王威，孫曉麗

(1.河北省張家口市第三醫(yī)院，河北 張家口 075000；2河北省易縣婦幼保健院，河北 保定 074200)

響應(yīng)面法優(yōu)化剪刀股中總皂苷的提取工藝

王威1，孫曉麗2*

(1.河北省張家口市第三醫(yī)院，河北 張家口 075000；2河北省易縣婦幼保健院，河北 保定 074200)

目的：優(yōu)化剪刀股中總皂苷的超聲提取工藝，建立剪刀股中總皂苷的含量測定方法。方法：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，結(jié)合響應(yīng)面分析法，以剪刀股總皂苷的提取率為評價(jià)指標(biāo)，采用分光光度法，測定剪刀股中總皂苷的含量，采用Design-Expert v8.0.6軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合和建模，確定剪刀股總皂苷超聲提取的最佳工藝。結(jié)果：超聲法提取剪刀股中總皂苷的最佳工藝為乙醇濃度80%，液料比18∶1，溫度71 ℃，超聲時間15 min，超聲功率200 W，在此條件下，剪刀股中總皂苷提取率為1.744%，RSD=0.65%(n=6)。結(jié)論：該方法操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可作為剪刀股總皂苷的提取及含量測定方法。

剪刀股；總皂苷；超聲提??；含量測定；響應(yīng)面法

剪刀股(Ixeris debilis A.Gray)是菊科苦荬菜屬植物剪刀股全草，以全草入藥。具有清熱涼血、利尿消腫的功能。用于肺熱咳嗽、喉痛、口腔潰瘍、急性結(jié)膜炎、闌尾炎、水腫、小便不利；外用治乳腺炎、瘡癤腫毒、皮膚瘙癢[1]。馬金萍[2]報(bào)道剪刀股醇提物可顯著提高腦缺血再灌注損傷后小鼠心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性。蒲明秋等[3]報(bào)道剪刀股提取物可對抗煙堿引起的致癌作用。其活性成分的研究僅見剪刀股總黃酮的提取及含量測定[4]。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，剪刀股中含有一定量的皂苷類成分。近年來，可見有關(guān)菊科植物中皂苷類成分的提取分離及生物活性的研究報(bào)道[5-8]。目前，有關(guān)剪刀股總皂苷提取工藝的研究尚未見報(bào)道。本研究采用超聲輔助法提取剪刀股總皂苷，并采用響應(yīng)面法對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為剪刀股的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UV2800雙光束紫外可見分光光度計(jì)(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；KH5200DE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；FA1204B電子分析天平(上海精科天美貿(mào)易有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥品

剪刀股采自河北省張家口市赤城縣，由河北北方學(xué)院趙恒誠教授鑒定為正品。齊墩果酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110709-201206)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為三重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸2.0 mg于10 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，即得濃度為200 μg·mL-1的齊墩果酸對照品溶液，避光放置備用。

2.2 供試品溶液的制備

將干燥的剪刀股粉碎后過20目篩，60 ℃干燥至恒重。精密稱取剪刀股粉末2.5 g，加25 mL石油醚，水浴加熱回流2 h，過濾，揮干至無石油醚味，置于錐形瓶中，加80%乙醇40 mL，于60 ℃超聲(Hz=120 W)，輔助提取10 min，過濾，濾液用體積比為1∶5的水飽和正丁醇萃取，萃取3次，合并濾液，蒸干溶劑，用熱無水乙醇溶解，定容至25 mL[9]，在提取工藝研究中改變相應(yīng)參數(shù)。

2.3 測定波長的選擇

精密量取對照品及供試品溶液0.5 mL于10 mL具塞試管中，揮干溶劑，分別加入新配制的5%香草醛-冰醋酸0.2 mL，高氯酸0.8 mL，于60 ℃水浴下反應(yīng)20 min，冷卻后加入冰醋酸定容至10 mL，于200～600 nm進(jìn)行波長掃描[10]，結(jié)果顯示，對照品和供試品均在546 nm處有最大吸收，故選擇546 nm為測定波長。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL對照品溶液于10 mL具塞試管中，按2.3項(xiàng)下顯色，在546 nm處測量吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=39.372X-0.063 1，r=0.999 9(n= 6)，結(jié)果表明，齊墩果酸濃度在4～24 μg·mL-1與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取相同供試品溶液5份，每份1 mL，分別于室溫放置0、2、4、6、8、10 h后，依法測定吸光度A。A的RSD值為1.97%，表明供試品溶液室溫放置10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

同一批樣品5份，每份2.5 g，精密稱定，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下方法測定吸光度A。A的RSD為0.89%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液1 mL，按2.3項(xiàng)下操作，連續(xù)5次測定吸光度A。A的RSD為 1.22%，結(jié)果表明該方法儀器精密度良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取重復(fù)性試驗(yàn)所用的同批樣品(已知含量1.72%)約2.5 g，共5份，精密稱定，加入適量的齊墩果酸對照品，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算加樣回收率。平均加樣回收率為99.62%，RSD為1.91%(n=5)，表明該方法測得的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.9 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以總皂苷提取率為考察指標(biāo)，按照上述總皂苷提取工藝，固定其他條件，分別考察不同乙醇濃度、液料比、提取溫度、超聲時間、超聲功率對剪刀股總皂苷提取率的影響。

由圖1(A)可知，隨著乙醇濃度的增加，剪刀股總皂苷的提取率不斷增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時，總皂苷提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增加乙醇濃度，總皂苷提取率明顯下降，因此乙醇濃度選擇在75%～85%進(jìn)行優(yōu)化。

由圖1(B)可知，隨著液料比的增大，剪刀股總皂苷的提取率增加，但當(dāng)液料比超過20∶1后，總皂苷提取率變化不明顯，為節(jié)約溶劑，因此液料比選擇在16∶1～20∶1進(jìn)行優(yōu)化。

由圖1(C)可知，隨著提取溫度的提高，剪刀股總皂苷的提取率不斷增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到75 ℃時，總皂苷提取率達(dá)到最大，繼續(xù)提高溫度，總皂苷提取率略有下降，因此提取溫度選擇在65～75 ℃進(jìn)行優(yōu)化。

由圖1(D)可知，超聲提取時間增加至15 min后，剪刀股總皂苷提取率不隨提取時間變化而變化，因此，選擇超聲提取時間為15 min。

圖1 剪刀股總皂苷提取的單因素試驗(yàn)

由圖1(E)可知，在200～400 W隨著超聲功率的增加，剪刀股總皂苷的提取率變化不明顯，在本實(shí)驗(yàn)中，采用200 W功率。

2.10 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，以乙醇濃度A、液料比B、提取溫度C為考察因素，以剪刀股總皂苷提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert v8.0.6軟件優(yōu)化剪刀股總皂苷提取工藝[11]。試驗(yàn)因素、水平編碼見表1。設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析見表3。對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得剪刀股總皂苷提取率對自變量乙醇濃度A、液料比B、提取溫度C的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=1.72+0.025A+0.016B+0.056C+0.018AB-0.077AC+0.11BC-0.25A2-0.19B2-0.13C2。

表1 因素與水平

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

注：表2中實(shí)驗(yàn)1～12為析因?qū)嶒?yàn)；13～17為中心實(shí)驗(yàn)。

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析

注：***P<0.001表示差異極顯著；**P<0.01表示差異高度顯著；*P>0.05，表示差異不顯著。

回歸方程響應(yīng)面及等高線見圖2(a～c)，任何兩個交互因素的響應(yīng)面都存在最高點(diǎn)，即在所選的范圍內(nèi)存在極值，說明各因素考察范圍較為適當(dāng)。響應(yīng)面曲面的坡度的陡峭程度直接地反映了在處理?xiàng)l件發(fā)生變化時剪刀股總皂苷提取量的響應(yīng)靈敏程度。由圖可見，乙醇濃度和提取溫度對剪刀股總皂苷提取率影響高度顯著，三個因素影響大小順序?yàn)闇囟?乙醇濃度>液料比。等高線均為橢圓形，表明AB、BC、AC均有交互作用，由于AB的等高線更接近于圓形，因此乙醇濃度和液料比交互作用最弱，提取溫度與乙醇濃度、提取溫度與液料比的交互作用較為顯著。

通過軟件分析得到最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80.07%、液料比為18.23 mL·g-1，提取溫度為71.29 ℃，在此條件下剪刀股總皂苷的提取率為1.732%。為使實(shí)驗(yàn)操作簡便，最終確定提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、液料比為18 mL·g-1、提取溫度為71 ℃。

2.11 驗(yàn)證試驗(yàn)

精密稱取剪刀股6份，每份20 g，按2.2項(xiàng)下方法以最佳的提取工藝(乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、液料比18∶1、超聲溫度71 ℃、超聲時間15 min、超聲功率200 W)提取總皂苷，按2.3項(xiàng)下方法顯色，546 nm處測定吸光度，總皂苷含量分別為1.731%、1.734%、1.733%、1.745%、1.742%、1.776%，平均含量為1.744%，RSD為0.65%，表明該方法適合于放大生產(chǎn)。

圖2 各交互因素對剪刀股總皂苷提取率的響應(yīng)面圖

3 討論與結(jié)論

皂苷的提取主要方法為溶劑回流法，所用時間較長，不利于皂苷類成分的穩(wěn)定，本文通過預(yù)實(shí)驗(yàn)采取超聲輔助提取法提取剪刀股總皂苷，在較短時間內(nèi)即可完成提取，避免因提取時間過長而使皂苷被水解破壞[12]。

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化剪刀股活性成分總皂苷的提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度、提取溫度、液料比的平方項(xiàng)，提取溫度與乙醇濃度、提取溫度與料液比的交互作用對剪刀股總皂苷的提取率的影響顯著。說明乙醇濃度、提取溫度、液料比對剪刀股總皂苷提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

回歸分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法合理可行。得到剪刀股總皂苷提取的最佳條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、液料比為18∶1、超聲溫度為71 ℃、超聲時間為15 min、超聲功率為200 W，剪刀股總皂苷提取率為1.732%。

該方法簡便易行、靈敏度高、精密度高、重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠，可作為剪刀股中總皂苷的提取及含量測定方法；為以后剪刀股總皂苷的提取和含量測定提供了方法與理論依據(jù)，為新藥開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

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OptimizationofExtractionProcessforTotalSaponinsfromIxerisdebilisbyResponseSurfaceMethodology

WANG Wei1，SUNXiaoli2*

(1.PharmacyofThe3thHospitalofZhangjiakou，Hebei，Zhangjiakou，75000，China；2.WomenandChildrenHospitalofYixian，Hebei，Baoding，074200，China)

Objective：To optimize theextraction of total saponinsand establish a method for determination of total saponins inIxerisdebilis.Method：Using the extraction yield of total saponins as index，spectrophotometric method was used to determinate the content of total saponins inI.debilis.On the basis of single factor experiments，Box-Behnken design and response surface were used to optimize theextraction of total saponins.And the extraction yield of the total saponins wasanalyzedusing quadratic regression modelby the software of Design-Expert v8.0.6.Result：The optimum extraction conditions were：ethanol concentration 80%，liquid to material ratio 18 mL·g-1，temperature 71 ℃，extraction time 15 min and the ultrasonic power 200 w.Under these conditions，the yield of extracted total saponinscould be up to 1.744%，RSD=0.65%(n=6).Conclusion：The method is simple，accurate，sensitive andreproducible，and can be used for extraction and content determination of total saponins fromI.debilis.

IxerisdebilisA.Gray；total saponins；ultrasonic-assisted extraction；content determination；response surface methodology

] 孫曉麗，副主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)，E-mail：xiaoli_sunbaoding@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.024

2016-10-31)

*[