盛佳佳 劉雨生

·論著·

曲古菌素A聯(lián)合全反式維甲酸誘導(dǎo)卵巢癌SK0V-3細胞株凋亡的研究

盛佳佳 劉雨生

目的 探討TSA聯(lián)合ATRA對卵巢癌SKOV-3細胞的協(xié)同增殖抑制和凋亡作用。 方法 TSA聯(lián)合 ATRA處理卵巢癌細胞SKOV-3細胞株，分別檢測SK0V-3細胞增殖抑制情況和細胞凋亡率及相關(guān)蛋白表達變化。 結(jié)果 TSA聯(lián)合ATRA協(xié)同抑制SKOV-3細胞生長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組SKOV-3細胞凋亡率明顯升高，與對照組和單獨用藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 TSA聯(lián)合ATRA在體外對卵巢癌SKOV-3細胞具有較強的協(xié)同增殖抑制和促進凋亡作用。

曲古菌素A 全反式維甲酸 細胞凋亡 SKOV-3細胞

卵巢癌作為婦科惡性腫瘤之一，死亡率最高，隱匿性強，一旦發(fā)現(xiàn)多為晚期，手術(shù)及化療效果差，5年生存率極低[1]。目前，治療晚期卵巢癌主要方法是瘤體縮減術(shù)聯(lián)合紫杉醇、鉑類等化療藥物治療，延緩了患者的中位生存期，但是在近40年的卵巢癌治療歷程中，卵巢癌復(fù)發(fā)率、死亡率并未得到明顯改善[2]。早期研究發(fā)現(xiàn)曲古菌素A（trichostatin A，TSA）可通過調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?，抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡[3]；研究證實全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）可誘導(dǎo)胃癌細胞、 肝癌細胞、宮頸癌等多種惡性腫瘤細胞凋亡[4]。本研究探討TSA聯(lián)合ATRA對卵巢癌SKOV-3細胞株的協(xié)同凋亡作用，為臨床上卵巢癌的藥物治療提供新的方法和理論依據(jù)。

材料與方法

1 材料

1.1 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；小牛血清（四季青生物工程材料有限公司），CellTiter 96? AQueous細胞增殖試劑盒（promega）；Annexin V凋亡檢測試劑盒（ebioscience）。兔抗人BCl-2多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）；鼠抗人caspase-3單克隆抗體（碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗人磷酸化STAT3、P21及β-actin單克隆抗體（Cell Signaling）；鼠抗人p53單克隆抗體（博士德生物工程有限公司）；AC-H3、BCL-2、MCL-1、BCL-XL

1.2 實驗儀器：酶標儀為美國Anthos公司；流式細胞儀為美國BD公司； Western blot儀為Bio-Rad公司。

2 細胞培養(yǎng) 卵巢癌SKOV-3細胞在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每48小時傳代1次，細胞呈貼壁生長。

3 CellTiter 96? AQueous細胞增殖實驗 細胞增殖實驗分為A組（對照）、B組（ATRA 1 μg/ ml）、C組（TSA 200 nmol/L）組、D組（TSA 200 nmol/L +ATRA 1 μg/ml）共4組。對照組加入等量溶媒DMSO。取對數(shù)生長期的卵巢癌SKOV-3細胞接種于96孔板，分別添加藥物干預(yù)24、48、72和96 h后，每孔加入CellTiter 96?AQueous溶液20 μl，37℃、5% CO2避光孵育3 h后，上酶標儀在490 nm波長處測吸光度（D）值，根據(jù)D值計算細胞增殖抑制率。抑制率=（對照組D值–實驗組D值）/對照組D值×100%。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，取平均值。

4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將SKOV-3細胞接種于90 mm培養(yǎng)皿，各組分別加入藥物培養(yǎng)48 h后，收集細胞，加入500 μl Binding Buffer制備單細胞懸液，分別加入Annexin V-FITC和PI 試劑，避光孵育后送流式細胞儀分析細胞凋亡，檢測細胞凋亡率，實驗重復(fù)3次，計算平均凋亡率。

5 Western 印跡法檢測相關(guān)抗體的表達 將SKOV-3細胞接種于90 mm培養(yǎng)皿，各組分別加入藥物培養(yǎng)48 h后收集細胞，提取蛋白，測定蛋白濃度，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，經(jīng)脫脂牛奶封閉1 h，一抗4℃孵育過夜；二抗室溫孵育2 h，采用化學(xué)發(fā)光法顯影15～60 min，Actin作為等量上樣的標準。

6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TSA與ATRA聯(lián)合可抑制卵巢癌SKOV-3細胞增殖CellTiter 96? AQueous細胞增殖實驗檢測A、B、C、D共4組的SKOV-3細胞生長情況。結(jié)果證實：與對照組和ATRA（1 μg/ml）組相比，TSA（200 nmol/L）對SKOV-3細胞的抑制增殖作用明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而TSA（200 nmol/ L）聯(lián)合ATRA組優(yōu)于VPA、ATRA 單獨用藥組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。見圖1。2 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果 FCM法檢測結(jié)果顯示，TSA聯(lián)合ATRA用藥組的細胞凋亡率為7.79%，與對照組0.09%、TSA組2.71%、ATRA組2.52%相比，細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。ATRA組與TSA組相比，細胞凋亡率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ATRA組和TSA組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。3 TSA聯(lián)合ATRA作用后乙?；暗蛲鱿嚓P(guān)蛋白的表達變化 Western blot 檢測結(jié)果顯示，SKOV-3細胞經(jīng)TSA聯(lián)合ATRA處理48 h后，P53、P21、AC-H3、active-caspase-3蛋白表達較單獨用藥組升高，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而與對照組比較，TSA與ATRA聯(lián)合用藥組的P-sat-3、BCL-2、MCL-1、BCL-XL蛋白表達有所下降，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

圖1 曲古菌素A聯(lián)合全反式維甲酸處理后SKOV-3細胞的生長曲線（n=4）

圖2 曲古菌素A聯(lián)合全反式維甲酸對SKOV-3細胞凋亡的影響

圖3 TSA聯(lián)合ATRA對SKOV-3細胞中P53、P21、P-sat-3、AC-H3、BCL-2、MCL-1、BCL-XL activecaspase-3蛋白表達的影響

討 論

組蛋白的乙酰化和去乙?；钦{(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄的重要修飾，在正常情況下，組蛋白的乙?；叭ヒ阴；跈C體細胞內(nèi)存在動態(tài)平衡，控制著染色體的結(jié)果和基因表達[5]。目前研究證實組蛋白乙?；叭ヒ阴；胶馕蓙y與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系。組蛋白去乙酰化酶抑制劑可調(diào)節(jié)基因表達，包括一些腫瘤抑制基因，從而發(fā)揮抗癌效應(yīng)[6]。TSA作為HDACIS中重要成員之一，可顯著抑制HDAC活化，對結(jié)腸癌、前列腺癌和甲狀腺癌等多種惡性腫瘤細胞均有增殖抑制及促進凋亡作用[7]。ATRA是新型的腫瘤誘導(dǎo)分化藥物，目前研究報道較多，兩種藥物聯(lián)合抗腫瘤，對很多腫瘤細胞系有較好的促凋亡作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)TSA聯(lián)合ATRA對卵巢癌SKOV-3細胞具有較強的增殖抑制和協(xié)同凋亡作用；周虎等研究證實TSA聯(lián)合ATRA對宮頸癌細胞株具有協(xié)同誘導(dǎo)凋亡作用；在此基礎(chǔ)上，本研究選擇TSA藥物濃度為TSA 200 nmol/L和ATRA 1 μg/ml[8]。本研究亦證實TSA（200 nmol/L）聯(lián)合ATRA（1 μg/ml）組在卵巢癌SKOV-3細胞增殖抑制實驗中優(yōu)于TSA、ATRA單獨用藥組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。胡軼等研究證實低劑量曲古菌素A聯(lián)合硼替佐米作用于人卵巢癌細胞系能協(xié)同誘導(dǎo)凋亡，協(xié)同作用遠大于相同劑量單獨用藥組[9]。本研究應(yīng)用流式凋亡試劑盒檢測，證實TSA和ATRA的聯(lián)合誘導(dǎo)卵巢癌細胞株的凋亡作用，其聯(lián)合用藥組的細胞凋亡率為7.79%，與對照組、TSA組、ATRA組相比，細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。證實TSA聯(lián)合ATRA對卵巢癌SKOV-3細胞株具有協(xié)同促進細胞凋亡的作用。

組蛋白高乙?；谷旧|(zhì)呈開放狀態(tài)，是轉(zhuǎn)錄活化所必需的條件之一。本實驗中TSA聯(lián)合ATRA明顯上調(diào)組蛋白H3（AC-H3）的表達，提示聯(lián)合用藥可明顯提高腫瘤細胞的乙?；Ｑ芯孔C實乙?；揎椏烧{(diào)控抑癌基因 p53、P21、P-STAT3 等表達[10]。P53基因具有監(jiān)視基因組的完整性和修復(fù)DNA 損傷的作用[11]。HDACs可以嚴格調(diào)控p53乙?；饔?，用TSA處理后細胞內(nèi)乙?；痯53的比例明顯增高。p21是分化相關(guān)基因，位于p53基因下游，可以和 p53 共同構(gòu)成細胞周期G1檢查站，阻斷周期素依賴性激酶活性，對細胞生長阻滯發(fā)揮重要作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；敢种苿⊿uberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）提高p21基因相關(guān)的染色質(zhì)乙?；M蛋白的表達[13]。本研究中經(jīng)TSA和ATRA聯(lián)合處理后，Western Blot方法檢測卵巢癌SKOV-3細胞中p53、p21蛋白的表達明顯升高，可能通過提高p53、p21的表達，抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞的凋亡。Stat-3與細胞的增殖、分化、凋亡、血管新生及腫瘤免疫逃避等密切相關(guān)，Stat-3通路持續(xù)激活可導(dǎo)致細胞異常增殖和惡變。Huang等研究發(fā)現(xiàn)Stat3在卵巢癌細胞系中持續(xù)激活表達升高，阻斷Stat3的高表達可抑制 CyclinD1 蛋白的表達[14]。本研究證實TSA聯(lián)合ATRA抑制了P-stat-3的表達，提示TSA與ATRA的協(xié)同作用可能是通過下調(diào)P-stat-3的表達來調(diào)控卵巢惡性腫瘤細胞的增殖和凋亡。

細胞凋亡是維持機體在細胞數(shù)量上動態(tài)平衡的機制之一，惡性腫瘤的細胞凋亡往往與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān) ，通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡 ，可抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展 。細胞凋亡主要涉及的蛋白有Caspase 家族蛋白、BCL-2家族蛋白。目前主要研究的BCL-2家族蛋白包括BCL-2、MCL-1、BCL-XL等[15]。Caspase家族共有14個成員，研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤細胞的凋亡中存在Caspase的活化，參與多種與凋亡有關(guān)的生理和病理過程。Caspase 家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者是Caspase-3[16]。本研究證實TSA聯(lián)合ATRA顯著下調(diào)了BCL-2、MCL-1、BCL-XL的表達，提高Caspase-3活性，促進卵巢癌SKOV-3細胞的凋亡。綜上所述，TSA聯(lián)合ATRA對SKOV-3細胞具有協(xié)同促進細胞凋亡的作用，其相關(guān)的協(xié)調(diào)凋亡機制增強了卵巢癌SKOV-3的乙酰化作用，上調(diào)了AC-H3表達，并進一步上調(diào)P53、P21、activecaspase-3蛋白表達水平，下調(diào)P-sat-3、BCL-2、MCL-1、BCL-XL蛋白表達水平。同時這一協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細胞作用為卵巢癌的治療提供了新的方法，值得進一步研究探索。

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（本文編輯：王虹）

Trichostatin A Combined with All-trans Retinoic Acid Induce Apoptosis in Human Ovarian Cancer Cell Line SKOV-3

SHENG Jia-jia，LIU Yu-sheng. Anhui Women and Child Health Care Hospital，HeFei，230001

Objective To investigate the apoptotic effect on human ovarian cancer cells by both Trichostatin A（TSA）and all-trans retinoic acid（ATRA）and synergistic effect. Methods SKOV-3 cells were treated by different group of TSA and ATRA. The inhibitory rate of proliferation and the apoptosis rate were examined. Western blot was introduced to evaluate the protein expression levels. Results The proliferation of SKOV-3 cells was significantly suppressed by TSA combined with ATRA and the difference was significant compared with other groups （P＜0.05）. The apoptosis rate of combination group was higher than that of other groups and the difference was significant （P＜0.05）. Conclusion TSA combination with ATRA induces cytotoxicity in ovarian cancer cells in vitro，and the effect was much more significant than other groups.

Trichostatin A All-trans retinoic acid Cell apoptosis SKOV-3 cells

R984 R737.31

A

1671-2587（2017）04-0321-04

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.003

230001 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院，安徽省婦幼保健院

盛佳佳（1985–），女，安徽合肥人，醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤及生殖醫(yī)學(xué)研究工作，（E-mail）sheng13956942890@163.com。

劉雨生，男，主任醫(yī)師，主要從事生殖醫(yī)學(xué)與內(nèi)分泌學(xué)研究，（E-mail）shengzhizhongxin@126.com。（Santa Cruz）。辣根酶標記二抗（北京中杉金橋公司）。TSA和ATRA（Sigma）用二甲基亞砜（DMSO）稀釋，–20℃保存。

2017-01-28）