陳新連，周建國(guó)，馬雙姣，姚輝，林余霖，王瑀

(中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

基于ITS2序列的朱砂根及其混偽品分子鑒定△

陳新連，周建國(guó)，馬雙姣，姚輝，林余霖，王瑀*

(中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：應(yīng)用ITS2序列對(duì)朱砂根及其混偽品進(jìn)行鑒定研究，為中藥臨床準(zhǔn)確用藥、市場(chǎng)規(guī)范化管理等提供依據(jù)和保障。方法：對(duì)朱砂根及其混偽品進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增ITS2序列、雙向測(cè)序，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)、計(jì)算遺傳距離。結(jié)果：朱砂根ITS2序列長(zhǎng)度為217 bp，種內(nèi)有10個(gè)變異位點(diǎn)，有9種單倍型，平均G+C含量為59.1%，除變種紅涼傘外，朱砂根與其各混偽品的種間最小遺傳距離均大于朱砂根種內(nèi)最大遺傳距離，所以利用ITS2序列可以鑒別朱砂根及其混偽品。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ITS2序列可以鑒別朱砂根及其混偽品，但對(duì)于其與變種的關(guān)系需進(jìn)一步研究。

朱砂根；鑒別；ITS2序列；DNA條形碼；混偽品

中藥材朱砂根為紫金?？浦参镏焐案鵄rdisiacrenataSims的干燥根。本品根簇生于略膨大的根莖上，呈略彎曲的圓柱形，表面灰棕色或棕褐色，有多數(shù)縱皺紋和橫環(huán)狀斷裂痕，皮部與木部易分離。質(zhì)硬而脆，易折斷，斷面不平坦，皮部厚，約占斷面的1/3～1/2，類(lèi)白色或粉紅色，外側(cè)有紫紅色斑點(diǎn)散在，習(xí)稱(chēng)“朱砂點(diǎn)”，木部黃白色，不平坦。氣微，味微苦，有刺舌感，有解毒消腫、活血止痛、祛風(fēng)除濕之功效[1]。朱砂根為民間常用中草藥之一，根、葉可用于跌打風(fēng)濕、消化不良、咽喉炎及月經(jīng)不調(diào)等癥。果可食，亦可榨油，油可供制肥皂。朱砂根也可作觀賞植物，在園藝方面的品種較多[2]。此外，其在抗炎抑菌、抗腫瘤、抗生育、抗HIV、抑制血小板聚集、降低血壓等方面也有很好的療效[3-7]。

在第四次全國(guó)中藥資源普查中發(fā)現(xiàn)，朱砂根野生資源目前較為豐富，主要分布于長(zhǎng)江中、下游的重慶、四川、貴州、云南、廣東和廣西等地，藥用方面基本全部來(lái)源于野生朱砂根[8]。朱砂根常與其同屬植物混在一起使用[9-10]，同時(shí)，由于牡丹皮和山豆根市場(chǎng)價(jià)格較高，三者的外部形態(tài)相似，有不法商販將朱砂根混在牡丹皮、山豆根中使用[10-12]，牡丹皮是毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的根皮，為清熱涼血、活血化瘀之藥[1]，山豆根是豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的根及根莖，有清熱解毒、消腫利咽的作用[1]。此混偽現(xiàn)象嚴(yán)重影響了臨床的安全用藥和藥材的規(guī)范化管理、流通。中藥材的傳統(tǒng)鑒別方法較難區(qū)分此類(lèi)混偽品，且過(guò)度依賴(lài)專(zhuān)業(yè)人員的主觀判斷，而DNA條形碼鑒定技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)相對(duì)較短的序列進(jìn)行特異性物種識(shí)別鑒定，可有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒別的局限，其自2003年被提出后就受到國(guó)際廣泛關(guān)注[13]。該技術(shù)物種鑒定效率高，且技術(shù)方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強(qiáng)，不受外界環(huán)境以及樣品形態(tài)和材料部位的限制，顯著提高了鑒定的效率與準(zhǔn)確性。其中，對(duì)于植物類(lèi)藥材，ITS2序列具有很高通用性，易于擴(kuò)增、測(cè)序，且長(zhǎng)度適宜，約230 bp，同時(shí)也具有足夠的變異以區(qū)分不同的物種，絕大多數(shù)中藥材可以通過(guò)ITS2序列進(jìn)行鑒定[14-15]。本研究應(yīng)用ITS2序列對(duì)朱砂根及其混偽品進(jìn)行鑒定研究，以期為其臨床用藥安全提供依據(jù)。

1 材料

朱砂根樣品包括基原植物樣本、藥材樣本、種子樣本、復(fù)核樣本和對(duì)照藥材等，采自廣東、江西、湖北、安徽、四川等地，種子樣本來(lái)自國(guó)家藥用植物種質(zhì)資源庫(kù)。此外，還從GenBank下載了部分物種的ITS2序列，所有下載序列應(yīng)用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)方法在NCBI(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http：//www.tcmbarcode.cn/china/)進(jìn)行驗(yàn)證，確保準(zhǔn)確可靠。具體的樣本信息見(jiàn)表1。

表1 朱砂根及其混偽品樣品信息表

2 方法

2.1 DNA提取

將根類(lèi)樣品用75%乙醇棉擦拭干凈，取約40 mg樣品，取變色硅膠干燥基原植物葉片樣品約20 mg，朱砂根的種子呈球形，直徑約為6～9 mm，在靠近種皮的位置取樣約40 mg，磨碎，用植物基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取總DNA，加裂解液，葉片樣品65 ℃水浴2 h，其余樣品56 ℃水浴8～12 h，主要原理是通過(guò)使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜溶解破裂，DNA暴露，再經(jīng)過(guò)多步除雜、沉淀、清洗、吹干、洗脫等過(guò)程，去除酚類(lèi)、蛋白質(zhì)、RNA等，最終得到較為純凈的總DNA備用。

2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序擴(kuò)增

選用25 μL體系，參照Chen等的研究方法[16]，所用引物為正向ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′和反向ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′，用12.5 μL 2×Taq Master Mix(北京艾德萊生物科技有限公司)，正反向引物各取1 μL，DNA模板2 μL，用8.5 μL ddH2O補(bǔ)足體積至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。擴(kuò)增完成后，用凝膠成像儀在紫外光下觀察其電泳后在瓊脂糖凝膠中的條帶亮度，并與Marker AL2000(北京艾德萊生物科技有限公司)對(duì)比來(lái)判斷擴(kuò)增情況，包括目的條帶的有無(wú)、估算產(chǎn)物濃度及序列長(zhǎng)度[17]。最后將PCR產(chǎn)物送往中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.3 數(shù)據(jù)處理獲得的測(cè)序結(jié)果

應(yīng)用CodonCode Aligner 5.1.5進(jìn)行拼接，去除低質(zhì)量區(qū)，然后基于隱馬爾科夫進(jìn)行ITS2序列注釋?zhuān)詈笥肕EGA6.0 (MolecularEvolutionary Genetics Analysis) 進(jìn)行種內(nèi)種間變異位點(diǎn)、遺傳距離的分析?；诒菊n題組自行編寫(xiě)的代碼[18-19]，將朱砂根及其主要混偽品牡丹皮、山豆根的主導(dǎo)單倍型ITS2序列轉(zhuǎn)換為DNA條形碼和二維DNA條形碼圖片。

3 結(jié)果與分析

本研究獲得朱砂根ITS2序列48條，長(zhǎng)度為217 bp，G+C含量為58.5%～60.2%，平均G+C含量為59.1%，種內(nèi)變異位點(diǎn)10個(gè)，有9個(gè)單倍型，主導(dǎo)單倍型占50%，朱砂根種內(nèi)變異位點(diǎn)具體信息見(jiàn)表2。

表2 朱砂根ITS2序列種內(nèi)變異位點(diǎn)

注：*表示與第一行堿基相同，-表示堿基缺失。

朱砂根主導(dǎo)單倍型(以ZHSG0005為例)與其同屬植物ITS2序列比對(duì)長(zhǎng)度為217 bp，共有25個(gè)變異位點(diǎn)，詳細(xì)信息見(jiàn)圖1。朱砂根與其混偽品種間序列比對(duì)長(zhǎng)度為249 bp，有142個(gè)變異位點(diǎn)。

朱砂根種內(nèi)及其與各混偽品間的K2P距離請(qǐng)見(jiàn)表3。由表3可以看出，除變種紅涼傘外，朱砂根與其他各混偽品的種間最小遺傳距離均大于種內(nèi)最大遺傳距離，因此用ITS2序列可以區(qū)分鑒別開(kāi)。

注：.表示與第一行堿基相同。圖1 朱砂根主導(dǎo)單倍型與其同屬植物ITS2序列種間變異位點(diǎn)

表3 朱砂根種內(nèi)及其與各混偽品的K2P距離

朱砂根及其主要混偽品牡丹皮、山豆根的藥材飲片圖片、主導(dǎo)單倍型ITS2序列DNA條形碼和二維DNA條形碼圖片見(jiàn)圖2。其中DNA條形碼和二維DNA條形碼圖片中以不同顏色代表不同的核苷酸，數(shù)字表示堿基序列長(zhǎng)度，右側(cè)部分二維碼圖片為物種拉丁名和DNA條形碼序列轉(zhuǎn)換而成，形象化展示各物種的DNA條形碼。通過(guò)移動(dòng)終端(如手機(jī)等)上的二維碼掃描軟件可以識(shí)讀獲得物種拉丁名及ITS2序列信息，可通過(guò)移動(dòng)終端上的網(wǎng)頁(yè)瀏覽器登錄中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(www.tcmbarcode.cn)進(jìn)行物種鑒定。

圖2 朱砂根、牡丹皮和山豆根藥材圖片及其對(duì)應(yīng)基原的DNA條形碼和二維DNA條形碼圖片

4 討論

根類(lèi)藥材細(xì)胞中含大量次生代謝產(chǎn)物，如多糖和多酚，這些物質(zhì)在DNA提取過(guò)程中與DNA共沉淀，形成黏稠的膠狀物難以溶解或產(chǎn)生褐變[20]；同時(shí)，種子類(lèi)樣品富含油脂、酚類(lèi)、多糖類(lèi)等物質(zhì)，會(huì)干擾DNA的提取，所以提取時(shí)應(yīng)適當(dāng)增大取樣量，增大裂解液的用量，延長(zhǎng)水浴時(shí)間，盡可能提取較高質(zhì)量的DNA，利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，在研磨前加大聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)的用量，并在加裂解液前用核分離液[100 mmol·L-1Tris-HCL(pH 8.0)，20 mmol·L-1EDTA(pH 8.0)，0.7 mmol·L-1NaCl，2% PVP-40，0.4%β-巰基乙醇]多次洗滌、離心至上清液不呈黏稠狀。之前就有很多研究者在實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行過(guò)相似的處理[21-23]。

紅涼傘是朱砂根的變種，朱砂根種內(nèi)最大遺傳距離(0.031 3)大于紅涼傘與朱砂根的種間最小遺傳距離(0)，因而無(wú)法從ITS2序列水平鑒別這兩種植物。根據(jù)《中國(guó)植物志》記載，二者作為單獨(dú)的兩個(gè)種是不恰當(dāng)?shù)?，故給予歸并[2]?！吨袊?guó)植物志》記錄兩者植物形態(tài)上的主要區(qū)別是，變種的葉背、花梗、花萼及花瓣均帶紫紅色，有的植株葉兩面均為紫紅色，兩者在植株外形無(wú)太大差異，僅顏色不同，從標(biāo)本上看，尤其是在野外采集記錄不詳而標(biāo)本壓制不得當(dāng)時(shí)，二者更是無(wú)法區(qū)別，而活的植株中，顏色的深淺也有過(guò)渡，并且二者在藥用性能方面基本一致[2]。在最新版的《Flora of China》中，紅涼傘已合并至朱砂根。對(duì)于朱砂根與其變種的鑒別，目前還沒(méi)有找到合適的方法，答國(guó)政等[24]基于ITS2序列對(duì)紫金牛屬矮地茶藥材進(jìn)行基因識(shí)別研究時(shí)，也發(fā)現(xiàn)朱砂根和紅涼傘在NJ樹(shù)中混為一支，無(wú)法鑒別分開(kāi)。徐玲玲等[25]基于核ITS與葉綠體trnL-F序列對(duì)12種紫金牛屬植物的種間關(guān)系與變異進(jìn)行的研究，為朱砂根與其同屬其他植物鑒定提供了啟示。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用葉綠體全基因組篩選特異性DNA序列[26]對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分，或?qū)⑷~綠體全基因組作為超級(jí)條形碼對(duì)二者的關(guān)系進(jìn)行深入的研究。

藥用植物栽培過(guò)程中，種子是最基礎(chǔ)、最重要的起點(diǎn)[27]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)朱砂根不同產(chǎn)地種子進(jìn)行了鑒別研究，為朱砂根的規(guī)范化栽培、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了很好的依據(jù)。此外，本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易掌握，適用于較多物種及其混偽品的鑒定。它從分子角度入手，植物的遺傳物質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，較少甚至不受到材料部位、外界環(huán)境的影響，逐漸擺脫了對(duì)于專(zhuān)業(yè)鑒定人員的依賴(lài)，使物種鑒定標(biāo)準(zhǔn)化、簡(jiǎn)單化。此外，本研究轉(zhuǎn)成的二維DNA條形碼圖片，讀者可以通過(guò)多種二維碼掃描軟件(如微信“掃一掃”功能、“快拍二維碼”等)識(shí)讀到對(duì)應(yīng)物種的拉丁名和ITS2序列。本研究利用DNA條形碼對(duì)朱砂根及其混偽品進(jìn)行鑒定，對(duì)于物種鑒定有重要的啟示與指導(dǎo)意義，對(duì)于其在臨床準(zhǔn)確安全用藥和規(guī)范藥材市場(chǎng)流通等方面提供了重要依據(jù)。

致謝：感謝中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所對(duì)部分樣品進(jìn)行復(fù)核，感謝國(guó)家藥用植物種質(zhì)資源庫(kù)提供種子樣本。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：27，138，172.

[2] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[3] 張清華.紫金牛屬植物化學(xué)成分研究概況[J].華西藥學(xué)雜志，1994，9(2)：99-103.

[4] 余成龍，宋良科，吳蜀星，等.朱砂根藥用資源分布及研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(28)：13793-13794，13924.

[5] 宋冬雪.朱砂根藥理作用研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥，2014(4)：887-888.

[6] 張偉，李錕，李東，等.朱砂根化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(11)：279-282.

[7] 鄧素芳，黃烯，賴(lài)鐘雄.朱砂根的藥用價(jià)值與觀賞價(jià)值[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2006，2(3)：176-178.

[8] 牛小花，陳洪源.藥用植物朱砂根研究概況[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12(18)：48-50.

[9] 陳友愛(ài)，潘鴻森.中藥材朱砂根及其近緣種的生藥學(xué)研究[J].福建醫(yī)藥雜志，1996(6)：129-130.

[10]曾江.牡丹皮與朱砂根、白鮮皮的鑒別比較[J].湖北中醫(yī)雜志，2003，25(11)：53.

[11]李勉，王毓萍，高健，等.牡丹皮及其偽品的鑒別[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2002，21(2)：24-26.

[12]張?jiān)品?山豆根及其常見(jiàn)混淆品的鑒別[J].海峽藥學(xué)，2011，23(12)：50-52.

[13]Hebert P D，Cywinska A，Ball S L，et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences，2003，270(1512)：313-321.

[14]Chen S L，Pang X H，Song J Y，et al.A renaissance in herbal medicine identification：from morphology to DNA[J].Biotechnology Advances，2014，32(7)：1237-1244.

[15]Yao H，Song J Y，Liu C，et al.Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals[J].PLoS One，2010，5：e13102.

[16]陳士林.中藥DNA條形碼分子鑒定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：14.

[17]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：383-385.

[18]陳士林.《中國(guó)藥典》中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列[M].北京：科學(xué)出版社，2015：18-19.

[19]辛天怡，李西文，姚輝，等.中藥材二維DNA條形碼流通監(jiān)管體系研究[J].中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2015，45(7)：695-702.

[20]陳士林，姚輝，韓建萍，等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38(2)：141-148.

[21]馬雙姣，周建國(guó)，金鉞，等.王不留行種子的ITS2序列分子鑒定研究[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18(1)：29-34.

[22]周建國(guó)，馬雙姣，黃玉龍，等.種子類(lèi)藥材補(bǔ)骨脂及其混偽品的ITS2條形碼序列鑒定[J].世界中醫(yī)藥，2016，11(5)：786-790.

[23]張娜娜，辛天怡，金鉞，等.基于中藥材DNA條形碼系統(tǒng)的澤瀉種子鑒別研究[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18(1)：18-23.

[24]答國(guó)政，張秀橋，姚輝，等.基于ITS2序列的矮地茶藥材基因識(shí)別[J].中藥材，2015，38(11)：2277-2280.

[25]徐玲玲，李同建，張美云，等.基于核ITS與葉綠體trnL-F序列分析12種紫金牛屬植物的種間關(guān)系與變異[J].園藝學(xué)報(bào)，2009，37(10)：1531-1537.

[26]李瀅，姚輝，宋經(jīng)元，等.基于葉綠體全基因組的貝母屬特異性DNA條形碼的篩選[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18(1)：24-28.

[27]馬雙姣，楊培，周紅，等.鴉膽子藥材及其混偽品的ITS2序列分子鑒定研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2015，17(10)：1004-1007.

MolecularIdentificationofArdisiaeCrenataeRadixandItsAdulterantsBasedonITS2Sequence

CHEN Xinlian，ZHOUJianguo，MAShuangjiao，YAOHui，LINYulin，WANGYu*

(TheKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective：This research aims to identify Ardisiae Crenatae Radix and its adulterants accurately using the ITS2 sequence.It will provide the foundation for its clinical medication and accurate market standardized management.Methods：Ardisia Crenatae Radix and its adulterants were identified and distinguished by ITS2 barcode，one marker of DNA barcoding.Genomic DNA ofArdisiacrenataand its adulterants were extracted and then the ITS2 regions were obtained by PCR amplification and sequenced bidirectionally.The ITS2 sequences were aligned and the genetic distances were computed using MEGA 6.0 in accordance with the Kimura 2-parameter (K2P) model.Results：The length ofA.crenatasequence is 217 bp and the average G+C content was 59.1%.There were ten variable sites of the ITS2 regions ofA.crenataand 48 ITS2 sequences ofA.crenataincluded nine haplotypes.Except forA.crenatavar.bicolor，the maximum intra-specific K2P genetic distance of Ardisiae Crenatae Radix and its adulterants was less than the minimum inter-specific K2P genetic distance.Conclusion：The experimental results indicated that the ITS2 sequence could be a good marker to identify Ardisia Crenatae Radix and its adulterants.But the relationship ofA.crenataandA.crenatavar.bicolorneed to be further studied.

Ardisiae Crenatae Radix；identification；ITS2 sequence；DNA barcoding；adulterants

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAI07B08)；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程(2016-I2M-3-016)

] 王瑀，副主任技師，研究方向：中藥資源；Tel：(010)57833199，E-mail：ywang@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.008

2017-03-23)

*[