孟祥忍，張成龍，樊永亮，王文強(qiáng)，毛永江，黃必志，虧開(kāi)興，楊章平?（.揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 57；.云南省草地與動(dòng)物研究院，云南昆明650）

基于RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)揭示南方黃牛肉質(zhì)嫩度調(diào)控相關(guān)的分子機(jī)制

孟祥忍1，張成龍1，樊永亮1，王文強(qiáng)1，毛永江1，黃必志2，虧開(kāi)興2，楊章平1?（1.揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225127；2.云南省草地與動(dòng)物研究院，云南昆明650212）

為揭示南方黃牛肉質(zhì)調(diào)控的分子機(jī)制并挖掘與肌肉嫩度相關(guān)的功能基因，本研究以1周歲左右的云嶺牛、文山牛和中國(guó)西門(mén)塔爾牛為試驗(yàn)對(duì)象，屠宰后測(cè)定背最長(zhǎng)肌不同排酸時(shí)間（0 、1 、2 、3 、5 、7 d）下剪切力變化，揭示不同黃牛品種肌肉嫩度的差異，利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)背最長(zhǎng)肌進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，并結(jié)合生物信息學(xué)篩選與肌肉嫩度調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路及差異表達(dá)基因，最后利用qPCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明：在宰后成熟過(guò)程中，黃牛肌肉嫩度表現(xiàn)為明顯的下降趨勢(shì)，且在同一個(gè)成熟時(shí)間點(diǎn)下，剪切力值表現(xiàn)為西門(mén)塔爾牛＞文山牛＞云嶺牛，表明云嶺牛嫩度較好，而西門(mén)塔爾牛嫩度相對(duì)較差；云嶺牛與西門(mén)塔爾牛背最長(zhǎng)肌2組文庫(kù)經(jīng)測(cè)序后，篩選出3 198個(gè)差異表達(dá)基因，其中云嶺牛上調(diào)基因1 750個(gè)，KEGG功能注釋發(fā)現(xiàn)2個(gè)與肉質(zhì)調(diào)控相關(guān)的重要信號(hào)通路：脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路，結(jié)合qPCR驗(yàn)證、基因表達(dá)水平與剪切力值相關(guān)性分析，最終篩選出Leptin和CAPN1 2個(gè)可能肌肉嫩度相關(guān)的功能基因。本研究篩選與鑒定出南方黃牛肌肉嫩度相關(guān)信號(hào)通路及其關(guān)鍵基因，為今后南方黃牛肉質(zhì)遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

南方黃牛；嫩度；轉(zhuǎn)錄組

嫩度是指肉在切割時(shí)所需的剪切力，剪切力是指測(cè)試儀器的刀具切斷被測(cè)肉樣時(shí)所用的力。通過(guò)測(cè)定儀器測(cè)傳感器記錄刀具切割肉樣時(shí)的用力情況并把測(cè)定的剪切力峰值作為肉樣嫩度值，結(jié)果單位以N或者kg之間切換。肉質(zhì)嫩度是評(píng)價(jià)畜禽肉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，反映了肉中各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性，肌肉中脂肪的分布狀態(tài)及肌纖維中脂肪數(shù)量等，其可以在機(jī)體宰后成熟過(guò)程中進(jìn)行測(cè)定，但測(cè)定過(guò)程中存在著系統(tǒng)誤差，且在活體上難以直接度量，迫切需要從遺傳本質(zhì)上尋找影響肌肉嫩度的功能基因，并利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)進(jìn)行肉質(zhì)性狀改良。目前，關(guān)于肌肉嫩度相關(guān)候選基因的研究

主要集中在雞和豬上[1-2]，對(duì)于肉牛特別是南方黃牛調(diào)控肌肉嫩度的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組RNA-seq測(cè)序已經(jīng)廣泛用于研究不同物種或者同一物種不同時(shí)期特定組織的基因表達(dá)水平差異，通過(guò)利用生物信息學(xué)（Bioinformatics）技術(shù)來(lái)揭示特定性狀形成的分子機(jī)制，對(duì)今后物種優(yōu)良性狀的選種選育奠定理論基礎(chǔ)。因此，本研究以云嶺牛、文山牛和中國(guó)西門(mén)塔爾牛作為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)不同排酸時(shí)間（0、1、2、3、5、7 d）肉質(zhì)嫩度，篩選嫩度存在差異的黃牛品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并結(jié)合生物信息學(xué)分析和qPCR驗(yàn)證篩選肉質(zhì)嫩度相關(guān)的重要調(diào)控通路和功能基因，不僅為南方黃牛肉質(zhì)改良育種提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也可為今后高檔牛肉的生產(chǎn)提供重要的參考材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 為隨機(jī)選取1周歲左右云嶺牛、文山牛和中國(guó)西門(mén)塔爾牛（均來(lái)自云南省草地動(dòng)物研究院），其中每個(gè)品種各5頭，編號(hào)西門(mén)塔爾牛（S01、S02、S04、S03、S05）， 文 山 牛（W01、W02、W03、W04、W05）和 云 嶺 牛（10513、10577、10556、10564、10568），屠宰后其中一方面取背最長(zhǎng)肌組織立刻放入液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室放入-70℃保存?zhèn)溆?，其次將肉牛酮體放入4℃排酸庫(kù)中進(jìn)行6 d的排酸處理，按照不同排酸時(shí)間（0、1、2、3、5、7 d）中，測(cè)定背最長(zhǎng)肌嫩度變化情況。

1.2 肌肉嫩度測(cè)定 采用美國(guó)F.T.C公司的TMSPro物性測(cè)試儀測(cè)定剪切力值大小，每個(gè)肉樣的剪切力值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。測(cè)量參數(shù)：探頭：HDP/BSW；PPS：200.00；測(cè)試模式與選擇：Measure Force in Confrerensing；測(cè)前速度：120.0 mm/min；測(cè)定速度：60.0 mm/min；測(cè)后速度：60.0 mm/min；距離20 mm；起始力0.7 N。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

1.3.1 RNA提取、cDNA文庫(kù)建立以及上機(jī)測(cè)序 使用Trizol法提取云嶺牛和中國(guó)西門(mén)塔爾牛背最長(zhǎng)肌樣品總RNA（每個(gè)3份），進(jìn)一步利用Nanodrop檢測(cè)RNA的純度（OD260/280），Qubit對(duì)RNA濃度進(jìn)行精確定量，Agilent 2100精確檢測(cè)RNA的完整性。隨后使用DNase消化DNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；加入打斷試劑將mRNA打斷成約200 bp短片段，以打斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs（dTTP、dATP、dGTP和dCTP）和DNA polymeraseI合成二鏈cDNA，并使用試劑盒AMPure XP beads純化雙鏈cDNA；純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeqTM2500進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 由Illumina HiSeqTM2500測(cè)序所得的數(shù)據(jù)稱(chēng)為raw reads或raw data，隨后要對(duì)raw reads進(jìn)行質(zhì)控（QC），以確定測(cè)序數(shù)據(jù)是否適用于后續(xù)分析。質(zhì)控后，經(jīng)過(guò)濾得到clean reads，用tophat/bowtie2將clean reads比對(duì)到參考序列。比對(duì)完，通過(guò)統(tǒng)計(jì)reads在參考序列上的分布情況、覆蓋度以及Reads在不同元件的富集分析，同時(shí)利用ASprofile[3]軟件分析其可變剪接事件。

1.3.3 差異表達(dá)基因篩選及聚類(lèi)分析 利用RNA-seq數(shù)據(jù)比較分析2個(gè)樣品中同一個(gè)Unigene是否存在差異表達(dá)時(shí)，可以選取2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：一是FoldChange，就是兩樣品中同一個(gè)Unigene表達(dá)水平的變化倍數(shù)；二是pvalue或FDR（padjust），F(xiàn)DR值的計(jì)算方法先要對(duì)每個(gè)Unigene進(jìn)行P-value的計(jì)算，再用FDR錯(cuò)誤控制法對(duì)P-value作多重假設(shè)檢驗(yàn)校正。默認(rèn)篩選差異的條件為P≤0.05。此 外 使 用 Cluster 3.0軟 件（http://bonsai.hgc. jp/～mdehoon/software/cluster/software.htm）對(duì)不同差異表達(dá)基因RPKM值進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.3.4 GO功能和Pathway通路富集與注釋 GO（Gene Ontology, http://geneontology.org/） 挖 掘差異表達(dá)的 mRNA 的主要生物學(xué)功能，包括分子功能（Molecular Function）、細(xì)胞組成（Cellular Component）、生物學(xué)過(guò)程 （Biological Process），分析軟件：GOSeq[4]；KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.kegg.jp/），又稱(chēng)京都基因與基因組百科全書(shū)，是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫(kù)。KEGG注釋的主要目的包括2個(gè)：KO（KEGG Ortholog）注釋?zhuān)磳⒎肿泳W(wǎng)絡(luò)的相關(guān)信息進(jìn)行跨物種注釋?zhuān)籏EGG Pathway注釋?zhuān)创x通路注釋?zhuān)@得物種內(nèi)分子間相互作用和反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)，分析軟件：KOBAS[5]。

1.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已公布的牛MSTN、Leptin、LEPR、STAT3、HSPA1A、CAPN1和內(nèi)參基因β-actin基因序列，利用Premier 6.0軟件進(jìn)行跨外顯子引物設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成，具體引物信息如表1。

1.5 差異表達(dá)基因的qPCR驗(yàn)證 利用Trizol法提取各組織總RNA，以RNA為模板進(jìn)行cDNA合成。cDNA合成：10 μL的反應(yīng)體系中含5×Primer-Script Buffer反應(yīng)液2 μL，PrimerScript RT Enzyme MixI0.5 μL，Oligo dT 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，總RNA 500 ng， RNase free H2O補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。熒光染料為SYBR GreenI（TaKaRa），反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL（10 μmol /L），ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix（2×）10 μL，ddH2O 7.8 μL。Real-time PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后分析熔解曲線。

表1 引物序列信息

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 相對(duì)定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt法[6]進(jìn)行處理，計(jì)算差異表達(dá)基因在云嶺牛與西門(mén)塔爾牛背最長(zhǎng)肌組織中的表達(dá)水平，并利用SPSS18.0軟件對(duì)云嶺牛與西門(mén)塔爾牛背最長(zhǎng)肌中基因表達(dá)水平差異程度進(jìn)行卡方獨(dú)立性t檢驗(yàn)，同時(shí)基于Pearson方法對(duì)基因表達(dá)水平與剪切值進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 排酸過(guò)程中肌肉嫩度變化情況 由圖1可以看出，云嶺牛宰后0～5 d云嶺牛、西門(mén)塔爾牛和文山牛剪切力值均表現(xiàn)為明顯的下降趨勢(shì)，5 d后剪切力值下降幅度不大，趨于穩(wěn)定；整體來(lái)看，同一個(gè)排酸時(shí)間點(diǎn)的剪切力值表現(xiàn)為西門(mén)塔爾牛＞文山牛＞云嶺牛，表明云嶺牛嫩度較好，而西門(mén)塔爾牛嫩度相對(duì)較差。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析 為了進(jìn)一步探討黃牛肌肉嫩度調(diào)控的分子機(jī)制，本研究選取云嶺牛（嫩度較好）和西門(mén)塔爾牛（嫩度較差）2種肉牛背最長(zhǎng)肌作為樣本，云嶺牛編號(hào)為Y1～Y3，西門(mén)塔爾牛編號(hào)為S1～S3，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

2.2.1 樣本RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 由表2可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢測(cè)后，選取6個(gè)背最長(zhǎng)肌樣本（S1～S3和Y1～Y3）RNA總量、RNA完整性指數(shù)（RIN）以及純度均符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)（RIN≥8.0；OD260/ OD280≥2.0；28S/18S≥1.6），可以用于下一步的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

圖1 不同黃牛品種肌肉排酸過(guò)程中肌肉嫩度變化

2.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)堿基質(zhì)量分布分析對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序錯(cuò)誤率分布檢查。由表3可以看出，堿基有效比率Valid ratio和Q30均在90%以上；由堿基質(zhì)量分布圖（圖2和圖3）可以看出，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量都在平均值以上，Reads匹配到不同的物種，并且測(cè)序結(jié)果獲得的轉(zhuǎn)錄本除了前幾個(gè)堿基具有較大波動(dòng)，隨后所有堿基處于水平線的穩(wěn)定趨勢(shì)，基本沒(méi)有AT和GC分離現(xiàn)象。此外，絕大多數(shù)reads比對(duì)到了外顯子區(qū)域CDS_Exon（圖4），對(duì)測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行Map比對(duì)到牛參考基因組上（表2、3），匹配到參考基因組的Reads數(shù)在85.43%～90.49%，綜合表明測(cè)序數(shù)據(jù)非常良好，結(jié)果可利用率較高，可以用于下一步分析。

表2 樣本RNA質(zhì)量檢測(cè)

2.2.3 基因結(jié)構(gòu)分析—可變剪切事件預(yù)測(cè) 由表4可知，可變剪接分析結(jié)果（圖5）表明，共發(fā)現(xiàn)12類(lèi)型的可變剪切事件，其中主要可變剪切為可變末尾外顯子（Alternative Last Exons，TTS）、可變第1外顯子（Alternative First Exons，TSS）、單內(nèi)含子保留（Intron Retention，IR）和可變5'或3'端剪切（Alternative Exon Ends，AE）。

表3 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

圖2 原始數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量分布圖

圖3 堿基分布圖

圖4 樣本reads在不同原件上分布圖

表4 與參考基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖5 可變剪切分析

圖6 差異表達(dá)基因散點(diǎn)圖

2.2.4 差異表達(dá)基因及聚類(lèi)分析 云嶺牛與西門(mén)塔爾牛背最長(zhǎng)肌兩組文庫(kù)經(jīng)測(cè)序后，利用P＜0.05和log2fold change＞2原則在兩組之間共篩選出3 198個(gè)差異表達(dá)基因，其中云嶺牛組上調(diào)基因1 750個(gè)（圖6），進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖7），發(fā)現(xiàn)云嶺牛與西門(mén)塔爾牛樣本中高低表達(dá)水平的基因聚類(lèi)在一起。

圖7 差異表達(dá)基因聚類(lèi)分析

圖8 KEGG-pathway通路注釋

2.2.5 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)（圖8），大部分差異表達(dá)基因主要在20種通路中富集，其中主要在脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路（Adipocytokine Signaling Pathway） 和 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng)蛋白加工通路（Protein Processing in Endoplasmic Reticulum）中高度富集，并且篩選出MSTN、Leptin、LEPR、STAT3、HSPA1A、CAPN1等幾個(gè)可能與肌肉嫩度相關(guān)的差異表達(dá)基因。

圖9 差異表達(dá)基因qPCR驗(yàn)證

圖10 基因表達(dá)水平與剪切力值相關(guān)性分析

2.3 重要差異基因表達(dá)水平驗(yàn)證及其與肌肉剪切力值相關(guān)性分析 對(duì)6個(gè)重要差異表達(dá)基因（MSTN、Leptin、LEPR、STAT3、HSPA1A、CAPN1），利用qPCR在西門(mén)塔爾牛和云嶺牛背長(zhǎng)肌組織中進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)（每組3個(gè)重復(fù)，見(jiàn)圖9），結(jié)果表明該6個(gè)基因在兩組之間表達(dá)水平均呈現(xiàn)顯著或極顯著差異（P＜0.05或P＜0.01），其表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組RNA-seq結(jié)果基本一致，表明測(cè)序結(jié)果可靠。此外，進(jìn)一步分析以上差異基因表達(dá)水平與肌肉剪切力值相關(guān)性表明（圖10），瘦素基因（Leptin）和鈣蛋白酶1基因（CAPN1）分別與剪切力值表現(xiàn)為顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.898和0.836，而其他基因無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討 論

我國(guó)南方黃牛遺傳資源分布具有品種豐富、起源獨(dú)特、存欄量大以及環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，然而其牛肉品質(zhì)與牛肉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值密切相關(guān)。本研究從肌肉嫩度入手，分析了3種不同黃牛（云嶺牛、文山牛和中國(guó)西門(mén)塔爾牛）在宰后成熟過(guò)程中肌肉嫩度表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，由于屠宰后肌肉中仍然進(jìn)行各種生化反應(yīng)，但是主要進(jìn)行無(wú)氧代謝，不斷產(chǎn)生大量的乳酸等物質(zhì)，從而引起肌肉中pH降低。無(wú)氧代謝使ATP合成受阻導(dǎo)致其濃度下降，進(jìn)而使肌漿網(wǎng)鈣泵功能失去，導(dǎo)致肌肉收縮連續(xù)但不可逆，收縮到最大程度時(shí)形成肌肉的宰后僵直。研究發(fā)現(xiàn)，肌肉嫩度在一開(kāi)始屠宰后最佳，此后隨著pH變化導(dǎo)致嫩度下降[7]。此外，本研究還比較了這3種不同黃牛肌肉嫩度變化，發(fā)現(xiàn)云嶺牛肌肉嫩度較好，而西門(mén)塔爾牛相對(duì)較差。在此基礎(chǔ)上，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析不同南方黃牛品種之間背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)重要的調(diào)控通路：脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路，并且篩選出MSTN、Leptin、LEPR，STAT3，HSPA1A、CAPN1等幾個(gè)重要差異表達(dá)基因。肌肉生長(zhǎng)抑制基因（Myostatin，MSTN）屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β家族成員之一，主要負(fù)責(zé)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育[8]，有關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)MSTN缺陷型小鼠的肌肉變大，肌群分布更加廣泛，其質(zhì)量也增加2倍以上[9]，同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)牛MSTN基因多態(tài)性與雙肌性狀密切相關(guān)[10]。瘦素基因（Leptin）是機(jī)體脂肪細(xì)胞分泌的蛋白類(lèi)激素，通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)將肥胖信號(hào)傳遞給大腦，從而減少采食量，提高機(jī)體能量代謝，可以降低體重，因此Leptin在調(diào)控脂肪代謝和體重穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)Leptin基因多態(tài)性與肉質(zhì)性質(zhì)有關(guān)[11]。此外，瘦素受體（LEPR）是瘦素（leptin）發(fā)揮作用的關(guān)鍵受體物質(zhì)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子STAT3，主要參與細(xì)胞增殖、分化與遷移等功能，在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[12]。鈣蛋白酶1（CAPN1）基因作為一種半胱氨酸疏基內(nèi)肽水解酶，主要調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化凋亡以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程[13]。研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶是降解肌肉纖維的主要酶[14]，并且酶活性與肉質(zhì)嫩度的變化密切相關(guān)[15]，此外也有研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶能有效地提高牛對(duì)飼料的利用率。結(jié)合以上基因功能的相關(guān)報(bào)道，本研究分析了基因表達(dá)水平與肌肉嫩度（剪切力）的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Leptin和CAPN1均與剪切力值表現(xiàn)出較高的相關(guān)性，因此，本研究綜合推測(cè)瘦素基因（Leptin）和鈣蛋白酶1（CAPN1）基因可能在南方黃牛肉質(zhì)（肌肉嫩度）形成過(guò)程中起著重要調(diào)控作用，今后需要在細(xì)胞水平上利用RNA干擾、過(guò)表達(dá)以及TALEN敲除技術(shù)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證2個(gè)關(guān)鍵基因的功能，此外個(gè)體水平進(jìn)行遺傳變異位點(diǎn)的檢測(cè)，重點(diǎn)篩選影響基因表達(dá)水平的變異位點(diǎn)，分析其多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)系，旨在尋找南方黃牛肉質(zhì)調(diào)控相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為今后南方黃牛遺傳改良與優(yōu)質(zhì)育種提高一定的理論參考。

4 結(jié) 論

3種南方黃牛（西門(mén)塔爾牛、云嶺牛、文山牛）在宰后排酸過(guò)程中，嫩度表現(xiàn)為明顯的下降趨勢(shì)，并且在相同排酸時(shí)間點(diǎn)下，剪切力值表現(xiàn)為西門(mén)塔爾牛＞文山牛＞云嶺牛，表明云嶺牛嫩度較好，而西門(mén)塔爾牛嫩度相對(duì)較差。本研究以西門(mén)塔爾牛和云嶺牛為對(duì)象，進(jìn)一步利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了南方黃牛肉質(zhì)調(diào)控的分子機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路2個(gè)信號(hào)通路與肉質(zhì)調(diào)控相關(guān)，篩選出Leptin和CAPN1 2個(gè)關(guān)鍵功能候選基因。

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Molecular Mechanism Analysis of Meat Tenderness in Chinese South Cattle Based on RNA-Seq Transcriptome Sequencing Technology

MENG Xiang‐ren1, ZHANG Cheng‐long1, FAN Yong‐liang1, WANG Wen‐qiang1, MAO Yong‐jiang1, HUANG Bi‐zhi2, QU Kai‐xing2, YANG Zhang‐ping1*

( 1. Animal Science and Technology College, Yangzhou university, Jiangsu Yangzhou 225009, China; 2.Grassland and Animal Research Institute, Yunnan KunMing 650000, China)

To reveal the molecular mechanism of meat quality and excavate function genes related to tenderness in Chinese south cattle, this study selected Yunling, Wenshan and Simmental cattle at approximately 12 months of age as experimental object. Firstly, after slaughter, muscle tenderness of above cattle was measured at dif f erent stages of acid discharge (0, 1, 2, 3, 5, 7d), which aimed at revealing the dif f erences of meat quality among three varieties. Using transcriptome sequencing and bioinformatics analysis, we screened out dif f erential expression genes related to meat quality, then real‐time fl uorescence quantification PCR was further performed. Results showed, meat tenderness of three varieties (Yunling, Wenshan and Simmental) showed a decreasing trend at dif f erent stages of acid discharge. At the same stage of acid discharge, the value

of shear force showed the highest in Simmental, followed by Wenshan and Yunling, which indicated that the tenderness of Yunling was relatively good and Simmental was relatively poor. After cDNA library sequencing of longissimus dorsi between Yunling and Simmental, we screened out 3198 dif f erential expression genes, of which 1750 genes were up‐regulated in Yunling. Additionally, we found two important pathways related to meat quality, such as adipocytokine signaling pathway and protein processing in endoplasmic reticulum. Further qPCR verif i cation and correlation analysis between gene expression level and shear force value, we ultimately identif i ed Leptin and CAPN1 genes related to meat tenderness. This study screened and identif i ed important pathways and key genes regulating meat tenderness, which will provide theoretical basis for genetic improvement of meat quality in Chinese south cattle.

Chinese south cattle; Tenderness; Transcriptome

S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-09-026

2017-05-20；

2017-07-06

863國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA10250 5-5）

孟祥忍（1977-），男，博士，副教授，主要從事烹飪工藝學(xué)研究，E-mail: 455609455@ qq. com

*通訊作者：楊章平（1965-），男，博士，教授，主要從事動(dòng)物遺傳資源評(píng)價(jià)、保護(hù)與利用的研究，E-mail: yzp@ yzu.edu.cn