高圣玥，黃宣凱，王佳輝

（黑龍江省畜牧研究所，黑龍江齊齊哈爾 161005）

杜洛克和長(zhǎng)白公豬精子活力與畸形率動(dòng)態(tài)變化的研究

高圣玥*，黃宣凱，王佳輝

（黑龍江省畜牧研究所，黑龍江齊齊哈爾 161005）

本文旨在研究杜洛克和長(zhǎng)白公豬精液稀釋后精子活力和畸形率的動(dòng)態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)選取杜洛克和長(zhǎng)白公豬各20頭，采集新鮮精液并使用BTS稀釋液進(jìn)行常規(guī)稀釋，檢測(cè)稀釋后0～96 h 9個(gè)時(shí)間點(diǎn)精液精子活力和畸形率。結(jié)果表明：豬精液稀釋0 h精子活力最高，隨后逐漸降低，2個(gè)品種豬精液稀釋72 h后，精子活力出現(xiàn)快速下降，精子畸形率顯著升高（P ＜0.05），杜洛克公豬精液稀釋后72 h畸形率（11.1%）、84 h畸形率（13.1%）顯著高于長(zhǎng)白豬（10.6%、11.8%）（P＜0.05），這可能暗示長(zhǎng)白豬精液的適宜保存時(shí)間要長(zhǎng)于杜洛克，但考慮繁殖性能方面，兩品種豬精液稀釋后保存時(shí)間不應(yīng)超過72 h為宜。

杜洛克；長(zhǎng)白豬；精子活力；精子畸形率；動(dòng)態(tài)變化

隨著豬精液液態(tài)保存技術(shù)的發(fā)展，豬人工授精技術(shù)在養(yǎng)豬生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[1]。常溫液態(tài)精液保存（17～25℃）與低溫（0～5℃）和冷凍（-79～-190℃）保存方式相比，可以提高母豬受胎率和窩產(chǎn)仔數(shù)，有利于良種公豬遺傳資源的利用[2]，具有費(fèi)用低和操作程序簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[3]。豬精液常溫保存的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB23238-2009）要求精液在稀釋保存3 d后的精子活力不低于0.6、精子畸形率不高于0.1。但常溫保存精液的保存時(shí)間不穩(wěn)定，受公豬品種、精液品質(zhì)、稀釋液[4-5]及采精技術(shù)等多因素影響，使得人工授精技術(shù)在一定區(qū)域內(nèi)較難實(shí)現(xiàn)大范圍推廣。因此，豬精液常溫保存時(shí)間越來越受到重視。

杜洛克和長(zhǎng)白豬在國(guó)內(nèi)外三元雜交中常作第一父本和雜交終端父本，且在篩選豬最優(yōu)雜交組合中被廣泛地應(yīng)用，因此杜洛克和長(zhǎng)白公豬精液稀釋與適宜保存時(shí)間的研究顯得尤為重要。目前，關(guān)于常溫保存下杜洛克與長(zhǎng)白公豬精液活力和畸形率動(dòng)態(tài)變化的研究報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究杜洛克與長(zhǎng)白公豬精液稀釋后精子活力和畸形率的動(dòng)態(tài)變化及其差異，探討兩品種公豬精液常溫保存的適宜時(shí)間，為養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中杜洛克和長(zhǎng)白豬精液合理保存與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)豬群與飼養(yǎng)管理 實(shí)驗(yàn)豬為黑龍江省畜牧研究所種豬場(chǎng)提供，選取2～4歲、采精時(shí)間在6個(gè)月以上、精液品質(zhì)沒有不良記錄的杜洛克、長(zhǎng)白種公豬各20頭。種公豬單圈飼養(yǎng)在陽光充足，通風(fēng)良好的圈舍內(nèi)，并配有專門取暖用的設(shè)備。保持圈舍清潔干燥、冬暖夏涼。豬舍內(nèi)濕度一般控制在65%左右，溫度在18～22℃，不超過26℃。種公豬每天運(yùn)動(dòng)0.5～1.0 h，增加體質(zhì)，強(qiáng)壯四肢，防止蹄病的發(fā)生。

1.2 數(shù)據(jù)采集

1.2.1 精液的采集與稀釋 每日早上飼喂1 h后采用手握法采精。選擇色澤和氣味正常、精子活力在0.8以上，密度為3×108～5×108個(gè)/mL的精液[6]。采用商品化的丹麥亞衛(wèi)Beltsville-TS（BTS）豬精液稀釋粉作為常溫保存的稀釋液，將采集的2個(gè)品種種公豬精液按照2∶1的比例，緩慢地將等溫稀釋液加入精液中，輕輕搖晃混勻。用10層紗布包裹緩慢降溫5～10 min，使精液的溫度降至17℃，并置于17℃精液保存箱中保存。每隔12 h搖動(dòng)精液1次，從0 h開始每隔12 h檢測(cè)精子活力和畸形率，直至稀釋后96 h停止。

1.2.2 精子活力的檢測(cè) 精子活力的測(cè)定采用目測(cè)法。從恒溫箱中取出常溫保存精液，用移液槍吸取30μL置于載玻片上，蓋上蓋玻片后立即在200～400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。每個(gè)樣品隨機(jī)觀察3個(gè)視野，檢測(cè)視野中直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占總精子數(shù)的比例，求其平均值作為精子活力。

1.2.3 精子畸形率檢測(cè) 精子畸形率檢測(cè)采用Giemsa染色法。吸取10 μL的原精均勻涂抹在載玻片上，自然晾干，然后用95%酒精固定30 min，自然晾干；再用Giemsa溶液染色2 h，沖洗干凈并自然晾干。然后在顯微鏡（400×）下觀察精子形態(tài)，計(jì)數(shù)200個(gè)精子，同時(shí)記錄畸形精子和正常精子，計(jì)算畸形精子占總精子數(shù)的百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 用Excel軟件繪制不同時(shí)間點(diǎn)精子活力和畸形率的動(dòng)態(tài)變化曲線，對(duì)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行回歸分析，采用曲線估計(jì)法建立二次回歸模型；應(yīng)用SAS 9.0 軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)差異顯著用P＜0.05表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜洛克和長(zhǎng)白公豬原精液品質(zhì) 如表1所示，杜洛克和長(zhǎng)白公豬原精液精子密度、活力、畸形率符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。其中，長(zhǎng)白公豬射精量顯著高于杜洛克公豬（P＜0.05），而長(zhǎng)白公豬精子密度顯著低于杜洛克公豬（P＜0.05），2個(gè)品種精子活力與畸形率無顯著差異（P＜0.05）。

2.2 兩品種豬精液精子活力與畸形率動(dòng)態(tài)變化 如表2所示，兩品種豬精子活力都隨著稀釋時(shí)間的增加逐漸降低，精液稀釋后0～72 h試驗(yàn)期內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)杜洛克豬精子活力均高于長(zhǎng)白豬，其中，精液稀釋后12 h杜洛克豬精子活力顯著高于長(zhǎng)白豬（P＜0.05），其他各時(shí)間點(diǎn)間兩品種無顯著性差異（P＞0.05）；兩品種豬精子畸形率都隨著稀釋時(shí)間的增加逐漸升高，精液稀釋后12 h杜洛克豬精子畸形率顯著低于長(zhǎng)白豬（P＜0.05），而精液稀釋后84 h杜洛克豬精子畸形率顯著高于長(zhǎng)白豬（P＜0.05）。

表1 杜洛克和長(zhǎng)白豬原精液品質(zhì)分析（n=20）

表2 杜洛克和長(zhǎng)白豬精子活力和畸形率比較 %

2.3 品種內(nèi)豬精液精子活力和畸形率動(dòng)態(tài)變化

2.3.1 杜洛克豬精子活力與畸形率動(dòng)態(tài)變化 如圖1所示，杜洛克豬精子活力整體下降趨勢(shì)平穩(wěn)，在72～96 h出現(xiàn)快速下滑，精子畸形率在48 h后出現(xiàn)較大波動(dòng)，48～72、72～96 h 2個(gè)時(shí)段出現(xiàn)快速升高，而從整體變化趨勢(shì)來看，杜洛克豬精子活力和畸形率在精液稀釋后72 h分別出現(xiàn)快速下降與升高。杜洛克豬精液稀釋后0～96 h，精子活力與精子畸形率擬合二次曲線，擬合度R2分別為0.98和0.99。

圖1 杜洛克豬精子活力和畸形率

2.3.2 長(zhǎng)白豬精子活力與畸形率動(dòng)態(tài)變化 如圖2所示，長(zhǎng)白豬精子活力在36～48 h與72～96 h出現(xiàn)2次快速降低，精子畸形率出現(xiàn)在72～96 h，而從整體變化趨勢(shì)來看，長(zhǎng)白豬精子活力和畸形率在精液稀釋后72 h分別出現(xiàn)快速下降與升高。長(zhǎng)白豬精液稀釋后0～96 h，精子活力與精子畸形擬合二次曲線，擬合度R2分別為0.98和0.97。

2.3.3 品種內(nèi)豬精液稀釋48 h后精子活力和畸形率比較 如表3所示，隨著稀釋時(shí)間的增加，兩品種豬精子活力各時(shí)間段的下降速率逐漸增加，各時(shí)間段畸形率的上升速率逐漸增加。杜洛克精子活力84～96 h的下降速率極顯著高于48～60 h（P＜0.01），長(zhǎng)白豬各時(shí)間段精子活力下降速率均差異極顯著（P＜0.01）。杜洛克精子畸形率在72～84、84～96 h上升速率顯著高于60～72 h（P＜0.05），長(zhǎng)白豬精子畸形率在72～84、84～96 h上升速率極顯著高于60～72 h（P＜0.01）。

圖2 長(zhǎng)白豬精子活力和畸形率

3 討 論

精液在長(zhǎng)期保存的過程中，常規(guī)的精液參數(shù)會(huì)發(fā)生變化，包括精子活力、精子畸形率、pH以及能量的代謝等[6]。Johnson等[7]報(bào)道，在精液長(zhǎng)期保存過程中，精子結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，這種自然老化的過程與稀釋條件和長(zhǎng)期保存時(shí)間有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，兩品種豬精液稀釋后精子活力和畸形率分別隨著稀釋時(shí)間的增加而逐漸降低與升高。這可能是由于豬精液稀釋后保存在17℃下，在這種溫度下，精子的運(yùn)動(dòng)雖然明顯減弱或消失，但精子的代謝過程卻沒有停止，精子需要通過糖酵解途徑產(chǎn)生能量來維持細(xì)胞代謝[8]，導(dǎo)致稀釋液中營(yíng)養(yǎng)成分的降低，從而使精子活力和畸形率發(fā)生改變。

表3 精液稀釋48 h后精子活力和畸形率比較 %

不同品種公豬精液在體外保存過程中，精子功能的維持能力不同。這種維持能力的不同可以通過精子相關(guān)參數(shù)體現(xiàn)，如精子質(zhì)膜完整性、精子活力[9]和精子畸形率。豬精子活力和畸形率的高低與精子能否通過雌性生殖道和卵子進(jìn)行受精有關(guān)，液態(tài)豬精液在18～22℃溫度下保存3～5 d[7]。本研究結(jié)果顯示，兩品種豬精液稀釋72 h后，精子活力出現(xiàn)快速下降，精子畸形率顯著升高，杜洛克公豬精液稀釋后72、84 h畸形率顯著高于長(zhǎng)白豬，這可能暗示長(zhǎng)白豬精液的適宜保存時(shí)間要長(zhǎng)于杜洛克，但保存時(shí)間超過48～72 h時(shí)，精子活力下降會(huì)對(duì)分娩率和產(chǎn)仔數(shù)產(chǎn)生影響[10]，因此，考慮繁殖性能方面，兩品種豬精液稀釋后保存時(shí)間不應(yīng)超過72 h為宜。

本研究擬合了兩品種豬精液稀釋后0～96 h精子活力和畸形率二次曲線，用于估測(cè)各時(shí)間點(diǎn)精子活力。結(jié)果顯示，擬合度均達(dá)到95% 以上，其中杜洛克豬精子活力、畸形率擬合度達(dá)到98%以上，這表明用多項(xiàng)式曲線方程用以估測(cè)不同品種豬精子活力與畸形率是可行的，但豬精子活力與畸形率受品種[11-12]、季節(jié)[13]、采精頻率[14]、稀釋液[5]等多因素的影響，估測(cè)準(zhǔn)確度還需進(jìn)一步建模來驗(yàn)證，尋找一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)且準(zhǔn)確的估測(cè)方法，從而在養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中為不同品種豬精液品質(zhì)檢測(cè)提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

豬精液保存時(shí)間影響精子活力和畸形率，品種間不同時(shí)間點(diǎn)精子活力與畸形率也存在差異。長(zhǎng)白豬精液采用BTS稀釋液稀釋后保存時(shí)間可能要長(zhǎng)于杜洛克豬，但兩品種豬在精液稀釋72 h后品質(zhì)顯著降低，這也表明在保證精液品質(zhì)與受精能力的前提下，兩品種豬精液都應(yīng)在稀釋72 h前盡早使用，以免影響后續(xù)人工授精效果與繁殖性能。

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S828.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-09-065

2017-03-14；

2017-06-15

齊齊哈爾市科技局項(xiàng)目（NYGG-201526）

高圣玥（1978-），男，黑龍江人，副研究員，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖，E-mail: 1750210645@qq.com

* 通訊作者