王剛，賀禹豐，陳曉華，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(衡陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽，421008)

乳酸菌生物學(xué)特性與其拮抗空腸彎曲桿菌在小鼠腸道定植能力的分析

王剛1*，賀禹豐1，陳曉華2，趙建新1，張灝1，陳衛(wèi)1

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(衡陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽，421008)

采用3周齡C57BL/6小鼠建立了空腸彎曲桿菌感染模型，評價了8株在體外具有抑制空腸彎曲桿菌生長能力的乳酸菌在體內(nèi)拮抗空腸彎曲桿菌定植的能力，同時對該8株菌生長速率、產(chǎn)酸能力、生物膜形成能力、黏附能力等生物學(xué)特性進行了測定，通過主成分分析對8株乳酸菌生物學(xué)特性的評價以及皮爾森相關(guān)性系數(shù)對乳酸菌生物學(xué)特性及其在體內(nèi)拮抗空腸彎曲桿菌定植能力相關(guān)性的分析，發(fā)現(xiàn)8株乳酸菌種間生物學(xué)特性差異明顯大于種內(nèi)生物學(xué)特性差異，且乳酸菌在小鼠體內(nèi)拮抗空腸彎曲桿菌定植的能力與其細胞黏附能力呈正相關(guān)。具有最高黏附指數(shù)的植物乳桿菌N8、N9可有效清除模型小鼠腸道內(nèi)的空腸彎曲桿菌，對保護人體免受空腸彎曲桿菌感染具有潛在的應(yīng)用價值，同時也為具有拮抗致病菌能力的益生菌的篩選提供了理論依據(jù)。

乳酸菌；空腸彎曲桿菌；拮抗；黏附；小鼠感染模型

空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni，C.jejuni)是一種革蘭氏陰性病原菌。20世紀(jì)90年代以來，C.jejuni感染率上升明顯，在歐美發(fā)達國家，該菌是造成腹瀉的主要病原體之一[1]。人體感染C.jejuni可造成腹痛、水樣腹瀉以及便血，嚴(yán)重時甚至可能引起格林-巴利綜合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)，導(dǎo)致急性神經(jīng)麻痹[2]。目前，抗生素是治療C.jejuni感染的常用療法，然而C.jejuni抗藥性的與日俱增促使人們尋找可替代抗生素治療的新方法[3]。

部分乳酸菌是健康人類腸道中的固有菌群，其對于維持人體腸道健康發(fā)揮著十分重要的作用。研究表明，乳酸菌對多種病原菌具有良好的抑制作用，如沙門氏菌[4]、大腸桿菌O157:H7[5]、單增李斯特菌[6]等。同時有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對于防治C.jejuni感染同樣具有良好的效果。CEAN[7]等篩選得到了4株可以阻止C.jejuni入侵雞原代細胞的乳酸菌，將4株菌混合后喂食給幼年和成年肉雞，均可顯著降低其腸道內(nèi)C.jejuni定植量。SANTINI[8]等的研究表明，BifidobacteriumlongumPCB 133可以在體外有效抑制C.jejuni生長，同時具有良好的加工性能以及消化道耐受能力。動物實驗表明該菌可在雞體內(nèi)有效定植6天以上，并能夠顯著降低C.jejuni定植量。

本研究通過建立C.jejuni在小鼠體內(nèi)定植模型并利用該模型評價乳酸菌對C.jejuni在體內(nèi)定植的拮抗能力，同時將拮抗能力與乳酸菌的部分生物學(xué)特性進行相關(guān)性分析，探索乳酸菌拮抗C.jejuni感染定植的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗菌株和細胞株

本研究選用實驗室保藏的已知對C.jejuni具有體外抑制作用的8株乳酸菌。8株乳酸菌以及C.jejuniNCTC11168均保藏于實驗室菌種庫并經(jīng)過16s rDNA測序確定種屬。人結(jié)腸癌細胞株HT-29，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。8株乳酸菌的編號、種屬見表1。

表1 實驗用乳酸菌菌株信息

1.2試劑與儀器

腦心浸液肉湯(BHI)，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；無菌綿羊血，購自杭州新銳生物工程有限公司；Skirrow空彎選擇性混合抗生素，購自英國OXOID公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司。

BD150L三氣培養(yǎng)箱，德國Bingd公司；PYX-DHS隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司；生物安全柜，美國Labconco公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 GC-MS-QP2010 Ulra System，日本島津公司。

1.3菌株的培養(yǎng)

乳酸菌菌株以30%甘油凍存于-80 ℃超低溫冰箱中，使用時先于4 ℃下化凍并以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 h，以此條件活化2代備用。

C.jejuni菌株以30%甘油凍存于-80 ℃超低溫冰箱中，使用時先于4 ℃下化凍并在哥倫比亞血平板上劃線接種，于37 ℃三氣培養(yǎng)箱(5% O2, 10% CO2,85% N2)培養(yǎng)48 h后備用。

1.4空腸彎曲桿菌生長曲線的測定

挑取哥倫比亞血平板上的C.jejuni單菌落并接種于BHI培養(yǎng)基中，于37 ℃三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于新鮮BHI培養(yǎng)基中，于37 ℃三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)，間隔不同時間點取樣進行涂布計數(shù)。

1.5牛津杯法測定乳酸菌發(fā)酵上清液抑菌效果

實驗方法參考張婷婷[9]等的方法并加以改良：將37 ℃培養(yǎng)20 h后的乳酸菌懸液經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾后得到乳酸菌發(fā)酵上清液。取部分上清液，用NaOH將其pH值調(diào)整為6.5。取100 μL 1×106CFU/mL的C.jejuni菌懸液，均勻涂布于哥倫比亞血平板上，將無菌牛津杯插入平板瓊脂層并避免插至平板底部。取200 μL乳酸菌發(fā)酵上清液沿壁加入牛津杯中，蓋上平板蓋并將平板正置于三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察并測量牛津杯外圍抑菌圈直徑。每個樣本做3個平行實驗，以MRS培養(yǎng)基(pH=6.5)作為陰性對照，0.28 mg/mL的諾氟沙星溶液作為陽性對照。

1.6乳酸菌生物學(xué)特性的評價

1.6.1 生長速率

取活化后的乳酸菌，調(diào)整至相同活菌數(shù)，以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)20 h后進行涂布計數(shù)。將此時的乳酸菌活菌數(shù)用于評估其生長速率。

1.6.2 產(chǎn)酸能力

取活化后的乳酸菌，調(diào)整至相同活菌數(shù)，以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)20 h后用0.22 μm無菌濾膜過濾，得到無菌發(fā)酵上清液并用pH計測量，每株菌做3個平行實驗。

1.6.3 生物膜形成能力

取活化后的乳酸菌，調(diào)整至相同活菌數(shù)，以體積分?jǐn)?shù)1∶100的比例稀釋于MRS培養(yǎng)基中，混勻。移取200 μL菌懸液至96孔板中，37 ℃培養(yǎng)48 h。吸走孔中懸浮菌液，用200 μL PBS緩沖液輕柔地沖洗2次，恒溫干燥箱中烘干剩余水分。用200 μL 0.1%結(jié)晶紫染色20 min，繼續(xù)以200 μL PBS緩沖液輕柔地沖洗3次，烘干。每孔加入200 μL 95%乙醇，震蕩3 min后，移取150 μL孔中液體至新的96孔板中，在595 nm處測量吸收值。

1.6.4 黏附HT-29細胞能力

實驗方法參考王剛[10]的方法等并稍作修改：以RPMI-1640完全培養(yǎng)基復(fù)蘇凍存于液氮的HT-29細胞，在37 ℃、5% CO2環(huán)境下靜置培養(yǎng)，每2天換液1次。待細胞生長至70%密度，用胰酶消化并進行傳代，直至細胞生長到足夠數(shù)量。將貼壁生長的HT-29細胞經(jīng)胰酶消化后以RPMI-1640完全培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整至1×105個/mL。向24孔板中加入1 mL HT-29細胞懸液，待細胞生長至貼壁狀態(tài)后吸去培養(yǎng)液，并用PBS緩沖液沖洗2次，加入1 mL乳酸菌懸液(以RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，1×108CFU/mL)，并補加RPMI-1640培養(yǎng)基(不含血清及抗生素)至2 mL，37 ℃、5% CO2條件下孵育2 h。孵育結(jié)束后用PBS緩沖液清洗3次，以除去未黏附的細菌，用倒置顯微鏡對細胞表面黏附的細菌進行計數(shù)，通過計算得出乳酸菌的黏附指數(shù)(每個細胞表面平均黏附的細菌個數(shù))。

1.7動物實驗

1.7.1 動物飼養(yǎng)及分組

動物實驗選用3周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠，同室分籠喂養(yǎng)，每籠6只。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(20±2) ℃，濕度(60±5)%，12 h光照12 h黑暗，每3～4 d更換墊料。每日灌胃體積為200 μL/只，C.jejuni灌胃菌數(shù)為2×109CFU/mL，不同乳酸菌灌胃菌數(shù)統(tǒng)一調(diào)整為5×109CFU/mL。飼養(yǎng)過程中每周稱量小鼠體重。實驗分組及處理方案詳見表2。

表2 動物實驗分組及處理方案

1.7.2 小鼠糞便中C.jejuni的計數(shù)

收集動物實驗小鼠飼養(yǎng)第28天的糞便，置于4 ℃冰盒中。將0.1 g糞便重懸于PBS緩沖液中，充分混勻后進行梯度稀釋并涂布于哥倫比亞血平板，三氣條件下培養(yǎng)48 h后對C.jejuni菌落數(shù)進行計數(shù)。哥倫比亞血平板配制時以體積分?jǐn)?shù)1∶250的比例加入Skirrow混合抗生素，用于抑制雜菌生長。

1.7.3 小鼠糞便中短鏈脂肪酸的測定

實驗方法參考毛丙永[11]等并略作改動：準(zhǔn)確稱取50 mg糞便置于EP管中，加入500 mL飽和NaCl溶液，浸泡30 min，破碎至無明顯顆粒狀。加入20 μL硫酸酸化，漩渦振蕩30 s，準(zhǔn)確加入800 μL乙醚用于萃取短鏈脂肪酸，漩渦振蕩30 s后14 000 r/min離心15 min。吸取全部上清，向上清中加入0.25 g無水硫酸鈉，14 000 r/min離心15 min，將液相移入進樣瓶中上機分析。

GC-MS采用Rtx-Wax柱，柱長30 m，內(nèi)徑0.25 μm；載氣為He，流速2 mL/min；進樣體積1 μL，分流比10∶1；進樣溫度設(shè)定為240 ℃，按如下程序進行升溫：初始溫度為100 ℃，按7.5 ℃/min升溫至140 ℃，之后按照60 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min，離子化溫度為220 ℃；分析采用全掃描模式，用外標(biāo)法計算乙酸、丙酸、丁酸的濃度(μmol/g)。

1.8數(shù)據(jù)處理及分析

本研究數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值+標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)使用EXCEL 2010及SPSS 20.0進行處理，利用單因素方差分析(ANOVA)兩兩比較中的Tukey s-b法進行顯著性分析，p<0.05則認(rèn)為存在顯著性差異，利用皮爾森相關(guān)系數(shù)法 (Pearson correlation coefficient)進行相關(guān)性分析，利用主成分分析法(Principal component analysis ，PCA)進行多組數(shù)據(jù)主成分分析。

2 結(jié)果

2.1空腸彎曲桿菌的生長曲線

了解C.jejuni的生長曲線有助于獲得更高數(shù)量級、更強活力的菌體，從而用于后續(xù)的感染研究。由圖1可知，C.jejuniNCTC11168可以在BHI培養(yǎng)基中迅速生長，接種后0～18 h為對數(shù)生長期，18 h后進入穩(wěn)定期，42 h后進入衰亡期，菌體量最高可達到2×109CFU/mL。因此選用接種24 h后處于穩(wěn)定期的C.jejuni用于后續(xù)感染實驗，以確保足夠的菌體量以及菌體活力。

圖1 C.jejuni在BHI培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curve of C.jejuni in BHI broth

2.2乳酸菌在體外可抑制C.jejuni的生長

本研究利用牛津杯法測定了8株乳酸菌發(fā)酵上清液(未經(jīng)pH調(diào)整)體外抑制C.jejuni生長的能力，結(jié)果見圖2。可以看出，8株乳酸菌的發(fā)酵上清液均對C.jejuni生長均具有明顯的抑制作用，菌株N29抑菌圈直徑超過13 mm，而其他菌株均超過15 mm。諾氟沙星陽性對照組平板上幾乎未見C.jejuni生長，故未測量抑菌圈直徑。8株乳酸菌的抑菌圈直徑與空白對照組MRS相比，均存在顯著性差異(p<0.05)。而將8株乳酸菌發(fā)酵上清液pH值調(diào)為6.5后，抑菌圈直徑與空白對照組無明顯差異，證明乳酸菌在體外抑制C.jejuni的生長的主要物質(zhì)是代謝產(chǎn)物中的有機酸或pH依賴的抑菌成分。

圖2 乳酸菌發(fā)酵上清液對C.jejuni生長的抑制作用Fig.2 C.jejuni growth was inhibited by cell-free supernatants of Lactobacillus strains

2.3乳酸菌在小鼠體內(nèi)對C.jejuni感染的拮抗作用

2.3.1 乳酸菌降低C.jejuni在小鼠體內(nèi)的定植數(shù)

圖3 小鼠糞便中C.jejuni活菌數(shù)Fig.3 Viable cells of C.jejuniin mice feces

通過對小鼠糞便中C.jejuni活菌進行平板涂布計數(shù)，反映C.jejuni在小鼠體內(nèi)的定植情況。由圖3可知，C.jejuni感染組28天糞便中仍能檢測到超過1.9×105CFU/g 的C.jejuni活菌，說明C.jejuni在3周齡小鼠腸道內(nèi)能夠有效定植。而L.plantarumN8、N9處理組的小鼠糞便中未能檢出C.jejuni活菌，L.plantarumN34、B、Rui處理組小鼠糞便中C.jejuni活菌相比C.jejuni感染組降低了近1個數(shù)量級，L.rhamnosusZX6、ZX7、L.fermentiumN29處理組C.jejuni活菌數(shù)相比C.jejuni感染組無顯著差異(p>0.05)。以上結(jié)果表明L.plantarumN8、N9在模型小鼠體內(nèi)能有效降低C.jejuni的定植率。

2.3.2 小鼠體重變化

從飼養(yǎng)第1天起每周測量各組小鼠體重以觀察體重變化。由表3可以看出，用于實驗的3周齡小鼠初始體重不足10 g，隨實驗進程體重逐步增加。C.jejuni感染以及不同乳酸菌處理并未對小鼠體重變化產(chǎn)生顯著性影響(p>0.05)。

表3 小鼠體重變化

注：各組之間數(shù)據(jù)均無顯著性差異(p>0.05)。

2.4乳酸菌生物學(xué)特性與其體內(nèi)拮抗C.jejuni定植的相關(guān)性

不同乳酸菌菌株具有各自的生理學(xué)特性，其益生功效與菌株自身生物學(xué)特性密切相關(guān)。部分研究表明[12-14]，乳酸菌的生長速率、對細胞的黏附能力以及生物膜形成能力可能對乳酸菌在體內(nèi)的定植起到了重要的影響。而乳酸菌的產(chǎn)酸能力則決定了其在腸道內(nèi)拮抗病原菌的能力[15]。因此本研究進一步探究了以上具有體外拮抗C.jejuni生長能力的乳酸菌在生長速率、產(chǎn)酸能力、生物膜形成能力、黏附能力等方面的差異，并通過主成分分析及相關(guān)性分析確定不同乳酸菌在各生物學(xué)特性方面的表現(xiàn)以及與其體內(nèi)拮抗C.jejuni定植的相關(guān)性。

2.4.1 乳酸菌的生長速率

按照1.6.1所述方法對8株乳酸菌生長速率進行測定。從圖4可以看出，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，除N29外其余7株菌的活菌數(shù)均可超過1×109CFU/mL，其中Rui、ZX7生長速率最快，可超過3×109CFU/mL，N29生長速率最慢，僅為7×108CFU/mL。不同菌株生長速率的種間、種內(nèi)差異均比較明顯(p<0.05)。

圖4 乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中的生長速率Fig.4 Growth rate of Lactobacillus strains in MRS broth

2.4.2 乳酸菌產(chǎn)酸能力

對8株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h的發(fā)酵上清液pH值進行了測定，結(jié)果見表4。N8、N9、N34、B、Rui、ZX6、ZX7均具有較強的產(chǎn)酸能力，發(fā)酵上清液pH在3.80～3.90之間，菌株之間差異不明顯(p>0.05)。而N29產(chǎn)酸能力較弱，發(fā)酵上清液pH僅為4.38。

表4 乳酸菌發(fā)酵上清液pH值

2.4.3 乳酸菌生物膜形成能力

按照1.6.3所述方法測定了8株乳酸菌自身形成生物膜的能力，OD595數(shù)值代表了生物膜形成量。由圖5可知，不同菌株生物膜形成能力差異明顯，其中N9、N34、Rui、N29自身成膜能力較強，N8、B、ZX6成膜能力一般，ZX7幾乎不具備生物膜形成能力。

圖5 乳酸菌自身生物膜形成能力Fig.5 Biofilm formation of Lactobacillus strains

2.4.4 乳酸菌對HT-29細胞的黏附能力

按照1.6.4所述方法評價了8株乳酸菌體外黏附HT-29細胞的能力，結(jié)果如圖6所示。其中N8、N9粘附能力最為出色，B、Rui也具備一定黏附能力，而N34、ZX6、ZX7、N29黏附能力較差。從8株菌的種屬來看，L.plantarum的黏附能力普遍強于L.rhamnosus與L.fermentium且L.plantarum黏附能力的種內(nèi)差異也十分明顯。

圖6 乳酸菌對HT-29細胞的黏附能力Fig.6 Adhesion of Lactobacillus strains to HT-29 cells

2.4.5 主成分分析8株乳酸菌的生物學(xué)特性分布規(guī)律

本研究采用主成分分析法對8株乳酸菌的生物學(xué)特性分布規(guī)律進行了分析，得到第一主成分F1和第二主成分F2，分別包含了原來信息的51.34%和36.55%。第一主成分F1綜合了產(chǎn)酸、生長2個特性，第二主成分F2綜合了生物膜、黏附2個特性，具體見圖7。由圖7可知，L.plantarumN8、N9、N34、B、Rui集中于第一象限附近，距離4種生物學(xué)特性坐標(biāo)點距離較近。這說明5株L.plantarum在4項生物學(xué)特性的評估中均有不錯的表現(xiàn)，N8、N9、Rui尤為突出。而L.rhamnosusZX6、ZX7、L.fermentiumN29距離4種生物學(xué)特性坐標(biāo)點較遠，說明其在生物學(xué)特性的評價中表現(xiàn)較差。此外，同一菌種在圖中分布相對集中，這說明8株乳酸菌的生物學(xué)特性種間差異大于種內(nèi)差異。

圖7 8株乳酸菌生物學(xué)特性PCA分布Fig.7 PCA analysis of characteristics of 8 Lactobacillus strains

2.4.6 皮爾森相關(guān)性系數(shù)法分析

皮爾森相關(guān)系數(shù)法是一種準(zhǔn)確度量2個變量關(guān)系之間密切程度的統(tǒng)計學(xué)方法，其相關(guān)性系數(shù)r值位于-1和1之間[16]。本研究分析了乳酸菌降低C.jejuni在小鼠體內(nèi)定植的能力與8株乳酸菌生長速率、產(chǎn)酸能力、生物膜形成能力、黏附HT-29細胞能力的皮爾森相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表5?？梢钥闯黾S便中C.jejuni活菌數(shù)與乳酸菌的黏附細胞的能力具有極強的負(fù)相關(guān)性，這說明8株乳酸菌中，黏附能力越強的菌株對小鼠體內(nèi)C.jejuni定植的拮抗效果越好。而乳酸菌降低C.jejuni在小鼠體內(nèi)定植的能力與其生長速率、產(chǎn)酸能力、生物膜形成能力等生物學(xué)特性未見有顯著的相關(guān)性。

表5 皮爾森相關(guān)性系數(shù)法分析

2.5具有顯著拮抗C.jejuni定植能力的乳酸菌對小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量的影響

本研究進一步選取在小鼠體內(nèi)拮抗C.jejuni定植能力出色的L.plantarumN8，測定了該處理組小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸的含量，結(jié)果如圖8?？梢奀.jejuni的感染本身并不會明顯影響小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸的含量 (p>0.05)，而L.plantarumN8攝入則可使小鼠糞便中乙酸含量顯著增加(p<0.05)。這說明L.plantarumN8對C.jejuni的清除能力可能與其在腸道內(nèi)的定植及產(chǎn)酸具有密切的聯(lián)系。

圖8 小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸含量Fig.8 Acetic acid , propionic acid , butyric acid in mice feces

3 討論

空腸彎曲桿菌依然是威脅人類腸道健康的主要病原菌之一[17]。近年來，利用大環(huán)內(nèi)脂類或喹諾酮藥物治療C.jejuni感染受到了越來越多的質(zhì)疑[18]。因此，開發(fā)可以替代抗生素有效預(yù)防和治療C.jejuni感染的新方法變得十分重要。乳酸菌作為腸道中的常見菌種，其對病原菌感染的保護作用正逐步引起人們的重視。雖然禽類作為模型用于評價乳酸菌拮抗C.jejuni感染已獲得較為廣泛的應(yīng)用[19-20]，但該模型并不完全適合用于模擬人類感染C.jejuni的病理過程。小鼠感染模型經(jīng)常被用于模擬多種致病菌的感染過程[21-22]，但是成年小鼠由于其成熟的腸道菌群產(chǎn)生“定植抗性”，導(dǎo)致C.jejuni無法有效在小鼠體內(nèi)定植[23]。有研究表明3周齡的斷奶小鼠對C.jejuni更為易感，可使C.jejuni在小鼠體內(nèi)以一定數(shù)量有效定植[24]。本研究中C.jejuni可在3周齡小鼠腸道內(nèi)以超過105數(shù)量級定植且乳酸菌可有效減少腸道中C.jejuni活菌數(shù)，說明該小鼠模型可用于評價乳酸菌在體內(nèi)拮抗C.jejuni定植的能力。然而本研究中C.jejuni的定植尚未對小鼠體重產(chǎn)生明顯影響，這在一定程度上說明該模型尚不足以模擬嚴(yán)重的人體感染C.jejuni的病理狀態(tài)。

本研究使用的8株乳酸菌通過牛津杯抑菌實驗證實其發(fā)酵上清液均可在體外有效抑制C.jejuni的生長，且8株乳酸菌對C.jejuni的體外拮抗能力受發(fā)酵液pH影響顯著，這與金星[25]探究乳酸菌體外抑菌成分的結(jié)果一致，表明乳酸菌體外拮抗C.jejuni能力主要與其產(chǎn)生的有機酸有關(guān)。雖然這些乳酸菌在體外拮抗C.jejuni生長的能力差異并不明顯，但在小鼠感染模型中卻表現(xiàn)出對C.jejuni定植非常明顯的差異。由于體外拮抗實驗僅僅反映了發(fā)酵上清對C.jejuni生長的抑制作用，而體內(nèi)拮抗實驗則會受到乳酸菌在腸道內(nèi)的定植及抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生等一系列因素的影響。因此導(dǎo)致乳酸菌在體內(nèi)具有不同拮抗能力的原因可能與乳酸菌的部分生物學(xué)特性有關(guān)。例如，研究認(rèn)為有機酸是乳酸菌用以拮抗病原微生物的主要物質(zhì)之一[26]；而黏附是乳酸菌與宿主作用的第一步，是其在宿主體內(nèi)發(fā)揮益生功能的基礎(chǔ)[27]；乳酸菌的表面疏水性、自聚集能力和產(chǎn)胞外多糖能力可能影響其自身成膜能力[28]，乳酸菌可在特定環(huán)境下形成生物膜，形成生物膜的乳酸菌具有更強的穩(wěn)定性和抗逆性[29]，有利于其在腸道內(nèi)發(fā)揮益生功效。因此，乳酸菌的生長速率、對細胞的黏附能力以及生物膜形成能力可能對乳酸菌在體內(nèi)的定植起到了重要的影響，而乳酸菌的產(chǎn)酸能力則決定了其在腸道內(nèi)拮抗病原菌的能力。

本研究評估了8株乳酸菌在生長速率、產(chǎn)酸能力、生物膜形成能力、黏附能力等方面的生物學(xué)特性差異。8株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中均可以較快生長，除L.fermentiumN29外，其余菌株培養(yǎng)20 h后均超過109CFU/mL；在產(chǎn)酸能力方面，除L.fermentiumN29的7株乳酸菌均有較強的產(chǎn)酸能力；而8株乳酸菌生物膜形成能力各異，無明顯種間或種內(nèi)差異；對HT-29細胞的黏附能力，8株乳酸菌表現(xiàn)出一定的差異，總體來看植物乳桿菌黏附能力較鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌更強，這與LIN[30]等研究結(jié)論一致。此外，乳酸菌的黏附能力往往也表現(xiàn)出明顯的種內(nèi)差異，本研究中5株植物乳桿菌黏附能力差異明顯，這在趙煜[31]、MORITA[32]等人的研究中也有充分體現(xiàn)。

不同乳酸菌在部分生物學(xué)特性方面表現(xiàn)出一定的差異，主成分分析結(jié)果表明，L.plantarumN8、N9、Rui相較之L.plantarumN34、B，L.rhamnosusZX6、ZX7和L.fermentiumN29具有更為出色的生物學(xué)特性，這與乳酸菌在小鼠模型中對C.jejuni定植率的影響是吻合的。而進一步的皮爾森相關(guān)性分析表明8株乳酸菌在小鼠體內(nèi)拮抗C.jejuni能力與其黏附HT-29細胞能力呈極強正相關(guān)。這說明乳酸菌進入宿主體內(nèi)后能否黏附于腸道上皮并順利增殖以完成定植，決定了乳酸菌對致病菌的拮抗效果。而對小鼠糞便中短鏈脂肪酸的分析表明，具有很好細胞黏附能力的L.plantarumN8會使小鼠腸道中乙酸含量增加，這表明該菌在攝入后的定植及產(chǎn)酸能夠顯著拮抗C.jejuni在小鼠腸道內(nèi)的定植。

綜上所述，8株乳酸菌中L.plantarumN8、N9能夠有效降低小鼠腸道中C.jejuni活菌數(shù)，其作為益生菌用于拮抗C.jejuni感染具有潛在的應(yīng)用價值。相關(guān)性分析表明，8株乳酸菌的黏附能力與其在體內(nèi)拮抗C.jejuni定植能力呈強正相關(guān)，該結(jié)果為今后具有拮抗致病菌能力的益生菌的篩選提供了理論依據(jù)。

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AnalysisonbiologicalcharacteristicsoflacticacidbacteriaanditsantagonisticactivityagainstCampylobacterjejunicolonizationinmice

WANG Gang1*, HE Yu-feng1, CHEN Xiao-hua2,ZHAO Jian-xin1, ZHANG Hao1, CHEN Wei1

1(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(College of Life Science and Environment, Hengyang Normal University, Hengyang 421008, China)

In this study, 3-week-old C57BL / 6 mice were used to establish a infection model byCampylobacterjejuni. 8 strains of lactic acid bacteria capable of inhibiting the growth ofCampylobacterjejuniin vitro were engaged to estimate the antagonistic activity againstCampylobacterjejunicolonizationinvivo. Meanwhile, the biological characteristics such as the growth rate, acid production ability, biofilm formation ability and adhesion ability of the 8 strains were also measured. It was found that the differences of biological characteristics inter-species of 8 strains were greater than that of biological characteristics intra-species.Furthermore, the ability of lactic acid bacteria to antagonizeCampylobacterjejunicolonization in mice was positively correlated with the adhesion ability of bacteria.LactobacillusplantarumN8 and N9 with the highest adhesion index could effectively removeCampylobacterjejuniin the intestine of model mice. These two strains have the potential application value to prevent the human body fromCampylobacterjejuniinfection. This study also provides a theoretical basis for the screening of probiotics with antagonistic ability against pathogens.

lactic acid bacteria;Campylobacterjejuni; antagonistic activity; adhesion ability; mice infection model

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014093

博士，副教授(本文通訊作者，E-mail：wanggang@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金-青年科學(xué)基金項目(31601444，31301407)

2017-02-20，改回日期：2017-03-09