母潤紅 馬 方 劉永超 王湘茗

(北華大學基礎醫(yī)學院，吉林132011)

特異性干擾survivin基因表達對人舌癌Tca8113細胞體外增殖和侵襲性的影響①

母潤紅 馬 方 劉永超 王湘茗

(北華大學基礎醫(yī)學院，吉林132011)

目的：探討應用RNAi技術特異性沉默survivin基因表達對人舌癌細胞Tca8113增殖、凋亡、遷移的影響，闡明survivin在Tca8113細胞生物學行為中的作用。方法：取對數生長期的Tca8113細胞，分為干擾組、陰性對照組及空白對照組。采用RT-PCR和Western blot方法檢測Tca8113細胞中survivin基因的mRNA及蛋白的表達水平；MTT法檢測細胞的增殖狀況；流式細胞術檢測各組Tca8113細胞凋亡率；劃痕實驗檢測Tca8113細胞的遷移狀況。結果：RT-PCR 顯示舌癌Tca8113細胞中survivin 的mRNA表達水平明顯低于空白對照組 (P<0.05)，Western blot 蛋白免疫印跡結果顯示，與空白對照組比較，survivin蛋白表達水平減少(P<0.05)。survivin干擾組Tca8113細胞的增殖能力降低(P<0.05)；細胞劃痕實驗發(fā)現轉染Tca8113細胞48 h 后干擾組細胞的遷移距離明顯短于空白對照組(P<0.05)。結論：特異性沉默siRNA-survivin的表達可有效抑制舌癌Tca8113細胞的體外遷移能力，可能與survivin表達減少有關，有望成為口腔舌癌生物治療的潛在靶點。

survivin;siRNA;增殖;凋亡;遷移

鱗狀細胞舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，其特點是局部浸潤生長及易發(fā)生頸部淋巴結轉移。發(fā)生淋巴結轉移患者的預后較差，頸淋巴結轉移是導致舌鱗癌患者死亡的重要因素之一[1]。survivin基因是凋亡抑制蛋白家族(Apoptosis inhibitor protein，AIP)成員中分子量最小的一個，是迄今為止發(fā)現的最強凋亡抑制因子[2]。survivin在胚胎組織中及大多數的腫瘤組織中特異性表達，而在正常組織中低表達或不表達。survivin的高表達與腫瘤的復發(fā)、淋巴浸潤及轉移相關，常與患者的預后不良以及對化學治療不敏感有關[3]。近年研究發(fā)現survivin基因與舌癌發(fā)生發(fā)展密切[4]。但其內在機制尚不清楚。本研究中，我們通過RNAi的方法，特異性干擾人舌癌細胞株Tca8113細胞中survivin基因的表達[5,6]，探討survivin基因在人舌癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用，尋找抑制舌癌增殖、侵襲和轉移新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑盒儀器 人舌癌細胞株Tca8113惠贈于北華大學藥學院李賀副教授。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，小牛血清購于杭州四季青公司；轉染試劑購于北京普利萊基因技術有限公司；Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；mRNA反轉錄試劑盒與PCR反應Mix混合物購于TaKaRa公司；兔抗人survivin、GAPDH多克隆抗體購于武漢博士德公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購于美國Sigma公司；ECL化學發(fā)光試劑盒、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒購于江蘇省海門市碧云天生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) Tca8113細胞于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每2 d傳代1次，取對數生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2siRNA的選取 根據GenBank中人類survivin的mRNA序列(NM_001168.2;NM_001012270.1;NM_001012271.1;XR_243654.2)，并參閱文獻[6]，確定靶向人survivin基因的特異性siRNA序列(名稱及靶向序列見表1),含非靶向性錯義RNA(Scramble RNA,SCR)作為陰性對照。本實驗還采用了熒光Financial Analyst Meeting (FAM)標記的無靶向siRNA用于測定siRNA的細胞轉染效率。以上siRNA均交由上海吉瑪公司進行化學合成。

1.2.3細胞分組和轉染 轉染前一天，取對數生長期的Tca8113細胞，按照每孔5×105個細胞接種于6孔板中，待細胞鋪滿80%孔底面積后進行轉染。轉染前6 h將孔中培養(yǎng)基置換為無血清培養(yǎng)基，轉染按照HifectinⅡ真核轉染試劑提供的說明書進行。將細胞分為干擾組(轉染siRNA-survivin)、對照組(轉染SCR)及空白組(未處理)，siRNA-survivin及SCR的終濃度均為100 nmol/L。轉染后各組均置于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 h，換成含10%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并且在熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光的表達情況，轉染效率=熒光陽性細胞數/篩選細胞總數×100%。

表1人survivin基因特異性干擾序列

Tab.1Specificinterferingsequencesofhuman-survivinGeneTargetsequence

NameStandSequence(5'-3')siRNA-surSensestrandGGCUGGCUUCAUCCACUGCTTAntisensestrandGCAGUGGAUGAAGCCAGCCTTSCRSensestrandCAGUCGCGUUUGCGACUGGTTAntisensestrandCCAGUCGCAAACGCGACUGTT

1.2.4RT-PCR檢測Tca8113細胞中survivin mRNA的相對表達水平和沉默效率 細胞轉染后48 h用TRIzol試劑提取各實驗組Tca8113細胞總RNA，隨后將所得RNA應用TaKaRa逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA。以cDNA產物為模版，配置10 μl體系進行RCR擴增，檢測survivin基因表達情況。PCR反應條件為：94℃預變性5 min， 94℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min 35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。survivin引物為：上游引物，5′-AACAGCCGAGATGACCTCC-3′；下游引物， 5′-AACTTCAGGTGGATGAGGAGAC-3′，產物大小為421 bp。內參基因GAPDH引物序列為：上游引物,5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游引物，5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′，產物大小為983 bp。PCR產物取經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外成像儀中應用Tanon2500 Gel Imaging system 軟件獲取圖像，以survivin/GADPH的灰度比值進行半定量分析。

1.2.5Western blot法檢測各組Tca8113細胞中survivin蛋白的相對表達水平和沉默效率 細胞轉染后48 h，按照試劑盒說明書裂解各組Tca8113細胞并提取總蛋白。使用二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量法檢測總蛋白濃度。取等量的各組細胞總蛋白(50 μg)應用5%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行蛋白電泳分離，隨后轉印至硝酸纖維膜(PVDF)上，5%脫脂奶封閉1 h，用TBS洗膜，加入兔抗人survivin單克隆抗體(稀釋濃度1∶200)或兔抗人GADPH單克隆抗體(稀釋濃度1∶500)，4℃過夜。TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(稀釋濃度1∶2 000)，室溫孵育1 h。最后加入ECL顯示液，反應3 min，入暗室曝光45 s，顯影定影后掃描分析。結果采用Quantity One?software version 4.6.2圖像分析軟件進行灰度值分析，各組蛋白條帶灰度值均以對應的內參照GADPH為基準進行校正，計算相對灰度值。

1.2.6MTT法檢測細胞的增殖 收集對數生長期的Tca8113細胞接種于96孔板中，每孔細胞數3×103個，體積為100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行分組及細胞內轉染，每組6個復孔。分別于轉染后24、48、72 h時終止培養(yǎng)，每孔加入MTT (5 mg/ml) 20 μl，繼續(xù)培育4 h，棄上清 ，每孔加入DMSO 100 μl，振蕩10 min，使結晶充分溶解 ，在全自動酶標儀上測各孔490 nm波長處的吸光度。

1.2.7流式細胞術檢測細胞凋亡率 細胞轉染24 h后用胰酶消化細胞，每組細胞用PBS洗滌2次后再各用500 μl Binding buffer制備成細胞懸液，每組加入5 μl的Annexin V-FITC 和5 μl碘化丙啶(PI)染液，室溫避光孵育10 min后在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。結果應用winMDI 2.9分析軟件進行分析。

1.2.8細胞劃痕實驗 胰酶消化各組細胞，加入DMEM培養(yǎng)基，并將細胞濃度調至1×106個/ml，將各細胞懸液分別接種至6孔板各孔內，待細胞融合度達到80%左右時，按照以上所提及方法進行細胞分組及轉染。轉染24 h后棄瓶內培養(yǎng)基，以1 ml 槍頭在孔內劃線，PBS洗滌貼壁細胞2次，之后加1 ml無血清DMEM 培養(yǎng)基，24 h后在顯微鏡下拍攝劃線區(qū)域細胞生長狀態(tài)，測量腫瘤細胞的遷移距離，每孔測量5次。

2 結果

2.1siRNA的轉染效率鑒定 Tca8113細胞轉染6 h后，用PBS緩沖液沖洗3次，在熒光顯微鏡下觀察siRNA轉染效果。如圖1所示熒光主要集中在細胞質中，熒光轉染細胞有明顯的細胞輪廓，與背景反差明顯。經計數，熒光標記siRNA轉染效率大于70%,可以進行后續(xù)的實驗。

2.2siRNA的干擾效果檢測 RT-PCR 檢測結果顯示(圖2)，轉染48 h后各組細胞均有亮度相似的GADPH基因條帶表達，各組survivin/GADPH比值代表survivin基因的mRNA表達水平。干擾組的survivin基因mRNA表達水平(0.419 2±0.0174 6)較空白對照組(0.788 3±0.055 79)明顯降低(P<0.05)，陰性對照組(0.771 8±0.039 59)和與空白對照組比較無顯著差異(P>0.05)。Western檢測結果顯示(圖3)：干擾組survivin蛋白條帶明顯變細,與空白對照組(0.680 8±0.053 56)比較，干擾組(0.223 5±0.021 91)Tca8113細胞中survivin蛋白的相對表達水平顯著降低(P<0.05)，陰性對照組(0.636 6±0.074 03)與空白對照組相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 熒光標記siRNA轉染Tca8113細胞6 h后綠色熒光表達(×200)Fig.1 Expression of green fluorescence in Tca8113 cells 6 h post-transfection (×200)

2.3siRNA 對Tca8113增殖的影響 MTT法檢測的細胞吸光度值表明，與空白組相比較，轉染后24、48、72 h實驗組Tca8113細胞的增殖均受到明顯抑制(P<0.05)，生長曲線低平，而在以上三個時間點對照組與空白組相比較細胞的增殖無明顯差別(P>0.05),見表2、圖4。

2.4siRNA對細胞凋亡的影響 應用流式細胞術檢測Tca8113細胞的早期凋亡，結果顯示轉染48 h后，siRNA-survivin轉染組細胞的凋亡率為(25.21±1.197)%，明顯高于空白對照組(9.783±0.762 2)%及陰性對照組(9.643±0.437)%(F=109,P<0.000 1，圖5)。

圖2 細胞內轉染48 h后Tca8113細胞survivin的mRNA表達Fig.2 Expressions of survivin mRNA 48 h in Tca8113 cells after transfection detected with RT-PCRNote: A.Interference group;B.Negative control group;C.Blank control group.*.P<0.05.

圖3 細胞內轉染48 h后Tca8113細胞survivin蛋白的干擾效果Fig.3 Expressions of survivin protein 48 h in Tca8113 cells after transfection detected with Western blotNote: A.Interference group;B.Negative control group;C.Blank control group.*.P<0.05.

Groups24hODvalue48hODvalue72hODvalueInterferinggroup0.4182±0.044300.5793±0.033991.349±0.1565Negativegroup0.9341±0.052531.278±0.069012.004±0.09502Controlgroup0.8676±0.041411.241±0.084031.928±0.07789

圖4 細胞內轉染后各時段Tca8113細胞的增殖狀況(24、48、72 h)Fig.4 Tca8113 cell proliferation detected with MTT(24，48，72 h)Note: A.Interference group;B.Negative control group;C.Blank control group.

2.5劃痕實驗結果 24 h之后空白對照組，陰性對照組和干擾組的細胞遷移距離分別為：(464.0+15.04)μmol/L 、(497.7+27.57)μmol/L和(245.7+16.90)μmol/L.其中干擾組與空白對照組相比較具有顯著性差異(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組無明顯差異(P>0.05，圖6)。

3 討論

我國口腔頜面部鱗癌發(fā)病率逐漸增高，且呈年輕化趨勢[1]。舌癌因其特殊的解剖特點極易發(fā)生遠處的侵襲和淋巴結轉移，其侵襲轉移機制目前并不完全清楚。Altieri等[7，8]指出survivin是迄今為止發(fā)現的最強的凋亡抑制因子，是一種哺乳類動物體內凋亡抑制蛋白家族的新成員。其表達具有相對特異性，在大多數正常組織不表達，僅在胚胎和腫瘤細胞上表達。研究發(fā)現survivin在胃癌組織中表達水平高低與其侵襲性及預后有關。阻斷腫瘤細胞中survivin基因的表達，抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，提高腫瘤細胞對放化療藥物的敏感性，因此抑制survivin的表達成為腫瘤治療的一個理想靶點[9,10]。

圖5 細胞內轉染48 h后Tca8113細胞的凋亡狀況Fig.5 Apoptotic rate of Tca8113 cell detected with flow cytometryNote: A.Interference group;B.Negative control group;C.Blank control group.1.Blank group;2.Control group;3.Experiment group.

圖6 光學顯微鏡下觀察劃痕實驗中Tca8113細胞的遷移距離Fig.6 Scape of Tca8113 cells in wound healing experim-ent observed under microscopeNote: A.Interference group;B.Negative control group;C.Blank control group.

本實驗通過RT-PCR的方法對siRNA-survivin的轉染效果進行了驗證，結果顯示轉染48 h后轉染組的survivin表達量較對照組及空白組均明顯下降，初步提示RNA干擾survivin表達成功，為后續(xù)試驗的有效性和真實性提供依據。Western檢測，干擾組survivin Tca8113細胞蛋白的表達水平顯著降低。說明在蛋白水平上可以抑制Tca8113細胞survivin的表達。流式細胞術檢測Tca8113細胞siRNA-survivin轉染組細胞的凋亡率為，明顯高于空白對照組及陰性對照組。細胞劃痕實驗同時證實干擾siRNA-survivin表達后口腔舌癌Tca8113細胞遷移能力明顯受到抑制。

綜上，本研究發(fā)現干擾survivin 的表達可有效抑制口腔舌癌Tca8113細胞的轉移能力，survivin在舌癌中的調控可能為舌癌的基因診斷和生物靶向治療提供新的思路，但survivin在舌癌中的具體作用機制需要進一步深入研究。

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[收稿2017-03-22 修回2017-04-20]

(編輯 許四平 劉格格)

InfluenceofspecificsiRNAsilencingsurvivingeneonproliferationandinvasionofhumantonguecancerTca8113cellsinvitro

MURun-Hong,MAFang,LIUYong-Chao,WANGXiang-Ming.

BasicMedicalCollegeofBeihuaUniversity，Jilin132011，China

Objective:To investigate the effect of siRNA interfering survivin gene on proliferation of human tongue cancer Tca8113 cells,and clarify the effect of survivin Tca8113 cells biomechanism.Methods: The Tca8113 cells at logarithmic growth phase were selected and divided into interference group,negative control group,and blank control group.The relative levels of survivin mRNA and survivin protein expression of 3 groups were detected by RT-PCR and Western blot assay,the inhibitory rate of proliferation of Tca8113 cells was checked by MTT method,the apoptotic rate was assessed by flow cytometry(FCM),the the migration ability of Tca8113 cells were detected by Wound healing assay.Results: Compared with control group,the survivin mRNA and protein expression was markedly down-regulated in Tca8113 cells following RNA interference treatment(P<0.05),the cell proliferation were down-regulated in interference group(P<0.05),the cell apoptotic rate were up-regulated in interference group(P<0.05),the migration ability was significantly decreased in interference group(P<0.05).Conclusion: The expression of siRNA-survivin can significantly inhibit the invasion in tongue cancer Tca8113 cells，indicating it might be a potential biological therapeutic target for tongue cancer.

survivin;siRNA;Proliferation;Apoptosis;Migration

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.007

①本文受吉林省教育廳項目(No.2014第202)、江蘇省檢驗醫(yī)學重點實驗室開放課題資助項目(No.JSKLM-2014-017)和吉林市科技局項目(No.201339052)。

母潤紅(1975年-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事腫瘤免疫治療的研究，E-mail:murunhong@126.com。

及指導教師：馬 方(1971年-)，男，副教授，主要從事口腔種植牙的研究。

R392.1

A

1000-484X(2017)09-1310-05