杜江華，黃國(guó)欣，李彥芳，李桂森，王 賽，劉大森,2*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

3種來源兼性纖維素分解菌與固氮菌混合對(duì)體外發(fā)酵的影響

杜江華1，黃國(guó)欣1，李彥芳1，李桂森1，王 賽1，劉大森1,2*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

本試驗(yàn)選取分離自瘤胃液、土壤、飼料中的3株高酶活性的兼性厭氧纖維素分解菌（L6、T1、S4）和3株低酶活性的兼性厭氧纖維素分解菌（L4、T4、S1），分別與自瘤胃內(nèi)取提的1種兼性厭氧固氮菌（C5）以4:1混合，形成6種混合菌（記為L(zhǎng)6、T1、S4、L4、T4、S1），通過體外培養(yǎng)試驗(yàn)來探討其對(duì)體外發(fā)酵的影響。試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組7個(gè)重復(fù)。向每個(gè)注射器內(nèi)裝入200 mg發(fā)酵底物（精:粗=45:55），與1 mL的混合菌液（對(duì)照組加入1 mL滅活的菌液）將培養(yǎng)液加至30 mL，進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)。發(fā)酵時(shí)間為24 h，分別記錄2、4、8、12、24 h的產(chǎn)氣量，測(cè)定發(fā)酵指標(biāo)。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組對(duì)產(chǎn)氣量、pH、氨態(tài)氮（NH3-N）、菌體蛋白（MCP）、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）及濾紙纖維素酶活性均有顯著影響（P＜0.05），其中L4試驗(yàn)組對(duì)VFA、NH3-N及濾紙纖維素酶活等影響效果最好；與高酶活試驗(yàn)組相比，低酶活試驗(yàn)組對(duì)產(chǎn)氣量、pH、VFA濃度及NH3-N濃度有顯著影響（P＜0.05），對(duì)MCP濃度和濾紙纖維素酶活性沒有顯著影響（P＞0.05）。由此可見，添加的混合菌對(duì)體外發(fā)酵有明顯促進(jìn)作用，其中L4試驗(yàn)組對(duì)體外發(fā)酵的影響效果最好；低酶活性的兼性纖維素分解菌對(duì)體外發(fā)酵的促進(jìn)作用比高酶活性的兼性纖維素分解菌好。

兼性纖維素分解菌；兼性固氮菌；體外發(fā)酵；奶牛

反芻動(dòng)物瘤胃能高效地利用秸稈、羊草等粗飼料，并作為其主要的能量來源，主要因?yàn)榱鑫竷?nèi)存在大量分解粗纖維的纖維素分解菌。瘤胃纖維素分解菌 大多數(shù)是嚴(yán)格厭氧菌，也存在兼性厭氧纖維素分解菌和兼性厭氧固氮菌。李昊[1]從奶牛瘤胃中分離到21株兼性纖維素分解菌和23株兼性厭氧固氮菌。王炳曉[2]以嚴(yán)格厭氧和需氧2種方式在奶牛瘤胃內(nèi)共篩選出63株兼性厭氧纖維素分解菌。本實(shí)驗(yàn)室前期通過體外培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將分離自瘤胃液的兼性厭氧纖維素分解菌和固氮菌混合添加，對(duì)瘤胃內(nèi)環(huán)境有一定的調(diào)節(jié)作用，并提高了飼料的降解率。然而兼性厭氧纖維素分解菌是瘤胃內(nèi)固有的，還是從外界進(jìn)入，目前很少有人研究。由于瘤胃對(duì)于飼料是個(gè)“開放”的環(huán)境，一些兼性厭氧纖維素分解菌和固氮菌可能隨飼料進(jìn)入瘤胃。推測(cè)在采食后一定時(shí)間內(nèi)的有氧環(huán)境中，兼性厭氧菌可能對(duì)發(fā)酵起到了一定作用。本試驗(yàn)選取1種從瘤胃液中分離的兼性厭氧固氮菌和從瘤胃液、土壤、飼料3種來源分離的兼性厭氧纖維菌，將2種菌混合添加，探討其對(duì)體外發(fā)酵的影響。基于本研究中的兼性厭氧菌可能在采食后一定時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用，則本研究最長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間確定為24 h。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株的來源及混合菌的制備 試驗(yàn)選用的菌株包括本實(shí)驗(yàn)室前期分離自瘤胃液、土壤、飼料中的3株高酶活性兼性厭氧纖維素分解菌（L6、T1、S4）、3株低酶活性兼性厭氧纖維菌（L4、T4、S1），分離自瘤胃內(nèi)的1株兼性厭氧固氮菌（C5）。菌株酶活性見表1。菌液與30%甘油以1:1比例混合，保存在-20℃的冰箱中。將所選取的菌株從冰箱中取出、解凍，然后進(jìn)行復(fù)活、增殖培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的6個(gè)纖維素分解菌和固氮菌混合（比例為4:1），制成6種混合菌，分別記為L(zhǎng)4、S1、T4、L6、S4和T1。

表1 菌株酶活性 U/mL

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)選用3頭體重為（500±25）kg、體況良好并安裝永久瘤胃瘺管的干奶期荷斯坦奶牛。奶牛日糧以精粗比為45:55制成TMR混合日糧，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分按照NRC（2001）奶牛營(yíng)養(yǎng)需要量進(jìn)行配制，每日飼喂2次（06:00和18:00），自由飲水。日糧配方及營(yíng)養(yǎng)成分見表2。

表2 基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.1.3 發(fā)酵裝置 發(fā)酵裝置包括HZS-H 型恒溫水浴搖床（水溫和振蕩速率均可調(diào)）和容積為100 mL的玻璃注射器（最小刻度為1 mL）組成，注射器口安有帶塑料管的橡皮塞，用于密封發(fā)酵管，塑料管上帶有可調(diào)開關(guān)。注射器每次使用之前須洗凈、烘干，然后用少量液體石蠟涂在活塞筒的四周，以防漏氣，并可減少氣體產(chǎn)生過程中活塞向上移動(dòng)的阻力。

1.1.4 試驗(yàn)試劑 在晨飼后2 h采集3頭瘺管牛瘤胃不同位點(diǎn)的瘤胃液，立即放入充有CO2保溫瓶?jī)?nèi)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)4層紗布過濾，用于配制Menke等[3]培養(yǎng)液。

Menke等[3]培養(yǎng)液的配制參照隋美霞[4]的方法。瘤胃液與人工培養(yǎng)液以1:2的比例制成發(fā)酵培養(yǎng)液，測(cè)得初始pH為7.34。

1.1.5 試驗(yàn)底物 試驗(yàn)底物為奶牛飼喂TMR混合日糧（精:粗=45:55），將其烘干磨碎，混合均勻，過40目篩備用。

1.2 試驗(yàn)方法及測(cè)定指標(biāo) 體外發(fā)酵采用Menke等[3]方法，在體外發(fā)酵裝置中進(jìn)行，試驗(yàn)包括6個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組7個(gè)重復(fù)（即7個(gè)注射器）。向每個(gè)處理組的注射器內(nèi)裝入200 mg（精確到0.000 1 g）發(fā)酵底物（精:粗=45:55）和1 mL的混合菌液（混合菌添加量為1.2×109CFU/mL，用平板計(jì)數(shù)法確定菌量，向?qū)φ战M中加入1 mL滅活的混合菌液），并迅速加入培養(yǎng)液至30 mL，進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)。在發(fā)酵2、4、8、12、24 h記錄產(chǎn)氣量。發(fā)酵結(jié)束后，將注射器內(nèi)全部培養(yǎng)物取出，并立即用pH計(jì)（METTLER TOLEDO Delta320）測(cè)定pH，然后將培養(yǎng)物以3 500 r/min離心15 min，上清液分別裝入不同的離心管中，放置-20℃冰箱冷凍保存，待測(cè)氨態(tài)氮（NH3-N）、菌體蛋白（MCP）、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）和濾紙纖維素酶活性等。其中，NH3-N參照馮宗慈[5]的方法進(jìn)行測(cè)定；根據(jù)瘤胃微生物的嘌呤所占比例不變，因此用嘌呤法[6]測(cè)定MCP濃度；參照秦為琳[7]的方法，采用直接進(jìn)樣的氣相色譜分析方法，快速、準(zhǔn)確地分析瘤胃液中VFA的含量；參照張瑞萍[8]的方法進(jìn)行測(cè)定濾紙纖維素酶活。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件初步整理，結(jié)果處理采用SAS9.1版軟件，采用GLM模型行單因素方差分析和均值多重比較SNK法，以P＜0.05為差異顯著，試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合菌對(duì)產(chǎn)氣量的影響 由表3可見，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的產(chǎn)氣量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；低酶活試驗(yàn)組的產(chǎn)氣量顯著高于高酶活試驗(yàn)組（P＜0.05）。

2.2 混合菌對(duì)pH的影響 由表4可見，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，pH均有顯著影響（P＜0.05）；低酶活性試驗(yàn)組的pH高于高酶活試驗(yàn)組（P＜0.05）。

2.3 混合菌對(duì)NH3-N和MCP的影響 由表4可見，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組NH3-N和MCP濃度均有顯著提高（P＜0.05）。T1試驗(yàn)組的MCP最高，NH3-N濃度較低；L4、L6試驗(yàn)組的MCP濃度相對(duì)較高，其對(duì)應(yīng)的NH3-N濃度也高；低酶活性試驗(yàn)組NH3-N濃度較高酶活試驗(yàn)組顯著升高（P＜0.05），而對(duì)MCP濃度沒有明顯影響（P＞0.05）。

2.4 混合菌對(duì)纖維素酶活的影響 由表4可見，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的濾紙纖維素酶活性均有顯著提高（P＜0.05），其中L4試驗(yàn)組最高。低酶活性試驗(yàn)組與高酶活試驗(yàn)組活相比無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 混合菌對(duì)VFA的影響 由表4可見，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）濃度有顯著提高（P＜0.05），L4試驗(yàn)組的TVFA濃度最高，T1試驗(yàn)組最低；除T1試驗(yàn)組，其他組的乙酸/丙酸均大于3；低酶活性試驗(yàn)組TVFA濃度較高酶活試驗(yàn)組相有顯著提高（P＜0.05）。

表3 纖維素分解菌和固氮菌混合對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響 mL

表4 纖維素分解菌和固氮菌對(duì)體外發(fā)酵各指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 混合菌對(duì)產(chǎn)氣量的影響 瘤胃內(nèi)產(chǎn)氣量的多少與日糧的消化率呈正相關(guān)，一般認(rèn)為產(chǎn)氣越多，發(fā)酵效果越好[9]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在加入混合菌后產(chǎn)氣量明顯提高，此結(jié)果與張文璐等[10]研究一致，說明該混合菌對(duì)體外發(fā)酵有一定的促進(jìn)作用。低酶活性試驗(yàn)組的產(chǎn)氣量高于高酶活組，其原因可能是低纖維酶活性混合菌對(duì)體外發(fā)酵的促進(jìn)作用優(yōu)于高纖維酶活性混合菌。

3.2 混合菌對(duì)pH的影響 瘤胃內(nèi)的pH能體現(xiàn)出日糧在瘤胃內(nèi)發(fā)酵的狀況[11]。一般認(rèn)為瘤胃pH的正常范圍在5.5～7.5。研究表明，纖維分解菌對(duì)瘤胃pH的變化比較敏感，當(dāng)瘤胃pH低于6.2時(shí)其生長(zhǎng)將會(huì)受到抑制[12]。本試驗(yàn)pH維持在7.02～7.16，總體上偏高一些，但屬于正常變化范圍，也沒有對(duì)人工瘤胃酸堿內(nèi)環(huán)境造成不良影響，這在生產(chǎn)應(yīng)用中具有非常重要的意義。

3.3 混合菌對(duì)NH3-N和MCP的影響 瘤胃內(nèi)的微生物可以利用游離的NH3-N、氨基酸等合成MCP，但過高或過低濃度的NH3-N對(duì)MCP的合成有抑制作用[13]。研究表明，微生物生長(zhǎng)對(duì)NH3-N濃度耐受的臨界范圍為6～30 mg/dL[14]。本試驗(yàn)NH3-N濃度在20.56～25.06 mg/dL，是利于微生物生長(zhǎng)的范圍；各試驗(yàn)組的MCP濃度均高于對(duì)照組，說明該混合菌對(duì)MCP的合成有一定促進(jìn)作用；試驗(yàn)組中L4、L6的NH3-N和MCP濃度都較高，可能是因?yàn)樘砑拥幕旌暇诹鑫肝⑸锏脑鲋?，使MCP濃度變高從而間接地增加了NH3-N濃度，結(jié)果與姜艷美等[15]結(jié)果一致；T1試驗(yàn)組的MCP濃度最高，NH3-N濃度較低，其原因可能是該組混合菌促進(jìn)了瘤胃微生物對(duì)NH3-N的利用使之合成MCP，導(dǎo)致MCP濃度上升、NH3-N濃度下降；另外，低酶活性試驗(yàn)組NH3-N濃度較高酶活性試驗(yàn)組更高一些，這可能是由于低酶活性的纖維素分解菌與固氮菌組合更有利于體外發(fā)酵，從而使NH3-N濃度升高。

3.4 混合菌對(duì)纖維素酶活的影響 瘤胃微生物中有大量降解纖維素的酶系和降解機(jī)制，能分泌出各種酶，這些酶可以將纖維物質(zhì)分解成VFA等物質(zhì)參與機(jī)體代謝[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，除S1混合菌組外，其他試驗(yàn)組的濾紙纖維素酶活性均有明顯提高，其原因可能是纖維素分解菌與固氮菌混合起了協(xié)同作用，從而使濾紙纖維素酶的活性得到提高。另外，低酶活與高酶活的混合菌組濾紙纖維素酶的活性沒有差異，其原因可能是這些菌所分泌的酶都是對(duì)纖維素進(jìn)行分解的酶，作用基本相同。

3.5 混合菌對(duì)VFA的影響 VFA 是反芻動(dòng)物能量利用的主要形式，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，占瘤胃發(fā)酵VFA總產(chǎn)量的95%[17]。據(jù)報(bào)道，向日糧中添加纖維素分解菌能夠使瘤胃中的VFA含量增加[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，除T1、S4試驗(yàn)組外，其他各組的TVFA濃度均有提高，說明加入的混合菌有利于微生物的發(fā)酵，進(jìn)而產(chǎn)生更多的VFA，這與黃麗敏等[19]的結(jié)果一致；L4試驗(yàn)組TVFA濃度最高，可能是L4纖維素分解菌分離自瘤胃內(nèi)，對(duì)發(fā)酵環(huán)境更加適應(yīng)，所以對(duì)發(fā)酵起到了更好的促進(jìn)作用。當(dāng)乙酸/丙酸在3以下，屬于丙酸型發(fā)酵，而大于3為乙酸型發(fā)酵。本試驗(yàn)中除T1試驗(yàn)組外，其他各組乙酸/丙酸都在3以上，說明該發(fā)酵類型屬于乙酸型發(fā)酵；另外，低酶活試驗(yàn)組TVFA濃度顯著高于高酶活性試驗(yàn)組，說明低酶活混合菌較高酶活混合菌對(duì)體外發(fā)酵的促進(jìn)作用更好。

4 結(jié) 論

從本試驗(yàn)可得出，添加的混合菌對(duì)體外發(fā)酵有明顯促進(jìn)作用，其中L4試驗(yàn)組對(duì)體外發(fā)酵的影響效果最好；低纖維素酶活性的兼性纖維混合菌對(duì)體外發(fā)酵的促進(jìn)作用比高纖維素酶活性的兼性纖維混合菌好。

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Ef f ects of Three Sources of Facultative Bacteria Cellulose Mixed with Nitrogen-f i xing Bacteria on in Vitro Fermentation

DU Jiang‐hua1, HUANG Guo‐xin1, LI Yan‐fang1, LI Gui‐sen1, WANG Sai1, LIU Da‐sen1,2*

(1.College of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University, Heilongjiang Harbin 150030, China; 2. College of Science, Northeast Agricultural University, Heilongjiang Harbin 150030, China)

In this trial, 3 strains with high activity of facultative anaerobic cellulolytic bacteria (L6, T1, S4)and 3 strains of low enzyme activity of facultative anaerobic cellulolytic bacteria (L4, T4, S1)which were isolated from rumen fl uid, soil and feed, respectively. Then individually mixed them with the same nitrogen‐f i xing bacteria in 4: 1 ration (marked separately L6, T1, S4, L4, T4, S1), their ef f ect on in vitro fermentation was studied by in vitro culture. The study was divided into 6 experimental groups, 1 control groups, each group with 7 replicates. Each syringe was put into 200 mg of the fermentation substrate (The ratio of concentrate to roughage = 45:55), and 1 mL of mixed bacteria (1 mL of the inactivated bacteria was added to the control group), Finally, the culture medium was added to 30 mL, in vitro fermentation. The fermentation time was 24 h, and the gas production was recorded at 2, 4, 8, 12 and 24 h, respectively. the results based on the determination of fermentation index showed that the experimental group indicated signif i cant dif f erence (P＜0.05) on the gas production, pH, ammonia nitrogen (NH3‐N), protein (MCP), volatile fatty acids (VFA) and cellulase activity compared with the control group. The L4 test group showed the best ef f ect on VFA, NH3‐N and cellulase activity compared with others; meanwhile, low fiber enzyme group had significant difference (P＜0.05) on the gas production, pH, VFA, NH3‐N concentration compared with high enzyme activity group, however, MCP and cellulase activity was not signif i cantly dif f erence (P＞0.05) between them. The results showed that the addition of culture of mixed bacteria has a signif i cant ef f ect on in vitro fermentation, the ef f ect of L4 test group on in vitro fermentation was the best. The low cellulase activity of facultative fi brils is better for in vitro fermentation than synergistic fi brils with high cellulase activity.

Facultative cellulose‐decomposing bacteria; Facultative azotobacteriar; In vitro fermentation; Cows

S823.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-09-109

2016-12-26；

2017-04-11

國(guó)家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-37）

杜江華（1991-），男，黑龍江牡丹江人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物生產(chǎn)方面研究，E-mail: 35181233@qq.com

* 通訊作者：劉大森 (1961-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉雌c動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料，E-mail: dasenliu@neau.edu.cn