嚴(yán)鳳好 鐘展華 李雪群 萬小春

HBsAg、抗-HCV、抗-HIV酶免陰性及單試劑反應(yīng)性獻(xiàn)血者核酸檢測結(jié)果分析*

嚴(yán)鳳好 鐘展華 李雪群 萬小春

目的 通過對HBsAg、抗-HCV、抗-HIV酶免結(jié)果雙陰性及單試劑反應(yīng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行核酸檢測（NAT），分析兩種檢測方法的結(jié)果差異和鑒別試驗的反應(yīng)性項目，為假反應(yīng)性獻(xiàn)血者的歸隊提供理論依據(jù)。方法 分別用兩種酶免試劑對獻(xiàn)血者血液進(jìn)行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV血清學(xué)檢測，對酶免陰性及單試劑反應(yīng)性標(biāo)本8人份混樣進(jìn)行HBV、HCV、HIV三聯(lián)核酸定性檢測，對NAT呈反應(yīng)性的標(biāo)本進(jìn)行鑒別試驗確定反應(yīng)性的具體標(biāo)本。結(jié)果 31 065份血液標(biāo)本中酶免雙試劑陰性30254份，單試劑反應(yīng)性241份，其中進(jìn)口試劑180份，國產(chǎn)試劑61份，主要集中在HCV和HIV進(jìn)口試劑，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義；進(jìn)行8人份混樣NAT檢測共有54份呈反應(yīng)性，包括46份HBV、3份HCV、5份HIV。拆分鑒別實驗檢出39份HBV，其中ELISA陰性標(biāo)本鑒別出37份陽性，單試劑反應(yīng)標(biāo)本中鑒別出2份，未拆分出HCV、HIV陽性標(biāo)本，總拆分陽性率為72.2% 。結(jié)論 酶免單試劑反應(yīng)性結(jié)果的假陽性率較高，核酸檢測能提高對病毒的檢測能力，有效降低經(jīng)輸血途徑傳播病毒的風(fēng)險，選擇兩者互補的檢測模式，對酶免單試劑反應(yīng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行追蹤隨訪和復(fù)查，可為假反應(yīng)性獻(xiàn)血者的歸隊提供理論支撐，有利于獻(xiàn)血者的召回。

單試劑反應(yīng)性 核酸檢測 鑒別實驗

降低輸血相關(guān)病毒傳播的風(fēng)險是輸血行業(yè)乃至全醫(yī)療行業(yè)、全社會所關(guān)注的問題，核酸檢測（NAT）被公認(rèn)為是降低血清學(xué)窗口期漏檢風(fēng)險及低病毒載量檢出的最佳解決方法[1]。酶聯(lián)免疫（ELISA）方法作為我國血源篩查中普遍使用的檢測技術(shù)，在保障輸血安全方面也起到重要作用，然而，因單試劑陽性結(jié)果不確定性和假反應(yīng)性造成獻(xiàn)血者被淘汰的概率非常大。據(jù)調(diào)查顯示，全國每年因血液篩查不合格淘汰的獻(xiàn)血者約20萬人次，其中單試劑不合格淘汰的獻(xiàn)血者約10萬人次[2]。既浪費寶貴的血液資源，也損害了獻(xiàn)血者身心和名譽，甚至給其家庭帶來不必要的誤會和困擾。本文通過對HBsAg、HCV、HIV酶免結(jié)果雙陰性及單試劑反應(yīng)性獻(xiàn)血者進(jìn)行核酸檢測，分析兩種檢測方法的結(jié)果差異和鑒別試驗的反應(yīng)性項目，旨在為假反應(yīng)性獻(xiàn)血者的歸隊提供理論依據(jù)。

對象與方法

1 對象 惠州血站2016年2～7月自愿無償獻(xiàn)血者31 065名，獻(xiàn)血者均符合健康檢查要求。每位獻(xiàn)血者留取2管標(biāo)本，一管為5 ml EDTA-K2真空采血管（用于ELISA檢測），一管為5 ml EDTA-K2分離膠真空采血管（用于NAT 檢測）。NAT 管采集后4 h內(nèi)離心，在標(biāo)本采集后48 h內(nèi)完成各項檢測，不能完成的置-20℃密閉保存，并于7 d內(nèi)檢測。

2 試劑與儀器 S T A R全自動加樣儀（瑞士HAMILTON），F(xiàn)AME24/20全自動酶免分析系統(tǒng)（瑞士HAMILTON），Ampli STAR 全自動核酸提取純化儀（瑞士HAMILTON），ABI7500熒光定量PCR儀（美國ABI）。酶免試劑：乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）采用新創(chuàng)（批號2015095132）和Bio-Rad（批號20150703）；抗-HCV采用萬泰（批號CS20150806）和Ortho（批號E X E 2 5 2）；抗-H I V采用萬泰（批號I20150716）和DiaSorin（批號D363710）。核酸試劑：HIV-1RNA 、HCV RNA 、HBV DNA三聯(lián)檢核酸試劑（批號20160105）以及HIV-1 RNA、HCV RNA劑、HBV DNA 鑒別試劑均購自蘇州華益美公司（批號20160105）。所用試劑均為經(jīng)檢驗合格且在有效期內(nèi)使用；所用儀器設(shè)備均按要求進(jìn)行維護(hù)和保養(yǎng)，并確保儀器在正常工作狀態(tài)下運轉(zhuǎn)。

3 方法

3.1 酶免檢測：將標(biāo)本按要求進(jìn)行離心處理，用不同的加樣系統(tǒng)、不同的酶免分析系統(tǒng)同時檢測，按各試劑的檢測標(biāo)準(zhǔn)、操作規(guī)程進(jìn)行操作。結(jié)果以S/CO≥0.80為反應(yīng)性，兩種試劑均無反應(yīng)性的標(biāo)本判定為試劑室溫放至平衡后，使用STAR全自動加樣儀進(jìn)行全自動加樣，采用FAME 24/20全自動酶免分析系統(tǒng)進(jìn)行全自動處理。初檢采用國產(chǎn)試劑、復(fù)檢采用進(jìn)口試劑；任一種試劑有反應(yīng)性的標(biāo)本需剪血袋辮子用原試劑進(jìn)行雙孔復(fù)查，復(fù)查雙孔均無反應(yīng)性判定ELISA 陰性，否則判定ELISA 陽性。

3.2 核酸檢測：挑出酶免雙陽性標(biāo)本，對酶免陰性及單試劑陽性的標(biāo)本采用8人份樣本混和檢測模式進(jìn)行HIV-1RNA 、HCV RNA 、HBV DNA 三聯(lián)核酸檢測，無反應(yīng)性的標(biāo)本為NAT 陰性，對有反應(yīng)性的混合標(biāo)本分別進(jìn)行拆分鑒別檢測，以確定具體的陽性標(biāo)本。拆分檢測后呈反應(yīng)性的標(biāo)本判為不合格，無反應(yīng)性的標(biāo)本為合格。

4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ELISA試劑單檢陽性情況 31 065份標(biāo)本中有570份呈雙試劑陽性，241份呈單試劑反應(yīng)性，其中進(jìn)口試劑180份，國產(chǎn)試劑61份，進(jìn)口HCV和HIV試劑較高，分別為0.17%和0.28%，與國產(chǎn)試劑的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1 。

表1 2016年2～7月ELISA試劑單檢陽性情況

2 ELISA陰性與單試劑反應(yīng)性標(biāo)本NAT檢測情況剔除酶免雙陽性標(biāo)本后共有30 495份標(biāo)本進(jìn)行了8人份混樣NAT檢測，通過對反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行拆分鑒別發(fā)現(xiàn)，30 254份ELISA陰性標(biāo)本NAT鑒別出37份陽性，241份單試劑反應(yīng)標(biāo)本中鑒別出2份陽性，見表2。

表2 30 495份標(biāo)本ELISA與NAT檢測結(jié)果

3 NAT混檢陽性標(biāo)本拆分鑒別情況 30 495份標(biāo)本進(jìn)行8人份混樣NAT檢測共檢出54份反應(yīng)性，包括46份HBV、3份HCV、5份HIV。拆分鑒別實驗檢出39份HBV，總拆分陽性率為72.2% ，未拆分出HCV、HIV陽性標(biāo)本，見表3。

表3 NAT混檢陽性標(biāo)本拆分鑒別結(jié)果

討 論

2015年3月國家衛(wèi)生和計劃生育委員會在《關(guān)于做好血站核酸檢測工作的通知》中明確規(guī)定，2015年血站核酸檢測要覆蓋全國[3]。雖然近年來ELISA試劑盒的靈敏度、特異性不斷改進(jìn)，但仍然無法避免病毒感染窗口期、病毒變異、免疫沉默等因素造成的漏檢[4，5]，NAT檢測可將HBV、HCV和HIV感染的平均窗口期分別由56 d、70 d、22 d縮短為41 d、12 d和11 d[6，7]，而且不受病毒變異、個體免疫因素影響，使輸血感染相關(guān)病毒的風(fēng)險降到最低，極大程度地保障血液安全。

之前，我站采用兩種酶免試劑（一種國產(chǎn)一種進(jìn)口）對獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行檢測，開展核酸檢測后，為節(jié)約成本，選擇一種酶免試劑聯(lián)合一種核酸試劑進(jìn)行檢測，然而，該保留何種試劑必須經(jīng)過可靠的評估。從實驗結(jié)果來看，ELISA試驗的假陽性率還是較高，尤其是本站目前所使用的HCV和HIV進(jìn)口試劑，與國產(chǎn)試劑的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），除了與試劑的靈敏度有關(guān)外，還可能由以下因素引起[8]：標(biāo)本溶血、脂血或血漿中存有纖維蛋白等物質(zhì)；加樣或洗板過程中出現(xiàn)交叉污染或拖帶現(xiàn)象；不同生產(chǎn)廠家使用的抗原抗體原料不同；人體內(nèi)其他非病毒抗體的干擾等。HIV使用第四代試劑后，增加了P24抗原檢測，靈敏度大大提高；同時，由于部分正常人血清可能存在對P24抗原檢測造成干擾的物質(zhì)，導(dǎo)致陽性率較高。因試劑原因出現(xiàn)假陽性結(jié)果造成血液報廢，提示應(yīng)該選用高質(zhì)量試劑進(jìn)行檢測。核酸檢測方面，2016年2～7月，排除雙陽性血樣后，本站共有30 495份標(biāo)本進(jìn)行8孔混樣NAT檢測，檢出54例反應(yīng)性，拆分確認(rèn)后共鑒別出39例HBV DNA（30 254份ELISA陰性中檢出37例，241份ELISA單陽性中檢出2例），HBV DNA的拆分陽性率為84.8%，未拆分出HCV RNA和HIV RNA，總拆分陽性率為77.2%，高于程衛(wèi)芳等報道的59%[9]和田耘博等報道的37%[10]，可能與所選試劑及處理方法有關(guān)。有研究表明，HBV、HCV病毒經(jīng)9.6倍超濃縮處理后，含量分別是原有含量的5.92±1.98倍和4.7±1.43倍，有利于提高NAT檢測靈敏度和提高篩查反應(yīng)性標(biāo)本的鑒別陽性率[11]。本研究中酶免陰性標(biāo)本HBV DNA 的檢出率為1.21‰（37/30 414），比重慶[10]、南京[12]等地區(qū)略高，與廣東地區(qū)乙肝流行率高有關(guān)，本站開展NAT檢測后至少規(guī)避了1/818的輸血感染HBV風(fēng)險。

從實驗結(jié)果可以看出，NAT在降低經(jīng)輸血傳播病毒的風(fēng)險中發(fā)揮舉足輕重的作用，特別是對于HBV的傳播，與血清學(xué)的“補漏”效果較好，與國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)論相一致[13，14]。ELISA與NAT兩種方法檢測的病毒標(biāo)志物不同，各標(biāo)志物在外周血中存在時間亦有差別，提示這兩種檢測技術(shù)均可能出現(xiàn)漏檢和假陽性，二者聯(lián)合應(yīng)用篩查血液更能提高血液安全性。對于HBsAg、HCV、HIV 項目ELISA單試劑陽性的獻(xiàn)血者，建議采供血機構(gòu)對其進(jìn)行追蹤，讓其進(jìn)入重新歸隊程序，24周后再次采血進(jìn)行ELISA和NAT檢測[15]，結(jié)果均為陰性者可重新歸于獻(xiàn)血者隊伍進(jìn)行獻(xiàn)血，結(jié)果仍為單試劑陽性的獻(xiàn)血者可以通過確證試驗來鑒別，確證試驗陰性的獻(xiàn)血者可進(jìn)入下一輪追蹤檢測。這一方面是對獻(xiàn)血者負(fù)責(zé)；另一方面也能最大限度地保留壯大無償獻(xiàn)血隊伍。

無償獻(xiàn)血工作任重道遠(yuǎn)，血液安全至關(guān)重要，在ELISA檢測的基礎(chǔ)上增加NAT檢測很有必要，如何結(jié)合實際情況，選擇最適合的檢測模式是各血站需要慎重考慮的問題。

1 Laperche S．Blood safety and nucleic acid testing in Europe[J]．Eurosurveill，2005，10（1）：3-4．

2 孟毓，盧濤，張艷梅，等.單試劑有反應(yīng)性獻(xiàn)血者延期并歸隊獻(xiàn)血的可行性探討[J].中國輸血雜志，2013，26（1）：70-71.

3 國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.關(guān)于做好血站核酸檢測工作的通知.國衛(wèi)辦醫(yī)發(fā)〔2015〕11號.2015.

4 許文燕，邱茂鋒，佐合拉?吐爾地，等．第四代HIV抗原抗體酶聯(lián)檢測試劑縮短HIV檢測窗口期的研究[J]．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2007，30（3）：284-287．

5 孫桂香，吳月清.1026例輸血前患者血HBsAg、抗HCV、抗HIV和梅毒抗體檢測結(jié)果分析[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2015，22（1）：18-19.

6 Busch MP．HIV，HBV，and HCV：new developments related to transfusion safety[J]．Vox Sang，2000，78（suppl2）：253．

7 謝敬文，藍(lán)文莉，黎淑貞，等.番禺地區(qū)無償獻(xiàn)血者酶免陰性樣本的核酸檢測結(jié)果分析[J]．臨床輸血與檢驗，2014，16（4）：355-357．

8 樊璐，傅穎媛. ELISA方法與NAT方法檢測HIV結(jié)果分析[J]. 江西醫(yī)藥2011，46（9）：853-855.

9 程衛(wèi)芳，段有紅，周學(xué)勇，等．2種核酸檢測平臺在與ELISA平行檢測中的應(yīng)用[J]．中國輸血雜志，2013，26（12）：1235-1237．

10 田耘博，黃霞，秦偉斐，等. 血液病毒核酸檢測單獨陽性標(biāo)本研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2015，33（6）：704-707，716.

11 王卓妍，龔曉燕，宋美蘭，等．超速離心濃縮技術(shù)富集HBV和HCV顆粒的效果研究[J]．中國輸血雜志，2012，25（12）：1295-1296．

12 黃成垠，蔣昵真，朱紹文，等. 1種血液核酸篩查系統(tǒng)的應(yīng)用評價[J].中國輸血雜志，2012，25（10）：1010-1011.

13 Candotti D，Lin CK，Belkhiri D，et a1．Occult hepatitis B infection in blood donors from South East Asia：molecular characterisation and potentialmecha nismsofoccurrence[J].Gut，2012，61（12）：1744-1753．

14 劉峭梅，覃柳. 獻(xiàn)血者血液單人份核酸檢測及血清學(xué)檢測結(jié)果的分析[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)與臨床.2014，11（1）：102-104.

15 丁衛(wèi)平，鄭拉讓，李晶. HBsAg、HCV、HIV單試劑有反應(yīng)性獻(xiàn)血者的歸隊分析及探討[J].按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué)，2015，6（21）：122-124.

Analysis of Nucleic Acid Tests in HBsAg，Anti-HCV，Anti-HIV ELISA Negative or Single Reagent Reactive Blood Donors

YAN Feng-hao，ZHONG Zhan-hua，LI Xue-qun，et al. Huizhou Blood Center，Huizhou，516000

Objective Nucleic acid tests were performed in the blood donors and compared with the results of ELISA double negative and single reagent reactive in HBsAg，Anti-HCV and Anti-HIV so as to provide a basis for distinguishing the false positive blood donors. Methods Two ELISA reagents were used to detect seral HBsAg，HCV and HIV in the donors，and 8 specimens of ELISA negative and single reagent positive samples were subjected to DNAs detections. All DNAs positive samples were identified. Results In 31 065 blood samples，30 254 cases were found to be negative with double ELISA，and 241 cases were positive with single reagent examination，among them 180 cases were detected with imported kits and 61 with domestic reagents. A significant difference was seen in different reagents. DNAs detection showed 54 positive samples including 46 HBV，3 HCV，and 5 HIV. Identification tests revealed 39 positive HBV，among them 37 and 2 cases were found from ELISA negative and single reagent positive samples，respectively. Neither HCV nor HIV was discovered and total positive rate was 72.2%.Conclusion ELISA single reagent reactive result gives rise to a high false positivity while DNAs examination may improve the efficacy of virus diagnosis. Complementaryexaminations are recommended so as to induce the risk of blood transfusion of infectious diseases.

Single reagent reactive Nucleic acid detection Identification tests

R446.61 R392.11

A

1671-2587（2017）04-0379-04

2017-01-30）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.020

*本課題受惠州市科技計劃項目資助（項目編號：2015Y125）

516000 廣東省惠州市中心血站

嚴(yán)鳳好（1980–），女，廣東惠州人，副主任技師，碩士，主要從事血液檢測和臨床輸血技術(shù)工作，（Tel）13725046736（E-mail）775443294@qq．com。