張立春，孫福亮，金海國，曹 陽，魏 天，樸慶林，張明新

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院，吉林公主嶺 136100；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 130021）

小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊羊毛及毛囊性狀比較研究

張立春1，孫福亮2，金海國1，曹 陽1，魏 天1，樸慶林1，張明新1

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院，吉林公主嶺 136100；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 130021）

為進(jìn)一步驗(yàn)證小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊毛用性狀與毛囊性狀差異。本研究選擇9月齡小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊母羊各8只，在相同飼養(yǎng)環(huán)境下測定毛用性狀及毛囊性狀并分析兩者間的差異，最后用定量PCR方法檢測不同月份2個(gè)品種綿羊毛囊周期分子的表達(dá)變化趨勢。結(jié)果表明：小尾寒羊在主要毛用性狀，包括產(chǎn)毛量（GFW）、毛細(xì)度（FD）、拉伸長度（SL）、卷曲度及油脂率等大部分指標(biāo)均極顯著低于新吉細(xì)毛羊（P＜0.01）；組織切片法測定小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊毛囊制表顯示，小尾寒羊毛囊密度、S/P值等極顯著低于新吉細(xì)毛羊（P＜0.01），但在皮膚厚度、初級毛囊、次級毛囊毛乳頭直徑等顯著高于新吉細(xì)毛羊；毛囊周期標(biāo)記分子定量PCR顯示，不同季節(jié)小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊LEF1和TGF-β1基因總體變化趨勢相同，但小尾寒羊變化更為劇烈，說明氣候等外界因素對小尾寒羊毛囊周期影響大于新吉細(xì)毛羊。本研究證明小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊的毛用性狀、毛囊性狀存在極顯著差異，TGF-β1為進(jìn)一步探討小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊毛用性狀表型差異分子遺傳基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

新吉細(xì)毛羊；小尾寒羊；羊毛性狀；毛囊性狀

小尾寒羊廣泛分布于我國北方地區(qū)，以其生長速度快、產(chǎn)羔率高而聞名，被廣大養(yǎng)殖戶所喜愛，是北方地區(qū)優(yōu)勢品種。亦有研究機(jī)構(gòu)或養(yǎng)殖企業(yè)將小尾寒羊與當(dāng)?shù)鼐d羊雜交以提高雜交綿羊的產(chǎn)羔率，改良綿羊產(chǎn)羔率的同時(shí)也帶來雜交綿羊毛用性狀和肉質(zhì)性狀明顯退化的趨勢[1]。其原因在于小尾寒羊毛屬于典型的兩型毛，同時(shí)品種改良過程中從未將毛用性狀提高作為主要育種目標(biāo)，致使小尾寒羊毛用性狀幾十年來未有明顯提高[2]。新吉細(xì)毛羊是吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院與新疆畜牧科學(xué)院牽頭于20世紀(jì)80年代育成的細(xì)毛羊品種[3]，21世紀(jì)以來相關(guān)育種機(jī)構(gòu)一致致力于新吉細(xì)毛羊毛用性狀選育提高工作，超細(xì)型新吉細(xì)毛羊品系及其他相關(guān)超細(xì)型品系已通過國家品種鑒定委員會通過，于2014年正式命名為蘇博美麗奴羊[4]。蘇博美麗奴羊毛用性能各項(xiàng)指標(biāo)極為出色，成年雄性羊產(chǎn)毛量大于5 kg，雌性成年羊大于2.5 kg，毛長不低于8 cm，毛細(xì)度小于19 μm[5]。盡管小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊在毛用性狀上存在差異被人們普遍接受，但目前尚無直接比較2個(gè)品種羊毛用性狀差異的報(bào)道。更為重要的是小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊毛用性狀表型差異為探索毛囊形成發(fā)育與毛用性狀遺傳基因研究提供理想動(dòng)物模型。為進(jìn)一步驗(yàn)證小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊毛用性狀及毛囊性狀的差異性，本實(shí)驗(yàn)對2個(gè)品種羊進(jìn)行了系統(tǒng)研究，進(jìn)一步確證了小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊表型差異的顯著性，為進(jìn)一步研究毛用性狀遺傳基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集 本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為9個(gè)月齡雌性新吉細(xì)毛羊和小尾寒羊母羊各8只，其中新吉細(xì)毛羊?yàn)榧质∞r(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院新近選育的超細(xì)型新品系，小尾寒羊?yàn)槭惺奂兎N小尾寒羊。實(shí)驗(yàn)周期為上年9月至當(dāng)年9月。羊毛性狀測定樣品采集自6月份剪毛季節(jié)，毛囊性狀測定皮膚組織樣品采集自上年10月，采集部位為肩胛后皮膚。毛囊周期測定樣品選擇每2個(gè)月采集肩甲后皮膚樣品，浸入RNAlater液中，-80℃保存。

1.2 主要試劑 RNAlater購置于QIAGEN公司、Trizol購自于Invitrogen公司；pMD18-T 載體，RNasefreeDNaseI，Agarose Gel DNA Purification Kit及ExTaq酶系統(tǒng)均購自大連寶生物公司；定量PCR試劑Light cycler 480 SYBR Green I master購自于羅氏公司。

1.3 羊毛性狀及毛囊性狀測定 羊毛性狀參照傳統(tǒng)方法進(jìn)行，主要測定指標(biāo)包括產(chǎn)毛量、凈毛率、毛細(xì)度、拉伸長度、卷曲度和油脂率。毛囊性狀主要采用組織切片，HE染色法進(jìn)行。樣品采集后經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、浸蠟、包埋，分別選擇延毛囊方向橫切與縱切，最后經(jīng)HE染色，具有刻度顯微鏡觀察測量，記錄毛囊各組織結(jié)構(gòu)的測量數(shù)據(jù)，毛囊性狀測定指標(biāo)主要包括皮膚厚度、毛囊密度、毛囊直徑（皮脂腺部位）、毛乳頭直徑、次級毛囊與初級毛囊比（S/P值）。2個(gè)品種差異比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

1.4 RNA提取與引物設(shè)計(jì) 毛囊周期QRT-PCR首先采用液氮研磨，Trizol法提取總RNA。cDNA合成前總RNA用RNasefreeDNaseI處理確保不存在DNA污染，cDNA合成反應(yīng)參照PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成一鏈cDNA。目標(biāo)基因定量PCR引物設(shè)計(jì)采用Oligo 7.0軟件。以β-actin基因作為內(nèi)參引物，具體引物信息參見表1。

1.5 毛囊周期QRT-PCR檢測 定量PCR采用LightCycle 480 II定量PCR儀。反應(yīng)為20 μL體系：ddH2O為8.6 μL，cDNA 模板稀釋10倍后添加1 μL，Lightcycler 480 SYBR Green I master 10 μL，濃度為10 μmol/L的正、反引物各0.2 μL。循環(huán)條件：95℃變性15 min，40個(gè)循環(huán)，條件為94℃ 15 s，62℃ 30 s，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行產(chǎn)物熔解曲線分析。每個(gè)品種檢測3個(gè)個(gè)體，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)行3次。檢測結(jié)果利用2－△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪制柱形圖。2個(gè)品種間皮膚組織基因表達(dá)差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊毛用性狀比較分析 由表2可見，新吉毛樣在產(chǎn)毛量，拉伸長度、卷曲度和油脂率等極顯著高于小尾寒羊（P＜0.01），纖維直徑呈現(xiàn)極顯著減低，說明新吉細(xì)毛羊在毛用性狀方面全方位優(yōu)于小尾寒羊，唯一不存在極顯著差異的指標(biāo)是凈毛率，表現(xiàn)為小尾寒羊凈毛率顯著高于新吉細(xì)毛羊（P＜0.05）。說明新吉細(xì)毛羊毛吸收裹扎灰塵的能力大于小尾寒羊羊毛，該結(jié)果與細(xì)毛羊毛長更長、密度更高、卷曲度更大存在一定的關(guān)聯(lián)性。

表 1 引物序列信息及擴(kuò)增產(chǎn)物

表 2 新吉細(xì)毛羊與小尾寒羊產(chǎn)毛用性狀比較分析

2.2 小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊毛囊性狀比較分析 由表3發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊在皮膚厚度、初級毛囊和次級毛囊毛乳頭直徑均極顯著大于新吉細(xì)毛羊（P＜0.01），而新吉細(xì)毛羊毛囊密度及S/P值極顯著大于小尾寒羊（P＜0.01）。上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果可通過皮膚組織切片進(jìn)行宏觀驗(yàn)證（圖1）。從2個(gè)品種綿羊皮膚組織切片中可以發(fā)現(xiàn)，新吉細(xì)毛羊皮膚組織中毛囊密度更高，無論初級毛囊還是次級毛囊直徑均更小，毛囊從指間結(jié)締組織明顯少于小尾寒羊。毛囊叢中小尾寒羊初級與次級毛囊差異較為明顯，且S/P值明顯低于新吉細(xì)毛羊。新吉細(xì)毛羊毛囊從中初級毛囊與次級毛囊則較難分辨，毛囊之間也極為緊湊，呈現(xiàn)出均勻分布的態(tài)勢。從皮膚毛囊組織特性比較分析可以得出，作為毛品質(zhì)及產(chǎn)量更優(yōu)的新吉細(xì)毛羊在毛囊性狀方面同樣與小尾寒羊存在顯著差別，提示毛囊性能與羊毛性狀間存在必然的聯(lián)系。

表 3 新吉細(xì)毛羊與小尾寒羊毛囊狀比較分析

圖1 小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊皮膚組織切片（40×）

2.3 小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊毛囊周期比較分析 為鑒定小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊毛囊組織是否在毛囊周期上存在差異，采集不同上述2個(gè)品種綿羊時(shí)間點(diǎn)皮膚毛囊組織樣品。通過定量PCR方法檢測2個(gè)品種綿羊毛囊周期標(biāo)記基因TGF-β1和LEF1基因在不同時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)變化，間接推測2個(gè)品種羊是否存在周毛囊周期差異。2個(gè)品種羊均以2月份表達(dá)水平為參照，LEF1基因相對定量檢測發(fā)現(xiàn)，2個(gè)品種羊均呈現(xiàn)表達(dá)降低后逐漸恢復(fù)至升高的變化趨勢（圖2）。其中新吉細(xì)毛羊變化趨勢較為一致，呈現(xiàn)4月份較2月份減低后逐漸恢復(fù)，至8月份已略高于2月份表達(dá)水平，在后期種也呈現(xiàn)上升的趨勢，至12月份達(dá)到表達(dá)頂峰，是2月份表達(dá)水平的1.8倍。如果全年串聯(lián)可以看出，LEF1基因呈現(xiàn)出波浪式的動(dòng)態(tài)變化趨勢，這與其與毛囊退行休止期高表達(dá)的特征相一致。小尾寒羊LEF1基因則相對復(fù)雜，主要除總體趨勢從4月份呈現(xiàn)表達(dá)水平逐漸上升的趨勢外，主要表現(xiàn)為在10月份出現(xiàn)一個(gè)明顯的回落，

12月又達(dá)到峰點(diǎn)。盡管LEF1基因表達(dá)存在季節(jié)性變化的趨勢，但總體表達(dá)變化并不大，表達(dá)最高點(diǎn)的12月也僅僅為對照2月的1.8倍左右。橫向比較兩品種羊皮膚組織LEF1基因表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，各時(shí)間節(jié)點(diǎn)LEF1基因表達(dá)并不存在顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 不同月份小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊LEF1基因定量PCR檢測

TGF-β1基因在2個(gè)品種中表達(dá)隨季節(jié)變化呈現(xiàn)更加劇烈的變化趨勢（圖3）。不同季節(jié)新吉細(xì)毛羊皮膚 TGF-β1表達(dá)僅在8月份和12月份呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢，分別為2月份表達(dá)水平的10.4、3.2倍。小尾寒羊則在4、8、10月呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢，表達(dá)水平依次為2月份的3.0、44.1、2.7倍。尤其是在8月份呈現(xiàn)出極端上調(diào)表達(dá)的趨勢，這種趨勢與新吉細(xì)毛羊呈現(xiàn)類似的趨勢，但幅度更大。不同時(shí)間點(diǎn)2個(gè)品種羊皮膚TGF-β1基因表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)，8月份和12月份呈現(xiàn)出顯著性變化（P＜0.05），提示8月份可能是毛囊周期變化重要的節(jié)點(diǎn)。小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊不同變化趨勢同時(shí)也提示2個(gè)品種羊TGF-β1基因在毛囊周期過程中分子功能存在一定的差異性。

圖3 不同月份小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊TGF-β1基因定量PCR檢測

3 討 論

小尾寒羊繁殖性能優(yōu)勢明顯，多用于改良地方綿羊提升產(chǎn)羔率。也是綿羊繁殖性能基礎(chǔ)性研究的重要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[6-7]。小尾寒羊較其他肉羊品種比較在產(chǎn)肉量、肉質(zhì)品質(zhì)等指標(biāo)上劣勢同樣明顯，因此小尾寒羊也作為肌肉發(fā)育或肉質(zhì)品質(zhì)鑒定的對照[8]。在毛用性狀方面，小尾寒羊不僅僅產(chǎn)毛量低，品質(zhì)也屬于典型的劣質(zhì)毛，只能用于毛氈等低端紡織品。新吉細(xì)毛羊則在選育過程中不斷強(qiáng)調(diào)毛用性狀的選育提高[9]。不同選擇方向致使兩者在毛用性狀表型上的差距呈現(xiàn)出極端的兩極化發(fā)展趨勢。為探討毛性狀成因及毛囊功能活性研究提供天然研究對象。本文基于此出發(fā)點(diǎn)，對小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊毛用性狀、毛囊性狀與毛囊周期進(jìn)行了系統(tǒng)比較研究，結(jié)果證明2個(gè)品種綿羊在毛用性狀和毛囊性狀存在極端顯著差異，但在毛囊周期上差異不大。

縱向比較不同時(shí)期小尾寒羊毛用性狀測量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)小尾寒羊產(chǎn)毛性能并未有明顯提升[10]，其原因在于毛用性狀并非小尾寒羊品種改良的主要目標(biāo)。本研究結(jié)果表明，超細(xì)型新吉細(xì)毛羊毛用性狀各項(xiàng)指標(biāo)則始終處于較高強(qiáng)度的人工選擇下，致使2個(gè)品種毛用性狀差異越來越大。這種極端的毛用性狀表型差異最直接的原因在于2個(gè)品種羊毛囊組織結(jié)構(gòu)、性能與數(shù)量的顯著差異，尤其表現(xiàn)為毛囊密度，S/P值及毛乳頭直徑等關(guān)鍵指標(biāo)上。事實(shí)上臨床經(jīng)驗(yàn)及皮膚組織切片還能發(fā)現(xiàn)，2個(gè)品種綿羊皮膚致密程度、皮膚溫度、皮膚毛細(xì)血管密度等方面均存在差異，主要表現(xiàn)為小尾寒羊皮膚組織致密性更高，溫度和毛細(xì)血管密度更低。一方面原因在于小尾寒羊最初主要在華北地區(qū)養(yǎng)殖，年均氣溫較高所致，而細(xì)毛羊主要生活于東北、內(nèi)蒙及新疆等地，年均氣溫更低。不同生活環(huán)境與人工選擇的雙重作用下，致使小尾寒羊毛用性狀與毛囊性狀呈現(xiàn)出日漸分離的趨勢。

毛囊是一類重要的可自我更新的微小器官[11]。毛囊周期分為生長期、休止期和退形期，毛囊周期更替對毛發(fā)結(jié)構(gòu)性狀具有根本性影響。毛囊周期受到復(fù)雜的分子信號通路所控制[12]。不同物種毛囊周期存在顯著差異，以山羊?yàn)槔?，山羊一個(gè)毛囊周期基本為1年，與氣溫即日照時(shí)長等自然狀況更迭相吻合。由于綿羊受到人工選擇的程度更高，綿羊尤其是細(xì)毛羊毛囊周期基本在2年以上，其中生長期被盡可能延長，以提高羊毛產(chǎn)量。為比較小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊毛囊周期，本研究采用QRT-PCR法，對2個(gè)品種綿羊不同季節(jié)皮膚組織中TGF-β1和LEF1基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)間TGF-β1和LEF1基因表達(dá)存在較為明顯的波動(dòng)，表現(xiàn)出TGF-β1較LEF1基因波動(dòng)性更強(qiáng)，小尾寒羊較新吉細(xì)毛羊2個(gè)基因表達(dá)變化更加劇烈的特征，一方面證實(shí)2個(gè)基因作為毛囊周期標(biāo)志分子的可能性，另一方面也證實(shí)2個(gè)品種綿羊毛囊周期分子表達(dá)的差異性提示毛囊周期可能并未完全一致[13-14]。有報(bào)道證明，小鼠TGF-β1基因在毛囊生長后期及退形期前期高表達(dá)，通過抑制毛囊角質(zhì)細(xì)胞增殖從而促進(jìn)毛囊從生長期進(jìn)入休止期[13]。而傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為每年8月份開始為山羊新一輪毛囊周期的開始，而本實(shí)驗(yàn)中無論小尾寒羊還是新吉細(xì)毛羊，8月份正處于20月齡左右，理論上尚處于上一個(gè)毛囊周期，組織切片檢測顯示毛囊處于生長期，提示綿羊毛囊周期控制機(jī)制可能與小鼠存在某種程度的差異性。作為Wnt信號通路重要的調(diào)節(jié)分子，LEF1基因只在生長期毛囊組織呈現(xiàn)高表達(dá)[14]，LEF1基因在毛囊周期中的表達(dá)特性是其成為毛囊周期分子鑒定的基礎(chǔ)，但從小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊毛囊組織LEF1基因表達(dá)趨勢中并不能明顯區(qū)分毛囊處于具體時(shí)期，進(jìn)一步說明在綿羊毛囊周期與小鼠等物種存在一定的差異性。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊與新吉細(xì)毛羊2個(gè)基因表達(dá)模式與藏綿羊比較發(fā)現(xiàn)存在相似性，同時(shí)也存在一定差異[15]?？赡艿脑蛟谟趦烧呙覕?shù)量、結(jié)構(gòu)存在較大的差異性，這也可能是兩者在產(chǎn)毛性能上存在較大差別的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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S827.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-09-052

2017-03-28；

2017-05-18

國家863計(jì)劃（2013AA102506）

張立春（1977-），男，黑龍江嫩江人，副研究員，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物生物技術(shù)，E-mail:zhang_lich@163.com