楊慧慧 張衡 蘇虹

CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞在哮喘小鼠發(fā)病中的作用*

楊慧慧 張衡 蘇虹

目的 探討CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+FOXP3+Treg）百分比的改變?cè)谙∈蟀l(fā)病中的作用。方法 將雌性SPF級(jí)Balb/c 小鼠20只隨機(jī)分為哮喘模型組、正常對(duì)照組，哮喘模型組以雞卵白蛋白（OVA）致敏，建立模型；正常對(duì)照組以生理鹽水代替OVA。分別檢測(cè)小鼠外周血（PB）與肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量及脾臟中CD4+CD25+FOXP3+Treg的比例。結(jié)果 哮喘組與對(duì)照組小鼠脾臟中CD4+CD25+/CD4+（%）、CD4+FOXP3+/ CD4+（%）、CD4+CD25+FOXP3+/CD4+（%）分別為2.50±0.12與16.64±2.11、3.92±1.23與27.72±0.15、1.34±0.25與15.60±0.62，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。哮喘小鼠脾臟CD4+CD25+FOXP3+Treg占比較正常對(duì)照組明顯減少。結(jié)論研究提示CD4+CD25+FOXP3+Treg參與哮喘發(fā)病。

哮喘 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 FOXP3

材料與方法

1 材料 雞卵白蛋白（OVA，GradeV，Sigma），氫氧化鋁干粉（北京化工廠），0.9%生理鹽水（南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司），小鼠CD4+CD25+Treg 細(xì)胞分選試劑盒、CD4–APC、CD25–PE、 FOXP3–FITC 單克隆抗體及同型對(duì)照、破膜劑、固定劑購(gòu)自BioLegend 公司、RPMI1640培養(yǎng)液（北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司），超聲波霧化器 WH 2000型（廣東粵華醫(yī)療器械有限公司），流式細(xì)胞儀（森西科技有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與模型制備

2.1.1 動(dòng)物分組：20只SPF 級(jí)雌性 Balb/ c小鼠6～8 周，平均體重20 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室（安徽省立醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）普通飼料喂養(yǎng)。將20只小鼠隨機(jī)分為2組，每組各10只。

2.1.2 配制OVA混懸液和霧化液：稱取500 μg OVA 和0.5 g Al（OH）3粉末，溶于5 ml生理鹽水，配制OVA 混懸液 （pH ：7.4）；另稱取0.8 g OVA 粉末，溶于40 ml生理鹽水，配成 2% OVA生理鹽水溶液。

2.1.3 建模過程

2.1.3.1 Balb/c 小鼠哮喘組：參照文獻(xiàn)[10，11]，將Balb/c鼠在第 0（實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天）、7、14天分別進(jìn)行腹腔內(nèi)注射OVA混懸液 0.2 ml，此為抗原致敏階段；在第15～20天，將小鼠放入霧化吸入箱，通過超聲波霧化器霧化吸入 2% OVA生理鹽水溶液（1次/d，每次20 min，共 6 d），此為霧化激發(fā)階段（霧化動(dòng)力為 5 L/min 的壓縮空氣）。

2.1.3.2 Balb/c小鼠對(duì)照組：在相應(yīng)的時(shí)間，以生理鹽水代替OVA混懸液及2%OVA生理鹽水溶液，按照同樣方法分別進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入。

2.2 外周血（PB）、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）計(jì)數(shù)

2.2.1 Balb/c鼠眼球放血1 ml，取20 μl抗凝血加入l ml白細(xì)胞計(jì)數(shù)液混勻，顯微鏡下計(jì)數(shù)白細(xì)胞；余下的以4℃、2 000 r/min，離心10 min，沉淀

物涂片備瑞氏-吉姆薩染色行嗜酸細(xì)胞（EOS）計(jì)數(shù)，所有細(xì)胞計(jì)數(shù)均由一名研究者完成，采用單盲法。

2.2.2 于主支氣管下段約1 cm進(jìn)行右肺肺泡灌洗后收集液體，4℃、1 500 r／min 離心10 min。將重懸液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)；取余下重懸液直接涂片，瑞氏-吉姆薩染色行EOS計(jì)數(shù)。

2.3 肺組織病理切片：采集肺組織標(biāo)本用10%甲醛固定、切片、HE染色，顯微鏡下觀察組織病理變化。

2.4 小鼠脾臟中Treg細(xì)胞百分比的檢測(cè)

2.4.1 采用頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，用 200 目篩網(wǎng)研磨，用RPMI1640培養(yǎng)液過濾收集細(xì)胞懸液。取1 ml細(xì)胞懸液，加于2 ml淋巴細(xì)胞分離液，離心。收集第二層細(xì)胞，即環(huán)狀乳白色層，以PBS 洗滌2次，每次均以1 600 r/ min，離心10 min，取沉淀物進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.4.2 取1.0×106個(gè)/ml分離的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞置于試管中；每管加入20 μl CD4 APC/CD25 PE混合液，震蕩混勻，室溫避光孵育20 min；加入細(xì)胞染色液1 ml，250 g、5 min離心，棄上清；在染色前準(zhǔn)備好濃度為（1×）的FOXP3 Fix/Perm buffer和 FOXP3 Perm buffer工作液；每個(gè)試管中加入1 ml（1×）FOXP3 Fix/Perm，震蕩混勻，室溫下避光孵育20 min，靜置，棄上清液；加入細(xì)胞染色緩沖液1 ml，250 g、5 min離心，棄上清液；加入1 ml FOXP3 Perm buffer洗滌細(xì)胞；在殘余液體中重懸細(xì)胞，加入1 ml FOXP3 Perm buffer，室溫避光孵育15 min，靜置，棄上清；加入100 μl 1×FOXP3 Perm buffer，加入5 μl Alexa Fluor ?488 anti-mouse FOXP3 抗體或5 μl Alexa Fluor ?488 anti-mouse IgG1，K同型對(duì)照置試管中，室溫避光孵育30 min；用細(xì)胞染色液洗滌2次，并將細(xì)胞重懸置0.5 ml細(xì)胞染色緩沖液中，置 FACS 檢測(cè)管，上機(jī)檢測(cè) CD4、CD25和FOXP3的表達(dá)情況。3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS17.0軟件，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Flow-jo 7.6軟件對(duì)流式細(xì)胞檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1 各組小鼠行為學(xué)改變 哮喘組小鼠出現(xiàn)明顯的煩躁不安，呼吸急促，腹肌抽搐，毛發(fā)豎起，大小便失禁；而生理鹽水對(duì)照組小鼠無明顯異常表現(xiàn)。

表1 PB與BALF 中細(xì)胞總數(shù)和分類細(xì)胞的比較

2 PB、BALF中EOS% 哮喘組PB、BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞百分率均高于對(duì)照組（見表1）。

3 小鼠肺組織病理改變 與對(duì)照組比較，哮喘組肺組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，肺泡壁變粗，且可見大量炎性細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）浸潤(rùn)；對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，周圍無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，無明顯的炎癥改變（見圖1）。

圖1 小鼠肺組織病理學(xué)改變HE染色（400×）

4 小鼠脾臟中Treg細(xì)胞百分比的檢測(cè) 哮喘組CD4+CD25+FOXP3+/CD4+為2.49%，對(duì)照組CD4+CD25+FOXP3+/CD4+為16.40%，兩組小鼠脾臟中Treg細(xì)胞的百分比檢測(cè)結(jié)果見圖2。哮喘模型組小鼠脾臟中CD4+CD25+/CD4+、CD4+FOXP3+/ CD4+、CD4+CD25+FOXP3+/CD4+均較正常對(duì)照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

圖2 兩組小鼠脾臟組織Treg細(xì)胞的流式檢測(cè)結(jié)果

表2 兩組小鼠脾臟中Treg細(xì)胞的比較

討 論

支氣管哮喘是多種細(xì)胞（包括炎性細(xì)胞、呼吸道結(jié)構(gòu)細(xì)胞）和細(xì)胞組參與的、一種以呼吸道高反應(yīng)性和慢性過敏性炎癥為主要特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠脾臟中CD4+CD25+、CD4+FOXP3+、CD4+CD25+FOXP3+占C D 4+細(xì)胞比例均明顯下降，表明哮喘小鼠CD4+CD25+FOXP3+Treg 細(xì)胞占比降低在哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞最初表達(dá)為CD4+CD25+T細(xì)胞，維持體內(nèi)平衡和自我免疫的耐受性[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+T細(xì)胞不一定提示免疫抑制作用，敲除小鼠FOXP3基因后的 CD4+CD25+T細(xì)胞并沒有免疫活性，僅是細(xì)胞激活的標(biāo)志[6]。

FOXP3特異性表達(dá)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞表面，與人類和鼠科動(dòng)物的T細(xì)胞群的抑制功能密切相關(guān)，反映CD4+CD25+Treg細(xì)胞的水平和功能[13，14]。CD4+CD25+FOXP3+Treg具有的免疫耐受功能，可以通過細(xì)胞間接觸和分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫抑制，抑制其他活化T 細(xì)胞對(duì)抗原發(fā)生活化增殖反應(yīng)，也可以通過接觸抑制和分泌 IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β （TGF-β） 等抑制性細(xì)胞因子及調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞 （DC） 功能來維持機(jī)體的免疫耐受[15，16]，本研究所獲結(jié)果提示CD4+CD25+FOXP3+Treg在哮喘發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

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（本文編輯：王虹）

CD4+CD25+FOXP3+ Regulatory T cells in Asthmatic Mice

YANG Hui-hui，ZHANG Hen，SU Hong.
Department of Epidemiology and Health Statistics，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei 230032

Objective To observe the change of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells （Tregs） in mouse model of asthma.Methods A total of 20 Balb/c female SPF-class mice were randomly divided into normal control group（n=10） and asthma model group （n=10）.The asthma model group was sensitized with 2% ovalbumin （OVA） by a combination of intraperitoneal injection to induce asthma.Mice of normal control group received normal salineinstead of OVAin equal volume.The counts of eosinophils in peripheral blood （PB）and bronchoalveolar lavage fluid （BALF）weredetected.The number of Tregs in mouse spleens was analyzed.Results The numbers of CD4+CD25+/CD4+（%），CD4+FOXP3+/CD4+（%），and CD4+CD25+FOXP3+/CD4+（%） in mouse spleens in asthma and normal control groups were 2.50±0.12 vs.16.64±2.11，3.92±1.23 vs.27.72±0.15，and 1.34±0.25 vs.15.60±0.62，respectively，showing significant differences （P＜0.05）.Conclusion The proportion of CD4+CD25+FOXP3+ cells in asthma mice was decreased compared to controls，suggesting that tregsmay be involved in asthma pathogenesis.

Asthma Regulatory T Cell FOXP3

R562.2+5 R392.11

A

1671-2587（2017）04-0317-04

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.002

*本課題受安徽省自然科學(xué)基金（No.1408085MH159）資助

230032 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系

楊慧慧（1989–），女，安徽淮南人，碩士，主要從事慢性病分子流行病學(xué)研究，（Tel）15256926304（E-mail）yhh20130528@163.cm。

蘇虹，女，教授，（E-mail）suhong5151@sina. com。究應(yīng)用雞卵白蛋白（OVA）誘導(dǎo)建立小鼠哮喘模型的方法，旨在探討CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。

2017-03-19）

支氣管哮喘是由免疫功能紊亂引起的一種慢性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[1]。先前研究主要認(rèn)為Th2占優(yōu)勢(shì)的 Th1/Th2 失衡是哮喘發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制，并且成為治療和預(yù)防哮喘的關(guān)注熱點(diǎn)[2]，但這一理論并不能完全解釋哮喘的發(fā)病。近年來發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了完善和補(bǔ)充，其可能通過抑制 Th2 型反應(yīng)及嗜酸粒細(xì)胞增多而發(fā)揮效應(yīng)[3]。Treg作為一類具有負(fù)免疫調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群，細(xì)胞表面標(biāo)志物CD4+CD25+為主要細(xì)胞群[4]。CD4+CD25+T細(xì)胞是一種天然Treg，具有免疫無反應(yīng)性和免疫抑制性。但是，有研究提示CD4+CD25+T并非一定在哮喘鼠中發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，來源于脊椎動(dòng)物叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子家族（forkhead box，F(xiàn)OX）的FOXP3，其缺陷的 Scurfy 小鼠不能產(chǎn)生有功能的Treg細(xì)胞，提示FOXP3是Tregs 發(fā)育所必需的[6]。FOXP3被認(rèn)為是Treg細(xì)胞中最具特異性的表面標(biāo)志分子，對(duì)Treg細(xì)胞的分化及功能發(fā)揮起到?jīng)Q定性作用[7-9]。本研