薛寧，李智祥，戰(zhàn)俊杰，趙磊，梁云龍，馮甲，劉濤，徐慶陽(yáng), 2, 3，張成林, 2, 3，陳寧, 2, 3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457) 3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

敲除aceA和gogat及過(guò)表達(dá)gltA對(duì)谷氨酸棒狀桿菌GKGD合成α-酮戊二酸的影響

薛寧1，李智祥1，戰(zhàn)俊杰1，趙磊1，梁云龍1，馮甲1，劉濤1，徐慶陽(yáng)1, 2, 3，張成林1, 2, 3，陳寧1, 2, 3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457) 3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)在生命活動(dòng)中具有重要的作用，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。以α-KG生產(chǎn)菌谷氨酸棒狀桿菌GKGD為出發(fā)菌株，敲除其異檸檬酸裂解酶編碼基因aceA以增加異檸檬酸供應(yīng)，獲得GKGD-1，搖瓶發(fā)酵條件下其α-KG產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高14.72%和9.76%；敲除谷氨酸合酶編碼基因gogat以降低L-谷氨酸生成量，獲得GKGD-2，其α-KG產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高7.39%和5.43%，L-谷氨酸生成量降低52.87%；過(guò)表達(dá)檸檬酸合酶編碼基因gltA以進(jìn)一步增加前體物供應(yīng)，獲得GKGD-3，其α-KG產(chǎn)量提高35.9%；于7.5 L發(fā)酵罐經(jīng)30 h發(fā)酵，GKGD-3 α-KG產(chǎn)量達(dá)49.5 g/L，較出發(fā)菌株提高36.4%，L-谷氨酸生成量降低50%。敲除aceA和gogat并過(guò)表達(dá)gltA可顯著提高α-KG產(chǎn)量并降低L-谷氨酸生成量。

α-酮戊二酸；L-谷氨酸；谷氨酸合酶；異檸檬酸裂解酶；檸檬酸合酶

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)是TCA循環(huán)中的重要中間產(chǎn)物，參與氨基酸、維生素、有機(jī)酸及能量代謝[1-2]，被廣泛應(yīng)用于化工、食品、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域[3-6]。目前主要采用化學(xué)法生產(chǎn)α-KG，但因收率低、氰化物污染等問(wèn)題制約了其在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域的應(yīng)用[7]。發(fā)酵法生產(chǎn)α-KG因具有成本低、收率高、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)而被認(rèn)為具有很大的工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。

發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸最早始于LOCKWOOD和STODOLA對(duì)利用熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)生物合成α-酮戊二酸的研究[7-9]。自20世紀(jì)70年代，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)等酵母菌亦能過(guò)量合成α-酮戊二酸[10-15]。然而利用酵母合成α-KG周期較長(zhǎng)(大于120 h)[10-15]。谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)具有過(guò)量合成L-谷氨酸的能力，而L-谷氨酸主要來(lái)源于α-KG的氨基化，因此被認(rèn)為是具有α-KG生產(chǎn)潛力的微生物[16-17]。在前期研究中，我們以L-谷氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicumGDK-9為出發(fā)菌株經(jīng)代謝工程改造獲得的C.glutamicumGKGD α-KG產(chǎn)量達(dá)到45.6 g/L[18]。

圖1 谷氨酸棒桿菌α-KG合成途徑及本研究改造策略Fig.1 α-KG synthesis pathway in C.glutamicum and strategy for strain genetic modification in this study

如圖1所示，在谷氨酸棒狀桿菌中，葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸并被催化生成草酰乙酸和乙酰-CoA，二者經(jīng)檸檬酸合酶催化生成檸檬酸，后者經(jīng)催化生成異檸檬酸，進(jìn)而經(jīng)異檸檬酸脫氫酶催化合成α-KG[19]。同時(shí)，異檸檬酸可經(jīng)異檸檬酸裂解酶催化生成乙醛酸和琥珀酸。α-KG主要存在3條代謝途徑：(1) 經(jīng)α-酮戊二酸脫氫酶氧化為琥珀酸；(2) 經(jīng)谷氨酸脫氫酶氨基化為L(zhǎng)-谷氨酸；(3) 經(jīng)谷氨酸合酶催化生成L-谷氨酸。在GKGD中，途徑(1)被弱化，途徑(2)被阻斷[18-19]。因此，本研究以GKGD為出發(fā)菌株擬采用阻斷乙醛酸循環(huán)和谷氨酸合成途徑并增強(qiáng)檸檬酸合成代謝流策略通過(guò)敲除異檸檬酸裂解酶編碼基因aceA和谷氨酸合酶編碼基因gogat并過(guò)表達(dá)檸檬酸合酶編碼基因gltA以期增加α-KG的合成(圖1)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

本研究所用菌株及質(zhì)粒如表1所示。

表1 菌株及質(zhì)粒

1.1.2 引物

參考NCBI中C.glutamicumATCC13032aceA和gltA及gogat序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表2)。

表2 引物

1.1.3 培養(yǎng)基

利用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌，必要時(shí)添加卡那霉素(50 μg/mL)或氯霉素(30 μg/mL)。

搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖 25 g/L，K2HPO4·3H2O 2.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.9 g/L，尿素3.5 g/L，玉米漿 40 mL/L，豆粕水解液 15 mL/L， pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 80 g/L， MgSO4·7H2O 1.8 g/L，Na2HPO42.8 g/L，KCl 1.3 g/L，VB10.23 mg/L，MgSO4·7H2O 2.3 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.3 mg/L，玉米漿 1 mL/L，豆粕水解液 15 mL/L，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，玉米漿35 mL/L，豆粕水解液20 mL/L，K2HPO4·3H2O 2.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.9 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，Na2HPO43 g/L，KCl 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO4·7H2O 5 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，ZnSO45 mg/L，VB10.4 mg/L，玉米漿 3 mL/L，豆粕水解液20 mL/L，必要時(shí)加入谷氨酸鈉 2 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.4 試劑

限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、ExTaq DNA 聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒，北京博邁德生物技術(shù)有限公司；異檸檬酸裂解酶試劑盒、檸檬酸合酶試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；α-KG：分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2儀器與設(shè)備

生物傳感儀(SBA-40C)，山東省科學(xué)院生物研究所；高效液相色譜儀(Agilent 1100)，美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 用于aceA和gogat敲除及gltA基因過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以GKGD基因組為模板利用引物aceA-1和aceA-2及aceA-3和aceA-4獲得aceA基因上下游同源片段，并以其為模板利用引物aceA-1和aceA-4獲得重組片段?；厥蘸蠼?jīng)EcoR I和SalI雙酶切、電泳、回收并連接pK18mobsacB后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中。經(jīng)篩選后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，將重組質(zhì)粒命名為pK18mobsacB△aceA。同理獲得用于gogat敲除的重組質(zhì)粒pK18mobsacB△gogat。

以GKGD基因組DNA為模板利用引物gltA-1和gltA-2擴(kuò)增獲得gltA片段，回收后經(jīng)HindI和EcoRI酶切、回收并連接pXMJ19后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中。經(jīng)篩選后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，將重組質(zhì)粒命名為pX-gltA。

1.3.2 重組菌株GKGD-1、GKGD-2和GKGD-3的構(gòu)建

取適宜濃度的pK18mobsacB△aceA電轉(zhuǎn)化至GKGD感受態(tài)細(xì)胞(2.5 kV，25 μF，200 Ω，1 mm電擊杯)[22]。將電轉(zhuǎn)后的菌液涂布于含卡那霉素的LB平板上，32 ℃倒置培養(yǎng)36 h后，挑取單菌落活化后提取其基因組DNA并進(jìn)行PCR鑒定。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在10%蔗糖的LB搖管中反復(fù)傳代后，篩選在LB平板上生長(zhǎng)、在含卡那霉素平板上不生長(zhǎng)的單菌落，提取其基因組DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得aceA基因缺失菌株GKGD-1。采用相同方法獲得gogat敲除菌株GKGD-2。

提取質(zhì)粒pXMJ19及pX-gltA電轉(zhuǎn)化至GKGD-2、將pXMJ19電轉(zhuǎn)化至GKGD，經(jīng)活化后涂布于含氯霉素平板進(jìn)行篩選，挑選單菌落并提取質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證，分別獲得GKGDpX、GKGD-3和GKGDpM。

1.3.3 酶活性測(cè)定

收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的菌體，分別按異檸檬酸裂解酶試劑盒和檸檬酸合酶試劑盒說(shuō)明書處理菌體并測(cè)定異檸檬酸裂解酶和檸檬酸合酶活性。

1.3.4 搖瓶發(fā)酵

將種子培養(yǎng)物按10%的接種量接種至含30 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板瓶中，于34℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)，維持pH 7.0～7.2。GKGDpM、GKGDpX和GKGD-3 生長(zhǎng)至OD600=0.6～0.8時(shí)添加0.2 mmol/L的IPTG。

1.3.5 發(fā)酵罐發(fā)酵

以15%接種量將種子培養(yǎng)物接至含4.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的7.5 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度為34℃；通氣量為2～5 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速200～1 000 r/min；分階段控制溶氧：發(fā)酵初期維持30%，穩(wěn)定期維持50%～60%，發(fā)酵后期維持40%。待細(xì)胞轉(zhuǎn)型后，以25% NaOH調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2；根據(jù)需要流加泡敵消泡。發(fā)酵過(guò)程中，流加80%～90%的葡萄糖溶液，維持殘?zhí)?%～2%。

1.3.6 葡萄糖、L-谷氨酸和α-KG含量測(cè)定及數(shù)據(jù)分析

采用SBA-40C生物傳感儀測(cè)定葡萄糖和L-谷氨酸濃度。

采用Agilent 1100高效液相色譜儀測(cè)定α-KG濃度。色譜柱 Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm，L×I.D.)；流動(dòng)相 0.005 mol/L H2SO4；柱溫 30℃；流速 0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 215 nm。

根據(jù)公式 DCW= 0.244 5×OD600-0.012 6計(jì)算菌體干重(dry cell weight，DCW)。

1.4數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行并重復(fù)3次，利用Origin 8.0和SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。

2 結(jié)果與討論

2.1異檸檬酸裂解酶編碼基因aceA敲除對(duì)α-KG合成的影響

異檸檬酸經(jīng)異檸檬酸裂解酶催化生成乙醛酸和琥珀酸[19]，從而減弱α-KG合成代謝流，故認(rèn)為阻斷該途徑可為α-KG提供更多的前體物異檸檬酸。將重組質(zhì)粒pK18mobsacB△aceA轉(zhuǎn)化至GKGD后經(jīng)篩選，挑選重組子利用引物aceA-1和aceA-4對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，獲得堿基數(shù)約為2 000 bp和1 200 bp的片段，與理論值2 104 bp和1 240 bp一致(圖2)，表明pK18mobsacB△aceA成功整合至GKGD基因組。利用引物aceA-1和aceA-4對(duì)第二次重組的重組子進(jìn)行PCR鑒定，獲得堿基數(shù)約為1 200 bp的片段，與理論值1 240 bp一致，表明aceA被成功敲除，命名為GKGD-1。

M-DNA marker；1-以第1次重組的菌株基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；2-以第2次重組的菌株(即GKGD-1)基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；3-以GKGD基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜圖2 aceA基因敲除株GKGD-1的PCR鑒定圖譜Fig．2 Map for identification of aceA-knockout strain GKGD-1

分別收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的GKGD 和GKGD-1菌體細(xì)胞測(cè)定其異檸檬酸裂解酶活性，結(jié)果表明，GKGD-1未檢測(cè)到異檸檬酸裂解酶活性，進(jìn)一步說(shuō)明aceA被成功敲除(表3)。

表3 各菌株異檸檬酸裂解酶和檸檬酸合酶活性

注：*未檢測(cè)到; **：未檢測(cè)。

利用GKGD-1進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以測(cè)定aceA敲除對(duì)其α-KG合成的影響。結(jié)果如表4所示，GKGD-1的α-KG產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別為12.86 g/L和8.66%，較出發(fā)菌株GKGD分別提高14.72%和9.76%，而其生物量未見明顯變化。

表4 各菌株搖瓶發(fā)酵參數(shù)

2.2谷氨酸合酶編碼基因gogat敲除對(duì)α-KG合成的影響

1分子α-KG和谷氨酰胺經(jīng)谷氨酸合酶催化生成2分子L-谷氨酸[19]，故推測(cè)阻斷該途徑可增強(qiáng)α-KG的積累并減少副產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸的合成。將重組質(zhì)粒pK18mobsacB△gogat轉(zhuǎn)化至GKGD-1后經(jīng)篩選，挑選重組子利用引物gogat-1和gogat-4對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，獲得堿基數(shù)約為4 000 bp 和1 000 bp的片段，與理論值4 328 bp和1 184 bp一致(圖3)，表明pK18mobsacB△gogat成功整合至GKGD-1基因組。利用引物gogat-1和gogat-4對(duì)第二次重組的重組子進(jìn)行PCR鑒定，獲得堿基數(shù)約為1 000 bp的片段，與理論值1 184 bp一致，表明gogat被成功敲除，命名為GKGD-2。

利用GKGD-2進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以測(cè)定gogat敲除對(duì)其α-KG合成的影響。結(jié)果如表4所示，GKGD-2的α-KG產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別為13.81 g/L和9.13%，較出發(fā)菌株GKGD-1分別提高7.39%和5.43%，較GKGD分別提高21.19%和15.72%，其L-谷氨酸積累量為1.15 g/L，較GKGD-1降低52.87%，而其生物量未見明顯變化。由此可見，阻斷谷氨酸合酶途徑可顯著增強(qiáng)α-KG的積累并減少副產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸的合成。

2.3過(guò)表達(dá)檸檬酸合酶編碼基因gltA對(duì)α-KG合成的影響

檸檬酸合酶催化檸檬酸合成，是TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶[19]。以GKGD基因組為模板利用引物gltA-1和gltA-2擴(kuò)增獲得檸檬酸合酶編碼基因gltA片段(圖3A)，將其克隆并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。將篩選獲得的轉(zhuǎn)化子活化后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定。質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得堿基數(shù)為約1 300 bp的片段與理論值1 314 bp一致；質(zhì)粒經(jīng)單、雙酶切分別獲得堿基數(shù)約為8 000 bp及7 000 bp和1 300 bp的片段，與理論值7 915 bp及6 601 bp和1 314 bp一致(圖4A)，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pX-gltA。將重組質(zhì)粒pX-gltA轉(zhuǎn)化至GKGD-2，篩選獲得的轉(zhuǎn)化子活化后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定，獲得片段的堿基數(shù)與理論值一致(圖4B)，表明菌株構(gòu)建成功，命名為GKGD-3。分別收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的GKGD 和GKGD-3菌體細(xì)胞測(cè)定其檸檬酸合酶活性，發(fā)現(xiàn)GKGD-3的檸檬酸合酶活性較GKGD提高112.9%，由此可見，過(guò)表達(dá)gltA可有效提高檸檬酸合酶活性(表3)。

M-DNA marker；1-以第1次重組的菌株基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；2-以第2次重組的菌株(即GKGD-2)基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；3-以GKGD-1基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜圖3 gogat基因敲除株GKGD-2的PCR鑒定圖譜Fig．3 Map for identification of gogat-knockout strain GKGD-2

A:pX-gltA的PCR及酶切鑒定圖譜M-marker；1-以GKGD基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；2-以重組質(zhì)粒pX-gltA為模板PCR產(chǎn)物電泳圖譜；3-重組質(zhì)粒pX-gltA單酶切產(chǎn)物電泳圖譜； 4-重組質(zhì)粒pX-gltA雙酶切產(chǎn)物電泳圖譜 B:從GKGD-3提取質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定圖譜 M-marker；1-以從GKGD-3提取質(zhì)粒的重組質(zhì)粒pX-gltA為模板PCR產(chǎn)物電泳圖譜；2-從GKGD-3提取質(zhì)粒的重組質(zhì)粒pX-gltA的單酶切產(chǎn)物電泳圖譜；3-從GKGD-3提取質(zhì)粒的重組質(zhì)粒pX-gltA的雙酶切產(chǎn)物電泳圖譜圖4 gltA基因過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒pX-gltA及菌株GKGD-3 PCR鑒定圖譜Fig．4 Map for identification of pX-gltA and GKGD-3

利用GKGD-3進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以測(cè)定過(guò)表達(dá)檸檬酸合酶對(duì)其α-KG合成的影響。結(jié)果如表4所示，GKGD-3的α-KG產(chǎn)量為14.27 g/L，分別較對(duì)照菌株GKGDpX和GKGDpM提高14.16%和35.9%。值得注意的是，與GKGD-2相比GKGD-3 α-KG產(chǎn)量提高不顯著，但其單位菌體產(chǎn)量提高18.01%。其原因可能是質(zhì)粒造成菌體生長(zhǎng)和代謝負(fù)擔(dān)致使生物量下降12.4%。因此在后續(xù)研究中可采用基因整合的方式將gltA啟動(dòng)子替換為強(qiáng)啟子(如Ptuf等)以增強(qiáng)gltA的表達(dá)量同時(shí)不影響菌體生物量。

2.4發(fā)酵罐條件下GKGD-3的發(fā)酵特性

利用重組菌株GKGD-3于7.5 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以GKGD和GKGDpM為對(duì)照，結(jié)果如表5和圖5所示。經(jīng)30 h發(fā)酵，GKGD-3 α-KG產(chǎn)量達(dá)到49.5 g/L，分別較對(duì)照菌株GKGDpM和GKGD提高36.4 %和9.8%；其單位菌體產(chǎn)量為3.9 g/g，分別較GKGDpM和GKGD提高39.3%和50.0%；L-谷氨酸積累量分別降低60.8%和50.0%；其轉(zhuǎn)化率分別提高8.8%和4.5%。

表5 菌株于7.5 L發(fā)酵罐條件下的發(fā)酵參數(shù)

圖5 菌株發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.5 Fermentation process curve of strains方形和圓形分別代表生物量和α-KG產(chǎn)量；黑色實(shí)心為GKGD；灰色實(shí)心為GKGDpM；空心為GKGD-3

3 結(jié)論

本研究以α-KG生產(chǎn)菌GKGD為出發(fā)菌株，采用增強(qiáng)檸檬酸合成代謝流、阻斷乙醛酸循環(huán)及谷氨酸合成途徑策略通過(guò)敲除異檸檬酸裂解酶編碼基因aceA和谷氨酸酶編碼基因gogat并過(guò)表達(dá)檸檬酸合酶編碼基因gltA使得α-KG產(chǎn)量分別于搖瓶條件和7.5 L發(fā)酵罐條件下提高35.9%和36.4%，使得L-谷氨酸生成量分別降低28.8%和50%。由此可見，敲除aceA和gogat并過(guò)表達(dá)gltA可顯著提高α-KG產(chǎn)量并降低L-谷氨酸生成量。

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EffectofaceAandgogatknockoutcombinedgltAoverexpressioninGKGDonα-ketoglutarateproduction

XUE Ning1, LI Zhi-xiang1, ZHAN Jun-jie1, Zhao Lei1, LIANG Yun-long1,FENG Jia1, LIU Tao1, XU Qing-yang1, 2, 3, ZHANG Cheng-lin1, 2, 3, CHEN Ning1, 2, 3*

1 (Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457， China) 2 (National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China) 3 (Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture, Tianjin 300457, China)

α-Ketoglutarate (α-KG) plays an important role in life activities and has been widely applied in food and medicine. Isocitrate lyase encoding geneaceAwas knocked out to improve isocitrate supply and obtain GKGD-1, by which the α-KG production and yield was increased by 14.72% and 9.76%. In order, glutamate synthase encodinggenegogat was knocked out to reduceL-glutamate accumulation and thus obtain GKGD-2, by which the α-KG production and yield was increased by 7.39% and 5.43% andL-glutamate was decreased by 52.87%. Citrate synthase encoding genegltAwas overexpressed to further increase precursor supply and thus obtain GKGD-3, by which α-KG production was increased by 35.9%. Fermentation assay was performed in 7.5-L fermentor with GKGD-3, α-KG production achieve 49.5 g/L (increased by 36.4%) andL-glutamate accumulation was decreased by 50%. In summary,aceAandgogatknockout combined withgltAoverexpression in GKGD remarkably improved α-ketoglutarate production.

α-ketoglutarate;L-glutamate; glutamate synthase; lsocitrate lyase; citrate synthase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014419

博士研究生(陳寧教授為通訊作者,E-mail:ningch@tust.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31300069)；天津科技大學(xué)青年教師創(chuàng)新基金(2016LG07)；天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(12ZCZDSY01900)；天津市科委科技特派員項(xiàng)目(15JCTPJC62800)；天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201710057039、201510057063)

2017-03-30，改回日期：2017-04-20