歐陽佳良，吳天弋，王夢芝*，侯啟瑞

（1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212018）

精料中桑葉粉添加水平對育肥湖羊瘤胃發(fā)酵及纖維降解菌的影響

歐陽佳良1，吳天弋1，王夢芝1*，侯啟瑞2

（1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212018）

本試驗旨在研究精料中不同添加水平的桑葉粉對育肥湖羊瘤胃發(fā)酵及纖維降解菌的影響。采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計，將40只3月齡、體重（16.5±0.6）kg、健康狀況良好的育肥公湖羊分為5組，每組8只羊，以全株玉米青貯作為粗飼料，分別飼喂含桑葉粉比例為0%（對照組）、15%（T15）、30%（T30）、45%（T45）、60%（T60）的不同精料，采取區(qū)組試驗設(shè)計進行飼養(yǎng)試驗，預(yù)試2周、正試8周。結(jié)果表明：與對照組相比，精料中添加適量比例的桑葉粉明顯提高了總揮發(fā)性脂肪酸濃度；T15、T30組的乙酸濃度和乙酸/丙酸均高于對照組（P＜0.05）；另外，該兩組的乙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸濃度皆高于T60組（P＜0.05）。除黃色瘤胃球菌以及T30組的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌外，替代桑葉粉后各組的纖維分解菌相對含量都高于對照組，并且T45組的溶纖維丁酸弧菌與嗜淀粉瘤胃桿菌相對數(shù)量高于其他各組（P＜0.05）。綜上表明，精料中添加適量比例的桑葉粉能夠促進湖羊瘤胃纖維類物質(zhì)的發(fā)酵，并以45%比例的桑葉粉效果較好。

桑葉粉；育肥湖羊；瘤胃發(fā)酵；纖維降解菌

我國桑樹資源豐富，桑葉中富含碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)以及天然活性物質(zhì)等，作為新型飼料資源具有很好的發(fā)展前景[1]。湖羊是世界著名的羔皮品種，具有生長發(fā)育快、成熟早、繁殖力高等優(yōu)點[2]。不僅如此，湖羊肉富含蛋白質(zhì)而膽固醇與脂肪含量低，是消費者廣泛消費的畜肉產(chǎn)品之一[3]。最近幾年，圍繞著桑葉的營養(yǎng)成分、價值以及對反芻動物的營養(yǎng)飼喂試驗進行了大量的研究。Todaro等[4]將蘇拉干草與桑葉按照不同比例混合飼喂母羊，結(jié)果表明母羊更喜歡采食桑葉，而且適當(dāng)比例桑葉粉可以增加母羊奶產(chǎn)量。Tan等[5]研究發(fā)現(xiàn)，桑葉能夠顯著提高婆羅門雜交牛干物質(zhì)采食量和瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮水平。瘤胃是反芻動物最主要的消化器官之一，成年反芻動物主要通過瘤胃微生物合成微生物蛋白，以提供能量和蛋白質(zhì)。目前，桑葉粉對湖羊瘤胃發(fā)酵和微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響研究較少。因此，本試驗以3月齡育肥湖羊為試驗動物，飼喂含有不同水平桑葉粉的精料，研究桑葉粉對湖羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)及其纖維素降解相關(guān)細(xì)菌的影響，為桑葉粉在反芻動物中的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計 2015年7月選取40只3月齡健康狀況良好、體重（16.5±0.6）kg的育肥公湖羊，按隨機區(qū)組試驗設(shè)計隨機分成5組，每組8只羊，以全株玉米青貯作為粗飼料，參照NRC（2007）羊營養(yǎng)需要量推薦值[6]，按照日增重200 g/d配制桑葉粉含量比例分別為0%（對照組）、15%（T15）、30%（T30）、45%（T45）、60%（T60）的精料（表1），并分別飼喂各欄試驗羊只，試驗包括預(yù)試2周，正試期8周。

表1 精料飼料配方組成及營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 飼養(yǎng)管理與樣品采集 試驗羊采取群飼舍養(yǎng)方式，試驗前對羊舍進行清理與消毒后，所有羊只統(tǒng)一進行驅(qū)蟲和免疫。試驗前3周全株玉米青貯按每天每只羊1.5 kg投料，之后按1.75 kg投料。試驗各組精料投飼方案：第1周每天每只羊補飼375 g精料，隨后每周增加25 g直至第8周試驗結(jié)束。試驗期間每天飼喂2次（07:00和17:00），先粗后精，自由飲水。

樣品采集：在第7周末，晨飼后3 h自各欄隨機選取3只試驗羊，每只羊利用負(fù)壓原理經(jīng)口腔抽取瘤胃液約10 mL。用4層滅菌紗布過濾后，采用上海雷磁pHS-3C型精密pH計立即測定pH，之后將濾液分裝在3個5 mL的滅菌離心管中，其中1個保存在-20℃冰柜中待測氨氮、微生物蛋白（MCP）以及揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度，另兩個立即放入液氮罐中，帶回實驗室并保存在-80℃冰箱中，用于瘤胃微生物細(xì)菌定量測定。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 氨氮濃度和MCP測定 采用苯酚-次氯酸鈉比色法[7]測定氨氮濃度；采用嘌呤法[8]測定瘤胃液中MCP濃度。

1.3.2 VFA含量測定 瘤胃液解凍后，經(jīng)15 000 × g離心10 min后取上清液1 mL加0.2 mL 20%含60 mmol/L巴豆酸（內(nèi)標(biāo)物）的偏磷酸，混勻后再次離心取上清液0.4 μL采用氣相色譜法測定VFA濃度[9]。日本島津GC-14B氣相色譜儀測定條件：毛細(xì)管柱CP-WAX（長30 m，內(nèi)徑0.53 mm，膜厚1 μm）；氣化室溫度200℃，氫火焰檢測器（FID）溫度200℃；初始溫度100℃，按3℃/min升溫至150℃；靈敏度設(shè)置為101，衰減為25。

1.3.3 瘤胃液微生物細(xì)菌數(shù)量測定 瘤胃液解凍后，采用糞便基因組提取試劑盒（Tiangen生物科技有限公司）提取瘤胃液微生物總DNA。采用超微量分光光度計（NanoDrop-1000，美國賽默飛世爾科技公司）檢測總DNA的濃度和純度（OD260/280和OD260/230），用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質(zhì)量后將DNA放置在-20℃冰箱中保存待用。在GenBank上查找瘤胃細(xì)菌16S rDNA序列，然后利用DNAStar中MegAlign進行序列比對，尋找種內(nèi)保守區(qū)域，利用Primer express 5.0軟件進行引物設(shè)計，并通過GenBank中Blast檢測引物特異性。所測定細(xì)菌及內(nèi)參Bacterial-U的引物信息見表2。

以表2所示Bacterial-U為內(nèi)參，利用羅氏Light Cycler 96和ABI 7500型PCR定量儀進行熒光定量PCR分析后采用相對定量法[10]對目標(biāo)細(xì)菌進行定量測定。每只羊每個瘤胃液樣品安排3個平行，20 μL PCR擴增反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火和延伸34 s并采集熒光信號，共40個循環(huán)；熔解曲線分析，以0.1℃/s的速度從60℃升至95℃，60℃和95℃各保溫15 s，每升0.1℃采集1次熒光。目的基因相對定量采用2-ΔΔCt法計算[10]，以Bacterial-U為內(nèi)參，計算目標(biāo)細(xì)菌的相對數(shù)量，并利用對照組基因進行校正[11]。熒光定量PCR基因相對表達量表示成目的基因相對于對照基因的倍數(shù)。

表2 瘤胃細(xì)菌實時定量PCR引物及其序列

1.4 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)首先采用Excel 2013進行初步整理，再根據(jù)SAS 9.2的一般線性模型（GLM程序）進行分析，采用Tukey檢驗進行多重比較，并應(yīng)用正交多項式模型分析線性增加日糧精料中桑葉粉添加水平與各對應(yīng)指標(biāo)的關(guān)系（線性或二次回歸曲線），差異顯著水平判斷標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，差異極顯著水平判斷標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 對育肥湖羊瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響 由表3可知，日糧添加桑葉粉對瘤胃pH、原蟲、細(xì)菌以及MCP的含量影響差異不顯著。T45與T60兩組氨氮濃度低于對照組（P＜0.01）。MCP隨精料中桑葉粉含量增加呈現(xiàn)線性下降（P＜0.05）。

如表4所示，T15、T30組總VFA濃度高于T60組（P=0.05）；T60組乙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸的濃度低于T15、T30組的濃度（P＜0.05），T60組戊酸的濃度低于對照組及T15組（P＜0.05），丙酸濃度各組之間差異不顯著；T15、T30以及T45組乙酸/丙酸高于對照組（P＜0.05）（與對照組相比，T45增加了12.19%）。戊酸濃度隨桑葉粉含量增加呈線性下降（P＜0.05）。

2.2 對育肥湖羊瘤胃液微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響 由表5可知，精料中替代不同比例的桑葉粉顯著影響本研究所測定的纖維素降解菌的含量，除黃色瘤胃球菌以及T30組的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌外，替代桑葉粉后各組纖維分解菌相對含量都高于對照組。其中，T60組的產(chǎn)琥珀酸擬桿菌相對含量顯著高于對照組（P＜0.05）；溶纖維丁酸弧菌與嗜淀粉瘤胃桿菌相對含量次序都是T45＞T60＞T15＞T30＞對照組。另外，黃色瘤胃球菌的相對含量隨精料中桑葉粉含量的增加呈線性下降（P＜0.01），而白色瘤胃球菌則與之相反（P＜0.01）。

3 討 論

3.1 精料添加桑葉粉對育肥湖羊瘤胃pH和氨氮的影響 瘤胃pH是瘤胃內(nèi)環(huán)境重要指標(biāo)之一，它是唾液中緩沖鹽、瘤胃食糜VFA及VFA隨食糜流出情況等條件共同作用的結(jié)果[12]。本次研究結(jié)果顯示，不同水平桑葉粉精料對瘤胃pH沒有顯著性影響。說明在本試驗條件下，在精料中添加一定水平的桑葉粉對湖羊瘤胃液酸堿緩沖能力沒有影響。氨氮是瘤胃微生物生長所需要的主要氮源，很多瘤胃細(xì)菌能夠以氨為主要氮源和一些簡單的肽類和游離氨基酸合成MCP，但瘤胃氨氮濃度不宜過高或過低。本試驗結(jié)果與李昊幫等[13]研究結(jié)果類似，即一定桑葉粉添加水平對山羊瘤胃內(nèi)氨氮濃度沒有影響。說明精料中添加適量的桑葉粉不會影響瘤胃中氨氮的分解和利用能力，即精料中可以使用一定水平的桑葉粉替代常規(guī)的蛋白質(zhì)飼料源，且適宜的桑葉粉添加比例為15%～30%。另外，雖然各組瘤胃氨氮濃度都處于最佳范圍內(nèi)，但是當(dāng)精料中添加桑葉粉的量超過45%時，瘤胃氨氮濃度卻比對照組和15%、30%桑葉粉添加組都低，而且在一定范圍內(nèi)，桑葉添加量越高，氨氮濃度越低，可能是因為桑葉粉中纖維素的分解吸收作用阻礙了瘤胃對氨氮的吸收與轉(zhuǎn)化。3.2 精料中桑葉粉水平對瘤胃MCP的影響 MCP是反芻動物最主要的氮源供應(yīng)來源，不僅可以反映微生物綜合利用氨氮的能力，還能反映出瘤胃中微生物種群的數(shù)量。本研究結(jié)果顯示，在精料中添加4種不同水平的桑葉粉均能夠在一定程度上提高原蟲蛋白、細(xì)菌蛋白以及MCP的含量，且當(dāng)添加桑葉粉比例為15%時MCP含量達到最高水平；而隨著桑葉粉添加量的升高，MCP含量降低。由于氨氮濃度與MCP的變化趨勢類似，即隨著桑葉粉添加量的增加，氨氮和MCP含量均有所降低。所以本試驗中MCP含量的降低可能是因為桑葉粉替代常規(guī)蛋白質(zhì)飼料后飼料氮的釋放速率會有所降低或者飼料中微生物可利用氮源的量降低所導(dǎo)致。

表3 日糧不同水平桑葉粉對湖羊瘤胃發(fā)酵pH、氨氮濃度和MCP的影響

表4 日糧不同水平桑葉粉對湖羊瘤胃發(fā)酵VFA的影響

表5 日糧不同桑葉粉添加水平對湖羊瘤胃微生物細(xì)菌相對定量的影響

3.3 精料中桑葉粉水平對瘤胃VFA的影響 VFA能提供反芻動物主要的能量需要，對于反芻動物生命活動具有重要意義。瘤胃液VFA包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸，根據(jù)乙、丙、丁酸相對比例可以將瘤胃發(fā)酵類型分為乙酸、丙酸、丁酸發(fā)酵，乙酸/丙酸可以用來表示瘤胃發(fā)酵類型的變化。從本試驗的結(jié)果可以看出，精料中添加桑葉粉對瘤胃液中TVFA、乙酸、丁酸比例有明顯影響，其中T15、T30組TVFA、乙酸、丁酸比例明顯高于其他各組，說明精料中添加適量的桑葉粉能夠有效地增強瘤胃發(fā)酵能力，該結(jié)果與李昊幫等[13]在湘東黑山羊上的研究結(jié)果相一致。另外，T15、T30、T45組乙酸/丙酸顯著高于對照組。原因可能是因為桑葉粉的添加使瘤胃微生物慢速發(fā)酵飼料中纖維物質(zhì)的能力增強，促使更多的乙酸產(chǎn)生，最終使發(fā)酵類型轉(zhuǎn)向乙酸型。

3.4 精料添加桑葉粉對育肥湖羊瘤胃纖維降解菌的影響 瘤胃主要依靠瘤胃微生物轉(zhuǎn)化利用粗飼料中的碳水化合物和蛋白質(zhì)而提供反芻動物所需能量，其中纖維分解菌發(fā)揮著重要的作用，而桑葉粉中含有大量的纖維素和蛋白質(zhì)。瘤胃中的纖維降解菌主要包括產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和一些溶纖維丁酸弧菌[14]。白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌均能產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶，其中主要是木聚糖酶。產(chǎn)琥珀酸擬桿菌纖維分解活性很高，但不能降解木聚糖，其純培養(yǎng)菌具有很強的降解結(jié)構(gòu)性堅韌物質(zhì)（如秸稈）的能力，能夠降解一些產(chǎn)琥珀酸擬桿菌所不能降解的某些同質(zhì)異晶體纖維素[15]。大多數(shù)溶纖維丁酸弧菌具有異構(gòu)化、氫化不飽和脂肪酸的功能，這對于纖維降解菌的保護和共軛亞油酸的合成至關(guān)重要。

本試驗中除黃色瘤胃球菌外，試驗組的各菌相對數(shù)量都高于對照組，可能是因為桑葉粉中纖維素或者某些天然活性物質(zhì)能夠促進瘤胃蠕動并且改善育肥湖羊的瘤胃發(fā)酵環(huán)境，從而促進育肥湖羊瘤胃中產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌數(shù)量增多，增強瘤胃對粗纖維的轉(zhuǎn)化利用。并且從T45、T60組的白色瘤胃球菌與溶纖維丁酸弧菌相對數(shù)量可以看出纖維降解菌的數(shù)量不與桑葉粉含量呈正比，適當(dāng)比例的桑葉含量能更好地促進某些纖維降解菌的生長繁殖。

4 結(jié) 論

綜上，以全株玉米青貯作為粗飼料，精料中添加15%～45%的桑葉粉提高了湖羊瘤胃發(fā)酵的TVFA和乙酸/丙酸；而且添加45%的桑葉粉提高了瘤胃白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌相對數(shù)量，表明了添加桑葉粉能夠促進瘤胃纖維類物質(zhì)的發(fā)酵，并以45%比例的桑葉粉效果較好。

致謝：非常感謝南京農(nóng)業(yè)大學(xué)皮宇博士對試驗研究方法指導(dǎo)和論文修改的幫助。特別感謝泗陽偉禾湖羊養(yǎng)殖基地提供試驗場地與試驗動物。

[1] 杜周和,劉俊鳳,左艷春,等.桑葉的營養(yǎng)特性及其飼料開發(fā)利用價值[J].草業(yè)學(xué)報, 2011, 20(5): 192‐200.

[2] 田松, 張應(yīng)飛. 淺析湖羊的特點和養(yǎng)殖技術(shù)[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘, 2015, 31(8):77.

[3] 朱霞云, 倪俊芬, 陳前嶺. 日糧中添加不同脂肪酸制劑對2～3月齡湖羊肌肉理化指標(biāo)的影響[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報, 2016, 37(1):27‐30.

[4] Todaro M, Bonanno A,Tornambè G, et al. Utilization of mulberry leaves (Morus latifolia cv. Kokusou 21) in diets for dairy ewes[J]. Ital J Anim Sci, 2010, 8(2s):438.

[5] Tan N D, Wanapat M, Uriyapongson S, et al. Enhancing mulberry leaves meal with urea by pelleting to improve rumen fermentation in cattle[J]. Asian Austral J Anim Sci, 2012, 25(4):452‐461.

[6] National Research Council. Nutrient Requirements of Small Ruminants[M]. Washington:National Academy Press, 2007:246‐266.

[7] Weatherbum M W. Phenol‐hypochlorite reaction for determination of ammonia[J]. Anal Chem, 1967, 39(8):971‐974.

[8] Wang M, Wang H, Cao H, et al. Ef f ects of limiting amino acids on rumen fermentation and microbial community in vitro[J]. Agric Sci China, 2008, 7(12):1524‐1531.

[9] Fujihara T, Maeda S, Matsui T, et al. The ef f ort of treated (spray‐dried) beef‐tallow supplementation on feed digestion, ruminal fermentation and fat nutrition in sheep[J]. Anim Feed Sci Technol, 1996, 67(1):14‐23.

[10] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real‐time PCR quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod[J]. Methods, 2001, 25(4): 402‐428.

[11] Denman S E, Mcsweeney C S. Development of a real‐time PCR assay for monitoring anaerobic fungal and cellulolytic bacterial populations within the rumen[J]. FEMS Microbiol Ecol, 2006, 58(3):572‐582.

[12] 馮仰廉, 李勝利, 張曉明. 奶牛和肉牛飼糧淀粉和葡萄糖的營養(yǎng)調(diào)控及其評定的建議[J].動物營養(yǎng)學(xué)報, 2008, 20(1):115‐122.

[13] 李昊幫, 曾佩, 李晟, 等. 桑葉粉對湘東黑山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報, 2016, 37(1):19‐25.

[14] 劉開朗, 王加啟, 卜登攀. 2008—2009年反芻動物營養(yǎng)研究進展I.瘤胃微生物多樣性與功能[J].中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37(2):5‐14.

[15] 劉大程, 盧德勛, 侯先志, 等. 不同品質(zhì)粗飼料日糧對瘤胃發(fā)酵及主要纖維分解菌的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41(4):1199‐1206.

Ef f ect of Dietary Mulberry Leaf Powder Addition on Rumen Fermentation and Cellulytic Bacteria in Fattening Hu Sheep

OUYANG Jia‐liang1, WU Tian‐yi1, WANG Meng‐zhi1*, HOU Qi‐rui2
(1. College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Jiangsu Yangzhou 225009, China; 2. Sericulture Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Jiangsu Zhenjiang 212018, China)

This experiment aimed to explore the ef f ects of dif f erent levels of mulberry leaf powder in dietary concentrate on rumen fermentation and cellulytic bacteria in fatting Hu Sheep. Forty health male Hu Sheep (16.5±0.6 kg) aged three month, were randomly divided into 5 groups, with 8 per group. The whole‐plant silage corn were used as coarse fodder, the dietary concentrate respectively included 0% (control group), 15% (T15), 30% (T30), 45% (T45), and 60% (T60) of mulberry leaf powder. The randomized block design was introduced for the feeding experiment comprising 2‐week adaption and 8‐week experimental period. Compared with thecontrol group, using moderate mulberry leaf powder to the concentrate could improve the concentration of the total VFA, and the concentration of acetic acid and the ratio of acetic acid to propionic acid in groups T15 and T30 were higher than these incontrol group (P＜0.05), the concentrations of acetic acid, butyrate, isobutyric acid, isovaleric acid in groups T15, and T30 were higher than these in groups T60 (P＜0.05). Moreover, compared withcontrol group, except for Ruminococcus fl avefaciens and group T30’s Fibrobacter succinogenes, the relative amount of cellulytic bacteria were signif i cantly increased after adding mulberry leaf powder into concentrate, and the relative amount of Butyrivibrio fi brisolvens and Ruminobacter amylophilus in group T45 were higher than those in other groups (P＜0.05). Adding moderate mulberry leaf powder to concentrate could promote the Hu sheep’s rumen fermentation of fi ber material, especially when the mulberry leaf powder content in concentrate was 45%.

Mulberry leaf powder; Hu Sheep; Rumen fermentation; Cellulytic bacteria

S827.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-09-075

2016-08-16；

2016-11-14

江蘇省2016年蘇北專項（富民強縣：BN2016096）項目；揚州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（x2015694、x2015693）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-22）

歐陽佳良（1996-），男，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)，E-mail:2856847623@qq.com ；同等貢獻作者：吳天弋（1996-），男，江蘇蘇州人，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)，E-mail: 822405317@qq.com

* 通訊作者：王夢芝，博士，副教授，E-mail: mengzhiwangyz@ 126.com