韓奇亨，湯健，王曉琴，李旻輝,3,4,5*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)藥研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)特色藥用植物培育與保護(hù)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)特色道地藥材資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

基于DNA條形碼技術(shù)鑒別5種列當(dāng)屬藥用植物△

韓奇亨1，湯健1，王曉琴2*，李旻輝1,3,4,5*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)藥研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)特色藥用植物培育與保護(hù)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)特色道地藥材資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

目的：建立一種快速、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化的5種列當(dāng)屬藥用植物的DNA條形碼鑒別方法。方法：采集5種列當(dāng)屬藥用植物，所有樣品進(jìn)行總DNA提取，PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序得到相應(yīng)的序列，測(cè)序結(jié)果使用CONTIG、BioEdit、MEGA6.0軟件進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果：測(cè)得5種列當(dāng)屬植物的ITS、rbcL、trnL-F和matK全長(zhǎng)序列共200條，4種序列長(zhǎng)度范圍在364～1240 bp，其中ITS、trnL-F和matK可將其鑒別出來。結(jié)論：rbcL序列無法有效鑒別5種列當(dāng)屬藥用植物，trnL-F與ITS序列能夠成功鑒別，可作為列當(dāng)屬植物的分子鑒別方法。

分子鑒別；DNA 條形碼；列當(dāng)屬；

分子標(biāo)記方法起源于1987年[1]，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、客觀性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，但分子標(biāo)記法在重復(fù)性和穩(wěn)定性上并不盡如人意[2]。此外，由于其操作的復(fù)雜程度，也限制了分子標(biāo)記法的推廣應(yīng)用。DNA條形碼概念于2003年被加拿大Guelph 大學(xué)Hebert 等人首次正式提出[3]，因其具有對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒別的特點(diǎn)而備受外界關(guān)注。使用核基因序列與葉綠體基因序列搭配對(duì)植物進(jìn)行鑒別的方法因可靠性較高被國內(nèi)外廣泛采用。

列當(dāng)屬植物在我國共分布有25 種，為多年生、二年生或一年生肉質(zhì)寄生草本，其中16種列當(dāng)屬植物的寄主有明確記載，多為蒿屬植物。列當(dāng)屬植物多生于沙丘、山坡及溝邊草地上，生長(zhǎng)環(huán)境分布在海拔850～4000 m。列當(dāng)屬主要活性成分為苯乙醇苷類和多糖，其具有抗疲勞，改善腦組織循環(huán)，增強(qiáng)免疫力的藥理作用，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中主要被用作強(qiáng)筋壯骨，補(bǔ)腎助陽，常被作為肉蓯蓉的代用品。25 種列當(dāng)屬植物中有6 種在蒙、藏、傈僳、彝的民族醫(yī)藥中作為民族藥應(yīng)用，占總數(shù)的24%[4-6]。

列當(dāng)(紫花列當(dāng))Orobanchecoerulescens、黃花列當(dāng)O.pycnostachya、彎管列當(dāng)O.cernua、毛藥列當(dāng)O.ombrochares屬于列當(dāng)屬列當(dāng)組，常作為蒙藥使用。列當(dāng)(紫花列當(dāng))、黃花列當(dāng)、彎管列當(dāng)、毛藥列當(dāng)以全草入藥，由于這幾種列當(dāng)經(jīng)炮制切片后外形、顏色十分相近，且顯微鑒別也較難區(qū)分，故本實(shí)驗(yàn)嘗試采用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行鑒別[6-8]。實(shí)驗(yàn)中選用4種常用DNA條形碼引物序列對(duì)列當(dāng)(紫花列當(dāng))，黃花列當(dāng)，彎管列當(dāng)、毛藥列當(dāng)和分枝列當(dāng)O.aegyptiaca進(jìn)行分子鑒別，用以比較不同候選片段對(duì)此5種植物的鑒別能力，其中分枝列當(dāng)屬于列當(dāng)屬小苞組本，用于考察這4種序列對(duì)列當(dāng)屬屬內(nèi)組間的鑒別能力，從而篩選可鑒別該屬植物的優(yōu)選DNA條形碼序列，為該屬植物的分子鑒別提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)選用的5種列當(dāng)屬植物采自內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善盟、巴彥淖爾市，其中列當(dāng)(紫花列當(dāng))13株，黃花列當(dāng)4株，彎管列當(dāng)29株，分枝列當(dāng)3株，毛藥列當(dāng)1株，具體樣品信息見表1。樣品由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)王曉琴教授采集并鑒定，憑據(jù)標(biāo)本保存于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥教研室。

表1 材料信息表

1.2 試劑

DP305-02植物基因組DNA提取試劑盒(天根公司)，1×TAE緩沖液、瓊脂糖(Promega公司)，2× Taq DNA Master Mix (Takara公司)，2 000 bp DNA Markar (Takara公司)，巰基乙醇(Amresco公司)，核酸染料(賽百盛公司)，三氯甲烷﹑無水乙醇﹑異丙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

Arktik-5020型PCR儀(美國Thermo)，LABOFUGE 400R型低溫冷凍干燥儀(美國Thermo)，5000 plus型紫外凝膠成像分析儀(賽智ChampGel)，掌上離心機(jī)(德國IKA miniG)，手持移液器(德國Eppendorf)，MM400型混合型球磨儀(德國Retsch)。

2 方法

2.1 總DNA 的提取

取適量(約100 mg)的植物樣品干燥的莖，液氮研磨成細(xì)粉后，使用試劑盒法提取，獲得總DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 引物設(shè)計(jì)

選擇目前中藥鑒別中常用的通用引物[9]，詳情見表2。

2.3 DNA 擴(kuò)增

4種引物片段PCR擴(kuò)增體系為40.0 μL，包含：2×Taq DNA Master Mix(Takara 公司)20.0 μL，正向、反向引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 17 μL。

表2 引物信息

反應(yīng)條件：

①ITS (1F/4R)片段

預(yù)變性溫度：94 ℃，5 min；變性溫度：94 ℃，1 min；退火條件：45 ℃，45 s；復(fù)性條件：72 ℃，1 min；35個(gè)循環(huán)；延伸條件72 ℃，7 min，最后4 ℃保存。

②rbcL (1F/724R)片段：

預(yù)變性條件：94 ℃，4 min；變性溫度：94 ℃，30 s；退火條件：52 ℃，45 s；復(fù)性條件：72 ℃，1 min；35個(gè)循環(huán)；延伸條件72 ℃，7 min；最后4 ℃保存。

③trnL-F(trnL-F c/trnL-F f)片段：

預(yù)變性條件：94 ℃，5 min；變性溫度：94 ℃，1 min；退火條件：50 ℃，45 s；復(fù)性條件：72 ℃，1 min；35個(gè)循環(huán)；延伸條件72 ℃，7 min；最后4 ℃保存。

④matK(AF/8R)片段：

預(yù)變性條件：94 ℃，1 min；變性溫度：94 ℃，50 s；退火條件：50 ℃，45 s；復(fù)性條件：72 ℃，1 min；35個(gè)循環(huán)；延伸條件72 ℃，7 min；最后4 ℃保存。

擴(kuò)增結(jié)束后使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并使用凝膠成像系統(tǒng)分析。

2.4 測(cè)序

經(jīng)過PCR 擴(kuò)增后，PCR 原產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序部北京分部測(cè)序，各樣品均采用正向和反向測(cè)序，以保證測(cè)序的準(zhǔn)確性。

2.5 序列分析

將5種列當(dāng)藥材分別進(jìn)行rbcL，ITS，trnL-F，matK 4個(gè)序列的比對(duì)分析。用CONTIG軟件將DNA序列排序后，應(yīng)用BioEdit 分析軟件進(jìn)行分析處理，結(jié)合Mega 5.0分析軟件中的NJ(Neighbor-joining)工具構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并以Bootstrap 作1000次可信度分析。

3 結(jié)果

3.1 評(píng)價(jià)4種DNA條形碼序列

從5個(gè)不同物種中獲得rbcL、ITS、trnL-F、matK序列各50條，共200條。引物通用性﹑PCR 擴(kuò)增成功率以及序列擴(kuò)增成功率，皆100%(表3)，將獲得的序列進(jìn)行CONTIG軟件和BioEdit分析軟件對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)trnL-F變異位點(diǎn)228個(gè)，信息位點(diǎn)118個(gè)；rbcL變異位點(diǎn)47個(gè)，信息位點(diǎn)30個(gè)；matK變異位點(diǎn)279個(gè)，信息位點(diǎn)159個(gè)；ITS變異位點(diǎn)171個(gè)，信息位點(diǎn)146個(gè)。

3.2 5種列當(dāng)屬植物經(jīng)典分類學(xué)的探討

通過利用Mega 6.0軟件，以NJ(Neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1、圖2、圖3、圖4)及序列分析可知，4種片段中所選擇的ITS、trnL-F與matK片段效果較好，能夠鑒別出5種列當(dāng)屬植物。而rbcL的鑒別能力相對(duì)較差，無法將5種列當(dāng)屬植物鑒別開來。

表3 評(píng)價(jià)4種DNA通用引物

3.3 trnL-F序列數(shù)據(jù)分析

通過對(duì)trnL-F序列進(jìn)行分析對(duì)比之后，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)248個(gè)變異位點(diǎn)，197個(gè)信息位點(diǎn)，通過這些信息位點(diǎn)的變化可以將這5種列當(dāng)科植物很好的鑒別出來(表4)，比如彎管列當(dāng)與其他4種有兩個(gè)獨(dú)特的位點(diǎn)(17 bp：A或48 bp：A)，都分別可看作一個(gè)特征位點(diǎn)。其他種的特征位點(diǎn)有：黃花列當(dāng)(53 bp：T或556 bp：A)，分枝列當(dāng)(203 bp：G或205 bp：T)，毛藥列當(dāng)(307 bp：T，447 bp：G或504 bp：G)，列當(dāng)(紫花列當(dāng))(447 bp：T)。

3.4 matK序列數(shù)據(jù)分析

通過對(duì)matK序列進(jìn)行分析對(duì)比以后，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)236個(gè)，信息位點(diǎn)147個(gè)，通過這些信息位點(diǎn)的變化可以將這5種列當(dāng)科植物較好的鑒別出來(表5)，比如毛藥列當(dāng)(19 bp：C或63 bp：G)，分枝列當(dāng)(20 bp：G，32 bp：A，88 bp：A，350 bp：G或398 bp：T)，彎管列當(dāng)(204 bp：A，371 bp：T或689 bp：C)，列當(dāng)(紫花列當(dāng))(350 bp：C或398 bp：A)，黃花列當(dāng)(914 bp：G)。此外在所獲得序列的同一位點(diǎn)中，不同種列當(dāng)堿基變異可能在2種以上，如350 bp，389 bp，914 bp等處。

表4 5種列當(dāng)屬植物trnL-F序列信息位點(diǎn)

圖1 基于trnL-F 序列的5 種列當(dāng)科植物NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2 基于matK 序列的5 種列當(dāng)科植物NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 基于ITS 序列的5 種列當(dāng)科植物NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 基于rbcL 序列的5 種列當(dāng)科植物NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹

表5 5種列當(dāng)屬植物matK序列信息位點(diǎn)

3.5 ITS序列數(shù)據(jù)分析

通過對(duì)ITS序列進(jìn)行分析對(duì)比之后，共現(xiàn)171個(gè)變異位點(diǎn)，146個(gè)信息位點(diǎn)，通過這些信息位點(diǎn)的變化可以將這5種列當(dāng)科植物很好的鑒別出來(表6)，比如分枝列當(dāng)(46 bp：T或311 bp：A)，黃花列當(dāng)(184 bp：T或299 bp：T)，列當(dāng)(紫花列當(dāng))(237 bp：G或451 bp：T)，毛藥列當(dāng)(390 bp：C或396 bp：A)，彎管列當(dāng)(470 bp：G或595 bp：A)。

表6 5種列當(dāng)屬植物ITS序列信息位點(diǎn)

4 討論

綜合上述實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)處理結(jié)果可知，trnL-F、matK序列和ITS序列都可將本實(shí)驗(yàn)的物種鑒別出來。 rbcL序列在實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增、測(cè)序環(huán)節(jié)成功率高，但通過CONTIG軟件和BioEdit軟件分析，使用Mega 6.0軟件建樹后發(fā)現(xiàn)，5種列當(dāng)屬植物的rbcL序列變異位點(diǎn)少，信息位點(diǎn)僅31個(gè)，且缺乏區(qū)分5種植物的特征位點(diǎn)，所構(gòu)建的NJ樹也顯示，rbcL序列無法將5種列當(dāng)植物區(qū)分出來，因此不適合此5種列當(dāng)屬藥材鑒別。對(duì)于ITS序列和trnL-F、matK序列，trnL-F序列特征位點(diǎn)最多，其次為ITS序列，這兩種序列鑒別能力最強(qiáng)，而matK序列區(qū)分毛藥列當(dāng)與列當(dāng)(紫花列當(dāng))能力較trnL-F序列、ITS序列差。從各類DNA條形碼技術(shù)的報(bào)道和相關(guān)文獻(xiàn)來看，rbcL 序列適合用于科級(jí)的鑒別，matK 序列則通常用于鑒別屬級(jí)的植物，而ITS 序列和trnL-F 序列更適合鑒別種級(jí)的不同個(gè)體[10]，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯然印證了此類觀點(diǎn)。

對(duì)于matK序列，一般認(rèn)為其通用性相對(duì)較差，就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，matK序列可考慮與其他序列進(jìn)行搭配，如本實(shí)驗(yàn)中的ITS序列、trnL-F序列，從而增加對(duì)此5種列當(dāng)屬植物鑒別的準(zhǔn)確性。對(duì)于ITS序列，本實(shí)驗(yàn)雖然選擇了ITS1和ITS4組合作為引物，但在實(shí)驗(yàn)的初期，選用的引物組合為常用的ITS4與ITS5，經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ITS4與ITS5通用引物組合的PCR成功率較低，故而改變ITS序列的組合，選用了的ITS1與ITS4組合，PCR效果較好。由于此組合多被用于真菌類生物的PCR實(shí)驗(yàn)[11-12]，故實(shí)驗(yàn)易受真菌干擾，對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的選擇及實(shí)驗(yàn)操作有一定要求。但I(xiàn)TS序列的鑒別能力突出，可被用作鑒別的特征位點(diǎn)豐富，能很好鑒別目標(biāo)植物，且在不同生境中分布的種內(nèi)植物間，特征位點(diǎn)保守且穩(wěn)定，而在種間卻變異較大[13]，故可作為此5種植物最理想的鑒別片段之一。對(duì)于trnL-F序列，本實(shí)驗(yàn)中選取的5種列當(dāng)屬植物之間差異大，堿基缺失、變異和可用作于鑒別的特征信息位點(diǎn)豐富，實(shí)驗(yàn)要求相對(duì)較低，因此也可作為此5種植物的理想鑒別片段。

隨著我國民族醫(yī)藥的發(fā)展以及保健品市場(chǎng)的快速壯大，列當(dāng)屬藥用植物的使用越來越多，越來越廣泛，但市場(chǎng)上列當(dāng)屬植物的藥材魚龍混雜，以次充好的情況時(shí)有發(fā)生。到目前為止，對(duì)其鑒別一直沿用經(jīng)典的性狀鑒別、顯微鑒別及理化鑒別方法。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：DNA條形碼技術(shù)這一高效、準(zhǔn)確的分子鑒別方法可在分子水平上解決這些問題，其實(shí)用性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)可在中藥以及民族藥的鑒別和替代品的規(guī)范與發(fā)掘等方面發(fā)揮重要的作用，在藥材的正本清源工作中提供有力的技術(shù)保障，并將藥材的鑒別領(lǐng)入一個(gè)新的階段。

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StudyonIdentificationofFiveSpeciesofGenusOrobanchewithDNABarcodingTechnology

HAN Qiheng1，TANGJian1，WANGXiaoqin2*，LIMinhui1,3,4,5*

(1.BaotouMedicalCollege，Baotou014060，China；2.SchoolofPharmacy，InnerMongoliaMedicalUniversity，Hohhot010110，China；3.InnerMongoliaAutonomousRegionAcademyofChineseMedicine，Hohhot010110，China；4.InnerMongoliaResearchCenterofCharacteristicMedicinalPlantsCultivationandProtectionEngineeringTechnology，Baotou014060，China；5.InnerMongoliaKeyLaboratoryofCharacteristicTraditionalChineseMedicinalResourcesProtectionandutilize，Baotou014060，China)

Objective：To establish a rapid，accurate and standardized method for identifying five species from genusOrobanchewith DNA barcoding technology.Methods：Total DNA of 5 kinds of medicinal plants from genusOrobanchewere extracted.ITS，rbcL，trnL-F and matK gene sequence amplified by PCR.PCR product was directly sequenced，and the results were aligned and analyzed with different software (CONTIG、BioEdit、MEGA6.0) to construct the phylogeny trees.Results：The 200 complete ITS，rbcL，trnL-F and matK sequences of 5 species from genusOrobanchehave been obtained，and the length of 4 sequences region varied from 364 to 1240 bp.They were distinguished by trnL-F，ITS or matK sequence.Conclusion：RbcL sequence was not suitable to identify 5 species from the genusOrobanche，but ITS and trnL-F region could be a pretty good marker to distinguish these species，and it will be a potential molecular identification method for identifyingOrobancheplants.

Molecular identification；DNA barcoding；OrobancheL.

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260615)

] 王曉琴，教授，研究方向：中藥資源學(xué)及生藥學(xué)；E-mail：nywangxiaoqin@163.com； 李旻輝，教授，研究方向：中蒙藥資源保護(hù)與開發(fā)利用、分子生藥學(xué)；Tel：(0471)6262232，E-mail：li_minhui@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.004

2016-10-08)

*[