劉秀清，董永森，張春霞，解秀梅，傅義娟

（1.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海 湟源 812100；2.青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海 西寧 810001）

青海貴德地區(qū)豬圓環(huán)病毒2 型感染調(diào)查

劉秀清1，董永森1，張春霞1，解秀梅1，傅義娟2

（1.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海 湟源 812100；2.青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海 西寧 810001）

為了解青海貴德地區(qū)豬群中豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的感染狀況，本研究應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)采自該地區(qū)2個(gè)豬場(chǎng)的73份血清樣品進(jìn)行了PCV2抗體檢測(cè)，采用熒光PCR技術(shù)對(duì)45份豬病料樣品進(jìn)行了PCV2病毒核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示：PCV2抗體檢測(cè)的平均陽(yáng)性率為95.89%，豬病料PCV2病毒核酸檢測(cè)的陽(yáng)性率為100%。

豬圓環(huán)病毒2型；流行病學(xué)；ELISA；PCR

豬圓環(huán)病是由圓環(huán)病毒引起的豬的一種傳染病。豬圓環(huán)病毒（PCV）是圓環(huán)病毒屬的成員之一，可以分為2種血清型，即PCV1和PCV2，其中PCV2對(duì)豬的危害更大[1]。PCV2主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致感染豬免疫抑制，對(duì)其他病原的抵抗力下降，容易引起其他病毒和細(xì)菌的繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。為了有效控制該病在豬場(chǎng)的感染，就要定期對(duì)該病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，只有掌握該病在豬場(chǎng)和一個(gè)地區(qū)的發(fā)病狀況，才能采取科學(xué)的防控措施。本研究采用間接ELISA方法對(duì)采自青海省貴德地區(qū)兩個(gè)豬場(chǎng)的73份血清樣品進(jìn)行了PCV2抗體檢測(cè)，用熒光PCR技術(shù)對(duì)采集的45份豬病料樣品進(jìn)行了PCV2病毒核酸檢測(cè)。旨在了解貴德地區(qū)PCV2的流行情況，為該地區(qū)有效防控PCV2感染，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源與處理 2015年4月，從青海省貴德縣兩個(gè)豬場(chǎng)（A豬場(chǎng)和B豬場(chǎng)）采集了73份血液樣品和45份豬病料樣品（肺和淋巴結(jié)），所有的檢測(cè)樣品均于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 檢測(cè)試劑 豬圓環(huán)病毒2型抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：PCV 20150708E），豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：PCV2 20150701P），生產(chǎn)廠家為北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備 ABI7500熒光定量PCR儀，A-64R高速冷凍離心機(jī)，AC2-6S1生物安全柜，BIORAD美國(guó)伯樂(lè)iMark酶標(biāo)儀等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法進(jìn)行，具體結(jié)果判定如下：

（1）試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)符合下列條件方為有效：兩孔陰性對(duì)照OD450平均值應(yīng)≤0.15；每孔陽(yáng)性對(duì)照OD450值均≥0.60。臨界值的計(jì)算：臨界值=陽(yáng)性對(duì)照孔OD450均值×0.25。

（2）結(jié)果判定：被檢樣品OD450值＜臨界值,為PCV2抗體陰性；樣品OD450值≥臨界值，為初試PCV2抗體陽(yáng)性。初試陽(yáng)性的樣品應(yīng)再進(jìn)行雙孔復(fù)試，若任意一孔或兩孔均為陽(yáng)性，則視為PCV2抗體陽(yáng)性；若兩孔均為陰性，則視為PCV2抗體陰性。

1.4.2 豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè) 設(shè)被檢樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照總和為N,則反應(yīng)體系配制如表1所示。

表1 熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)體系

將以上反應(yīng)體系充分混勻后，分裝到每個(gè)反應(yīng)管中各18μL。分別取2μL模板DNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，混勻，并做好標(biāo)記。在熒光PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)：95℃ 2min；95℃ 5s，60℃ 35s，共 40次循環(huán)，每次循環(huán)的第二步（60℃ 35s）收集熒光信號(hào)（報(bào)告基團(tuán)“FAM”，淬滅基團(tuán)“None”）。

結(jié)果判定：陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú)Ct值且無(wú)特定擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品Ct值≤30并出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線，視為PCV2核酸陽(yáng)性；被檢樣品Ct值在30～37之間并出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線，需重新取樣提取DNA擴(kuò)增后判定，如仍是可疑，則判為陽(yáng)性；被檢樣品Ct值≥37時(shí)，超過(guò)本方法檢測(cè)靈敏度范圍，判為陰性；對(duì)于某些未呈現(xiàn)S型曲線，但本底較高的樣品，應(yīng)判為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬血清PCV2抗體檢測(cè)結(jié)果 在被檢的73份血清中，采用ELISA方法共檢出PCV2抗體陽(yáng)性血清70份，平均陽(yáng)性率為95.89%。其中A豬場(chǎng)被檢血清的PCV2抗體陽(yáng)性率為100%，B豬場(chǎng)為95.0%。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 45份豬組織病料中均檢測(cè)出PCV2病毒核酸呈陽(yáng)性，PCV2豬群陽(yáng)性率高達(dá)100%，說(shuō)明本地區(qū)豬群有PCV2感染。

3 討論

3.1 從熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果可以看出，PCV2在貴德地區(qū)的豬場(chǎng)和豬群中廣泛存在，與文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道的“PCV2感染廣泛存在于國(guó)內(nèi)豬群中”一致。高于李菊梅等[5]報(bào)道的青海省部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型感染陽(yáng)性率為47.58%（108/227）。與賴(lài)笑嫻等[6]采用熒光定量PCR方法對(duì)廣東省部分地區(qū)PCV2疑似病例進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果（陽(yáng)性率為97.9%）較為接近。這可能與檢測(cè)方法有關(guān)，因?yàn)闊晒舛縋CR的靈敏度比普通PCR的靈敏度要高很多；也可能與近幾年豬圓環(huán)病毒病發(fā)病率呈現(xiàn)暴發(fā)式增長(zhǎng)有關(guān)。

3.2 豬圓環(huán)病毒2型危害較大，往往伴隨其他一系列病毒或細(xì)菌感染。例如，可以引起豬圓環(huán)病與偽狂犬病的混合感染、豬圓環(huán)病與細(xì)小病毒病的混合感染等。PCV2感染及其引發(fā)的疾病已經(jīng)成為全球養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的一大問(wèn)題，這是繼豬繁殖與呼吸綜合征之后出現(xiàn)的又一重大生豬疫病。對(duì)豬圓環(huán)病的控制不僅要做好豬場(chǎng)的衛(wèi)生消毒工作、降低或避免應(yīng)激因素、提高飼養(yǎng)管理水平、改善斷奶仔豬營(yíng)養(yǎng)等，還要采取藥物預(yù)防方案加以控制，比如對(duì)副豬嗜血桿菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌等繼發(fā)感染的控制，最大限度地降低豬群死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失。

[1]陳薄言，王川慶.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].5版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2015：231-233.

[2]李超，魏建忠，凌英濟(jì)，等.安徽省豬圓環(huán)病毒2型感染的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22（4）：330-336.

[3]陳潔，金爾光，郭一，等.豬圓環(huán)病毒感染相關(guān)疾病及防控措施[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010，21（2）：363-364.

[4]趙樸，趙坤，李任峰，等.一株豬圓環(huán)病毒2型的分離與分子鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（7）：155-157.

[5]李菊梅，王明輝，程思樂(lè)，等.青海省部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型感染的病原學(xué)調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī)，2015，47（10）：155-156.

[6]賴(lài)笑嫻，洪偉彬，李永福，等.廣東省部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型流行病學(xué)調(diào)查[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（11下）：80-81.

Infection Survey of Porcine Circovirus Type 2 in Guide Region

Liu Xiuqing1，Dong Yongsen1，F(xiàn)u Yijuan2，et al.
（1.Qinghai Vocational and Technical College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Qinghai Huangyuan 812100；2.Animal Disease Prevention and Control Center of Qinghai Province，Qinghai Xining 810001，China）

To understand the infection situation of porcine circovirus type 2（PCV 2）in the area of Guide，PCV 2 antibody had been detected in 73 serum samples from 2 pig farms by ELISA，and viral nucleic acid of PCV 2 had been detected in 45 tissue samples by fluorescence PCR.The results showed that the average positive rate of PCV 2 antibody was 95.89%，the positive rate of pathogen tissue samples was 100%.

Porcine circovirus type 2；Epidemiology；ELISA；PCR

S852.659.2

B

1001-8964（2017）09-0032-03

2017-05-24

劉秀清（1967-）,女，河南人，教授，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)的教學(xué)與研究。