代表蛋白質(zhì)熒光體分子與猝滅劑(茶多酚)結(jié)合前后的熒光強度；[Q]，猝滅劑濃度；Ksv，動態(tài)猝滅常數(shù)；Kq，生物大分子猝滅過程中的速率常數(shù)；τ0，熒光體分子在無猝滅劑存在下的壽命常數(shù)，其值大約為10-8s。根據(jù)公式(1)，作F0/F與[Q]的Stern-Volmer (S-V)曲線，如圖2所示，從斜率可得到Ksv，且不同溫度(297，304，311 K)下測得的Kq值列于表1與表2。研究報道，當(dāng)熒光猝滅為動態(tài)猝滅時，Ksv值隨溫度增加而增大，且各類猝滅劑對熒光體分子的最大Kq值約為2×1010L/(mol·s)[23]。

從圖2中可看出EGCG、EGC與β-乳球蛋白的S-V曲線部分呈非直線關(guān)系(R2<0.98)，表明熱加工處理下茶多酚對β-乳球蛋白的猝滅并非主要由動態(tài)猝滅，可能是由猝滅劑與熒光體分子間形成不發(fā)光的超分子復(fù)合物的靜態(tài)猝滅[24]或者靜態(tài)和動態(tài)猝滅共有的猝滅[2]導(dǎo)致。由表1、表2的結(jié)果可看出，EGCG與β-乳球蛋白在不同熱處理條件下的Ksv并不是隨著溫度的升高而增大，有些呈現(xiàn)出隨溫度升高而降低，且其Kq值在1012L/(mol·s)數(shù)量級，遠(yuǎn)大于最大動態(tài)猝滅的Kq值，這些都表明它們的熒光猝滅機(jī)制為復(fù)雜的靜態(tài)猝滅[25]。EGC與β-乳球蛋白的Ksv隨溫度增加而增加，但其Kq值稍大于2×1010L/(mol·s)，推測EGC與β-乳球蛋白的猝滅可能是由靜態(tài)和動態(tài)猝滅共同作用的結(jié)果。但在線性范圍內(nèi)，以上數(shù)據(jù)圖表事實說明這兩種茶多酚與β-乳球蛋白體系的熒光猝滅過程都可以認(rèn)為是形成新復(fù)合物而引起的，即認(rèn)為其猝滅機(jī)理是靜態(tài)猝滅[17]

表1 不同熱處理下EGCG與β-乳球蛋白的猝滅常數(shù)

注：不同小寫字母表示每組實驗不同溫度下KSV及Kq間存在顯著性差異(p<0.05)。表2同。

表2 不同熱處理下EGC與β-乳球蛋白的猝滅常數(shù)

2.3結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)的計算

由以上判斷可知，EGCG、EGC與β-乳球蛋白的結(jié)合為靜態(tài)猝滅過程。因此按照靜態(tài)猝滅機(jī)理，其結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點數(shù)n與猝滅劑及熒光強度之間的關(guān)系可按照公式(2)計算：

(2)

式中：F0、F及[Q]的意義與公式(1)相同，KA和n分別代表猝滅劑與熒光體分子間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)。根據(jù)公式(2)，作lg[(F0-F)/F]關(guān)于lg[Q]的圖線，即得到EGCG、EGC與β-乳球蛋白在五種熱加工處理下的雙對數(shù)曲線圖，從圖3中可見其雙對數(shù)都呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。由圖3中直線的斜率和截距可分別得到n和KA，其計算結(jié)果列于表3和表4。分析在297 K下的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)，可看到EGCG與β-乳球蛋白的結(jié)合常數(shù)KA(3×104～7×104L/mol) 明顯大于EGC與β-乳球蛋白的KA(3×102～15×102L/mol)。這與WU[2]研究EGC與β-乳球蛋白結(jié)合常數(shù)13×102L/mol及HE[10]在pH為6.4下研究EGCG與β-乳球蛋白的結(jié)合常數(shù)7×104L/mol類似。劉欣[17]在研究在兒茶素與牛血清蛋白(BSA)相互作用時同樣得到類似結(jié)果。結(jié)合位點數(shù)n均在1左右，表明β-乳球蛋白均提供一個位點與EGCG、EGC結(jié)合形成復(fù)合物[8,10]。

圖3 不同溫度下β-乳球蛋白與EGCG、EGC相互作用的雙對數(shù)回歸曲線Fig.3 The double logarithm regression curve of lg [(F0-F)/F] versus lg [Q] of β-lactoglobulin at 297 K, 304 K and 311 K after thermal processings

分析EGCG、EGC與β-乳球蛋白的KA，可得常溫下的結(jié)合常數(shù)最小。當(dāng)對β-乳球蛋白單獨加熱處理后，EGCG、EGC與其結(jié)合常數(shù)增加，并隨著加熱溫度的升高而明顯增加，這主要與β-乳球蛋白為熱變性蛋白[18-20]有關(guān)。本實驗中，從加熱后β-乳球蛋白的熒光強度增強情況，可判斷β-乳球蛋白在100 ℃下加熱5 min后變性程度大于80 ℃下加熱20 min的變性程度，故導(dǎo)致結(jié)構(gòu)更為舒展，因而為小分子的結(jié)合提供更多的平臺。當(dāng)對蛋白多酚混合80 ℃加熱20 min后，對比80 ℃蛋白單獨加熱，EGCG、EGC與β-乳球蛋白混合80 ℃加熱后的結(jié)合常數(shù)均顯著增加(p<0.05)，這可能是多酚發(fā)生氧化且其氧化后產(chǎn)物醌與β-乳球蛋白發(fā)生共價結(jié)合有關(guān)[10,12]。對比表中100 ℃蛋白單獨加熱與100 ℃混合加熱下KA值，發(fā)現(xiàn)100 ℃蛋白單獨加熱均大于100 ℃混合加熱，這可能與EGCG、EGC發(fā)生劇烈氧化形成聚酯型兒茶素導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)增大，從而與蛋白質(zhì)結(jié)合能力減弱有關(guān)[10,26]。

對比蛋白單獨加熱和混合加熱的結(jié)合位點數(shù)n，發(fā)現(xiàn)EGCG、EGC與β-乳球蛋白混合加熱后的結(jié)合位點數(shù)低于相同溫度下蛋白單獨加熱后的結(jié)合位點數(shù)。分析β-乳球蛋白的單獨加熱處理，可發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白加熱后與EGCG、EGC的結(jié)合位點數(shù)增加，這同樣與β-乳球蛋白的熱變性有關(guān)。

2.4熱力學(xué)參數(shù)與結(jié)合力類型

小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子間的相互作用主要有疏水相互作用、靜電相互作用、范德華作用和氫鍵作用等。研究表明，從熱力學(xué)參數(shù)可判斷蛋白質(zhì)—配體間的結(jié)合力類型。當(dāng)ΔH>0、ΔS<0 時，分子間作用力主要是靜電相互作用和疏水相互作用；當(dāng)ΔH>0、ΔS>0 時，分子間作用力主要是疏水相互作用；當(dāng)ΔH<0、ΔS<0時，分子間作用力主要是范德華作用、氫鍵作用；而當(dāng)ΔH<0、ΔS>0時，分子間作用力則主要為靜電相互作用[27]。

蛋白質(zhì)與配體間的熱力學(xué)參數(shù)可根據(jù)公式(3)～(5)計算[27]

(3)

ΔG=-RTlnKA

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

式中：KA，對應(yīng)溫度T時的結(jié)合常數(shù)；ΔG，結(jié)合過程的自由能變化；ΔH，結(jié)合焓變；ΔS，結(jié)合熵變，R為氣體常數(shù)(8.314 J/(mol·K)) 。根據(jù)公式(4)，先計算ΔG，然后作lnKA關(guān)于1/T的圖線，由直線的斜率可計算得到ΔH，最后根據(jù)公式(5)，計算相應(yīng)溫度下的ΔS。計算結(jié)果同樣列于表3、表4。

表3 EGCG與β-乳球蛋白的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點數(shù)n及熱力學(xué)參數(shù)

注：不同大寫字母表示在297 K下KA存在顯著性差異(p<0.05)。表4同。

從表3和表4中可看出，EGCG、EGC與β-乳球蛋白結(jié)合過程中的自由能變化ΔG都小于0，這表明其與β-乳球蛋白的結(jié)合均為自發(fā)進(jìn)行[28]。對于β-乳球蛋白-EGCG體系，常溫?zé)o處理下其ΔH>0、ΔS>0，表明兩者間主要存在疏水相互作用，80 ℃蛋白單獨加熱、100 ℃蛋白單獨加熱及80 ℃混合加熱后其ΔH<0、ΔS<0，則表現(xiàn)為范德華力及氫鍵，100 ℃混合加熱后熱力學(xué)常數(shù)ΔH<0、ΔS>0，分子間作用力則主要為靜電相互作用。對于β-乳球蛋白-EGC體系中，除100 ℃蛋白單獨加熱其ΔH<0、ΔS>0，表現(xiàn)為靜電相互作用外，其余均表現(xiàn)為疏水相互作用。

表4 EGC與β-乳球蛋白的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點數(shù)n及熱力學(xué)參數(shù)

3 結(jié)論

熱加工處理和兒茶素均能使β-乳球蛋白的構(gòu)象發(fā)生一定程度的改變。2種兒茶素單體EGCG、EGC均能與β-乳球蛋白發(fā)生相互作用，且為自發(fā)進(jìn)行，根據(jù)結(jié)合常數(shù)判斷其作用強弱順序為：EGCG>EGC。β-乳球蛋白提供一個位點與EGCG、EGC結(jié)合。β-乳球蛋白加熱后與EGCG、EGC的結(jié)合強度增大。EGCG、EGC與β-乳球蛋白80 ℃混合加熱后的結(jié)合強度大于β-乳球蛋白80 ℃單獨加熱后的結(jié)合常數(shù)。但EGCG、EGC與β-乳球蛋白100 ℃混合加熱后的結(jié)合強度均小于β-乳球蛋白100 ℃單獨加熱后的結(jié)合常數(shù)。熱加工處理能影響EGCG、EGC與β-乳球蛋白的結(jié)合力類型。當(dāng)前研究證明熱加工處理對β-乳球蛋白與茶多酚間相互作用有不同程度的影響，因此可為探究相互作用與茶多酚在人體消化后的生物可及性關(guān)系提供指導(dǎo)。

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Interactionofβ-lactoglobulinwithteapolyphenolsunderdifferentthermalprocessing

XU Jie-qiong, ZENG Mao-mao, QIN Fang,HE Zhi-yong*, CHEN Jie

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122, China)

Tea polyphenols are rich in catechins, and epigallocatechingallate (EGCG), and epigallocatechin (EGC) are typical catechins monomer. The competitive interactions of β-lactoglobulin with EGCG and EGC under the two heat processing conditions (80 ℃/20 min; 100 ℃/5 min) and two heating methods (heating the mixture; protein alone heating) were investigated by fluorescence spectroscopy. The influence of heating process and conditions on the interaction between β-lactoglobulin and tea polyphenols was studied by measuring binding constant, binding sites, thermodynamic parameters and conformational changes of β-lactoglobulin. The results indicated that the thermal processing changed the structure of β-lactoglobulin and the binding ability of EGCG/EGC with β-lactoglobulin. The structure of β-lactoglobulin were more open than its native state due to the heat-induced denaturation and unfolding of protein. Therefore, the strong binding affinity with EGCG and EGC were observed. The β-lactoglobulin can spontaneously interact with EGCG/ EGC to form a complex and its binding strength with EGCG was stronger than that with EGC. Compared with heating mixing EGCG, EGC and β-lactoglobulin and heating with β-lactoglobulin alone, it was found that after 80 ℃ mixed heating, the binding strength were stronger than that of protein alone heating, and binding strength was increased by 55.56% and 42.78% respectively. However, after 100 ℃ mixed heating, the binding strength were weaker than 100 ℃ protein alone heating, decreased by 14.44% and 74.22% respectively. Thermal processing can change binding types of EGCG/EGC with β-lactoglobulin.

β-lactoglobulin; catechin; interaction; thermal processing; fluorescence spectroscopy

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013213

碩士研究生(何志勇教授為通訊作者,E-mail:zyhe@jiangnan.edu.cn)。

江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室自由探索資助課題(No.SKLF-ZZA-201504)

2016-10-19，改回日期：2017-01-04