徐 翔 何慶文 肖才文 辛 鵬

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院)耳鼻咽喉科，武漢430015)

IL-35抑制炎癥反應(yīng)和T細(xì)胞反應(yīng)性減輕變應(yīng)性鼻炎的機制研究

徐 翔 何慶文①肖才文 辛 鵬

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院)耳鼻咽喉科，武漢430015)

目的：探討IL-35在變應(yīng)性鼻炎中對炎癥反應(yīng)和T細(xì)胞反應(yīng)性的作用及其機制。方法：選取2012年1月至2016年1月間本院收治的37例變應(yīng)性鼻炎患者(觀察組)及35例行變應(yīng)性鼻炎過敏原檢測后排除變應(yīng)性鼻炎的健康志愿者(對照組)為研究對象，采集觀察組和對照組的外周血液，ELISA檢測患者血清中IL-35水平。建立小鼠變應(yīng)性鼻炎動物模型，收集小鼠外周血液，ELISA檢測小鼠血清中IL-35及IgE水平。小鼠鼻切片后組織染色檢測嗜酸性粒細(xì)胞；分離小鼠脾臟細(xì)胞后加入卵清蛋白抗原，加入或不加入IL-35至培養(yǎng)基中，檢測卵清蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)性；ELISA檢測T細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13,IL-17、 IL-23、IL-27以及TNF-α含量；熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測培養(yǎng)T細(xì)胞中IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-23、IL-27以及TNF-α mRNA表達(dá)水平；Western blot 檢測培養(yǎng)T細(xì)胞JNK、Erk1/2及p38信號途徑的激活水平。結(jié)果：觀察組血清IL-35水平顯著低于對照組(P<0.05)；變應(yīng)性鼻炎組小鼠組織染色結(jié)果顯示嗜酸性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量顯著高于正常組(P<0.05)，而血清IL-35水平則顯著低于正常小鼠(P<0.05)； 卵清蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)性檢測顯示IL-35能顯著抑制其反應(yīng)性；ELISA及Real-time PCR結(jié)果均顯示，IL-35能夠顯著下調(diào)IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-23及TNF-α的表達(dá)，上調(diào)IL-2、IL-10及IL-27的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，IL-35能夠顯著抑制卵清蛋白特異性T細(xì)胞中JNK、Erk1/2及p38信號途徑的激活水平。結(jié)論：IL-35能夠調(diào)控炎癥反應(yīng)中的炎癥因子表達(dá)和T細(xì)胞的反應(yīng)性，從而減輕變應(yīng)性鼻炎，其機制可能是通過調(diào)控JNK、Erk1/2及p38信號途徑的激活水平。

IL-35；炎癥；T細(xì)胞反應(yīng)性；變應(yīng)性鼻炎

變應(yīng)性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)是機體接觸致敏原后由免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)引起的鼻腔黏膜炎癥性疾病。AR的主要癥狀是打噴嚏、流涕、鼻塞、鼻癢，此外約60%～70%的患者還經(jīng)常會伴有眼睛癢或紅腫流淚[1]。盡管AR不會對患者的生命造成威脅，但其癥狀往往會影響患者的工作和生活質(zhì)量，給個人及社會產(chǎn)生很大的負(fù)擔(dān)。它能導(dǎo)致患者產(chǎn)生身體和精神并發(fā)癥，特別是在青少年，能夠引起睡眠呼吸紊亂、行為和注意力障礙，從而影響青少年的學(xué)習(xí)成績[2]。在我國，隨著工業(yè)化進程的發(fā)展、現(xiàn)代生活方式的改變、生態(tài)環(huán)境的持續(xù)破壞、霧霾持續(xù)的加重等因素，導(dǎo)致我國AR發(fā)病率呈逐年上升趨勢[3]。AR的發(fā)病是由多因素造成的，其發(fā)病機制和影響其發(fā)生的因素十分復(fù)雜，但最主要的病理過程是非感染性的炎癥，因此，控制該疾病病理過程中的炎癥反應(yīng)能有效地控制疾病的癥狀[4]。IL-35是近年來發(fā)現(xiàn)的IL-12家族成員之一，它被發(fā)現(xiàn)具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。研究表明，在塵螨誘導(dǎo)的過敏性哮喘中，IL-35能夠抑制支氣管肺泡灌洗液中的IgE、IL-4、IL-5及IL-13的產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應(yīng)[5]。但I(xiàn)L-35在變應(yīng)性鼻炎中的作用目前仍知之甚少。本研究擬初步探討IL-35在AR中的表達(dá)及其對AR的影響。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1患者及標(biāo)本 選取本院2012年1月至2016年1月間本院收治的37例變應(yīng)性鼻炎患者為觀察組，其中男20例，女17例，年齡15～49歲，平均(30.6±18.1)歲。同期選擇35例在本院行變應(yīng)性鼻炎過敏原檢測后排除變應(yīng)性鼻炎的健康志愿者(對照組)為對照組，其中男19例，女16例，年齡14～47歲，平均(31.4±16.2)歲。抽取兩組患者的外周血液并制備血清備用。

1.1.2試劑與設(shè)備 主要試劑包括RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素購自美國Sigma公司，JNK、p-JNK、Erk1/2、p-Erk1/2、p38、p-p38、beta-actin抗體購自Abcam(均為兔單克隆抗體)，ECL試劑Thermo fisher，Real-time PCR Master Mix購自TOYOBO，人IL-35 ELISA試劑盒和重組人IL-35購自美國R&D Systems，小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-23、IL-27、 IL-35以及TNF-α ELISA試劑盒購自Elabscience Biotechnology，總RNA提取試劑盒、細(xì)胞裂解液、PMSF(蛋白酶抑制劑)及BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，Real-time PCR 引物由上海生工合成，Mouse IL-2:sense 5′-GAGCCTTATGTGTTGTAAGC-3′,antisense 5′-GTGCTCCTTGTCA-ACAGCGC-3′;Mouse IL-4:sense 5′-CATGGTGGCTC-AGTACTACG-3′,antisense 5′-TCTTTCTCGAATGTAC-CAGG-3′;Mouse IL-5:sense 5′-TCCCTGCTACTCTCCCCAAAC-3′,antisense5′-TGGCACAGTCTGATTCA-TACATAGG-3′;Mouse IL-10:sense 5′-GGACAACAT-ACTGCTAACCGAC-3′,antisense 5′-AAAATCACTCTTCACCTGCTCC-3′;Mouse IL-13:sense 5′-GCTTATTGAGGAGCTGAGCAACA-3′,antisense 5′-GGCCAGGTCCACACTCCATA-3′;Mouse IL-17:sense 5′-CTGC-TGAGCCTGGCGGCTAC-3′,antisense 5′-CATTGCGGTGGAGAGTCCAGGG-3′;Mouse IL-23:sense 5′-TGCTGGATTGCAGAGCAGTAA-3′,antisense 5′-CTGGAGGAGTTGGCTGAGTC-3′;Mouse IL-27:sense 5′-GGCCAGGTGACAGGAGACC-3′,antisense 5′-CAGC-TTGTACCAGAAGCAAGGG-3′;Mouse TNF-α:sense 5′-TCTTGAGGCCACTTTCTGCT-3′，antisense 5′-ACTCATCCTCCACGTCCTTG-3′； Mouse GAPDH:sense 5′-GCCTCGTCCCGTAGACAAAA-3′，antisense 5′-GATGGGCTTCCCGTTGATGA-3′。 SDS-PAGE試劑購自Bio-Rad。主要設(shè)備包括CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺， 實時熒光定量PCR儀、熒光顯微鏡，Bio-Rad垂直電泳儀，Bio-Rad Western blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入研究的觀察組患者診斷均符合AR診斷標(biāo)準(zhǔn)，參照AR診斷和治療指南(2009年，武夷山)：(1)有以下2項以上的臨床癥狀，且每天癥狀持續(xù)或累計在1 h以上：噴嚏、流清水樣涕、鼻塞、鼻癢。此外可伴有眼癢、結(jié)膜充血等眼部癥狀。(2)體征：鼻內(nèi)鏡檢查常見鼻黏膜蒼白、水腫，鼻腔水樣分泌物。(3)皮膚點刺激試驗：使用標(biāo)準(zhǔn)化變應(yīng)原試劑，在患者前臂掌側(cè)皮膚點刺激，設(shè)置陰性和陽性對照，20 min后出現(xiàn)陽性結(jié)果即可判斷。(4)血清特異性IgE檢測升高。確診AR需臨床表現(xiàn)結(jié)合皮膚點試驗，結(jié)果陽性或血清特異性IgE升高。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除并發(fā)惡性腫瘤、鼻部其他疾病、高血壓、其他過敏性疾病及自身免疫性疾病、嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)疾病患者。所有患者均簽署知情同意書，研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2小鼠AR模型建立及小鼠脾臟CD4+CD25-T細(xì)胞分離及培養(yǎng) 96只8周齡的BALB/c 小鼠購自武漢大學(xué)試驗動物中心，根據(jù)實驗設(shè)計，在第0天和第14天給小鼠每天2次注射2 mg Al(OH)3，根據(jù)分組，實驗組小鼠除給以上處理外，在第21天至27天鼻腔給予卵清蛋白(200 μg/d)。在最后一次給藥后，根據(jù)參考文獻(xiàn)的方法[6]，記錄20 min內(nèi)小鼠打噴嚏和鼻摩擦運動的次數(shù)，并在第28天時采集所需鼻腔黏膜組織、小鼠外周血液、脾臟。將分離小鼠脾臟，參照文獻(xiàn)的方法[7]，利用磁珠分選法從小鼠脾臟分離CD4+CD25-T細(xì)胞，分離后計數(shù)，然后根據(jù)實驗設(shè)計，將細(xì)胞培養(yǎng)于六孔板中，每孔加入2×106個細(xì)胞，加入終濃度為10 μg/ml的OVA抗原培養(yǎng)，然后加入或不加入終濃度為20 ng/ml 的IL-35細(xì)胞因子共培養(yǎng)。

1.2.3卵清蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)性檢測 在加入終濃度為10 μg/ml的OVA抗原后加入或不加入終濃度為20 ng/ml 的IL-35細(xì)胞因子共培養(yǎng)的CD4+CD25-T細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，向其中加入1 μCi的[3H]胸腺嘧啶核苷后再培養(yǎng)16 h，按照試劑盒說明書將細(xì)胞收集至玻璃纖維過濾器，然后采用放射性液體閃爍計數(shù)器測定cmp值。

1.2.4ELISA檢測 IgE檢測參照文獻(xiàn)[8]的方法，收集血清，按照試劑盒的說明書，向板中加入血清，加入生物素標(biāo)記的OVA后，向板中加入抗生物素蛋白過氧化物酶孵育，加入顯色底物后按照說明書 450 nm 處測定光密度值。細(xì)胞因子檢測參照文獻(xiàn)的方法[9]，收集血清及細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明書檢測IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-23、IL-27、IL-35以及TNF-α的含量。

1.2.5Real-time PCR 總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Green Master Mix檢測人細(xì)胞中IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-23、IL-27以及TNF-α mRNA水平。

1.2.6Western blot檢測 將收集的細(xì)胞采用細(xì)胞裂解液充分裂解，同時加入PMSF防止蛋白降解，充分裂解后4℃離心機12 000 r/min離心5 min，取上清，BCA法蛋白定量后，加入5×loading buffer，沸水煮10 min后置冰上，然后進行SDS-PAGE，每孔加入40 μg蛋白，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜、洗膜(5 min×3次)、5%BSA封閉，封閉結(jié)束后洗膜(5 min×3次)，孵育單克隆一抗，4℃冰箱過夜，然后再次洗膜(5 min×3次)，加入HRP小鼠抗兔二抗孵育，37℃低速搖床1 h，結(jié)束后洗膜(5 min×3次)，然后配置化學(xué)發(fā)光試劑，ECL法曝光。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗均單獨重復(fù)3次，所得實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0軟件進行分析，組件比較采用單因素方差分析，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IL-35在AR患者中的表達(dá) AR患者外周血液中IL-35的表達(dá)結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示，AR患者外周血液中IL-35表達(dá)顯著低于正常健康人(P<0.001)。

圖1 IL-35在AR患者外周血液中的表達(dá)Fig.1 Expression of IL-35 in peripheral blood of patients with ARNote: *.P<0.001.

圖2 AR小鼠鼻組織切片中嗜酸性粒細(xì)胞檢測及外周血液中IgE及IL-35水平檢測Fig.2 Detection of eosinophils in nasal tissues of AR mice， and expression of IgE and IL-35 in peripheral blood of AR miceNote: *.P<0.001.

圖4 IL-35對卵清蛋白特異性T細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生的影響Fig.4 Production of cytokines that expressed by OVA specific T cell affected by IL-35Note: *.P<0.05,**.P<0.001.

圖3 卵清蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)性檢測Fig.3 Ovalbumin specific T cell response was detectedNote: *.P<0.001.

2.2AR小鼠鼻組織切片中嗜酸性粒細(xì)胞檢測及外周血液中IgE、IL-35水平檢測 AR模型小鼠鼻組織染色切片結(jié)果見圖2A，結(jié)果顯示，AR小鼠嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量顯著高于正常小鼠(P<0.05)。外周血液中IgE及IL-35水平檢測顯示(圖2B、C)，AR小鼠IgE水平顯著高于正常小鼠，而IL-35則顯著低于正常小鼠(P<0.05)。

2.3卵清蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)性檢測 卵清蛋白特異性T細(xì)胞反應(yīng)性檢測結(jié)果見圖3，結(jié)果顯示，IL-35能夠顯著抑制卵清蛋白特異性T細(xì)胞的反應(yīng)性(P<0.05)。

圖5 IL-35對JNK、Erk1/2及p38信號途徑激活水平影響Fig.5 Effect of IL-35 on activation of JNK,Erk1/2 and p38 signaling pathway

2.4IL-35對卵清蛋白特異性T細(xì)胞炎癥因子的影響 IL-35對卵清蛋白特異性T細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響見圖4，結(jié)果顯示，IL-35能夠顯著抑制IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-23及TNF-α的表達(dá)(圖4A、B)，而顯著上調(diào)IL-2、IL-10及IL-27的表達(dá)(圖4C、D)。

2.5IL-35對JNK、Erk1/2及p38信號途徑激活水平影響 IL-35對JNK、Erk1/2及p38信號途徑激活水平影響見圖5，結(jié)果顯示，IL-35能夠顯著抑制JNK、Erk1/2及p38的磷酸化水平，即能顯著抑制JNK、Erk1/2及p38信號途徑的激活。

3 討論

IL-35是近年來發(fā)現(xiàn)的IL-12家族新成員，它是一種重要的炎癥抑制細(xì)胞因子。研究表明，IL-35是一種負(fù)向調(diào)控蛋白，它通過抑制T淋巴細(xì)胞的增殖及效應(yīng)功能發(fā)揮其生理活性功能[10]。此外，IL-35對Treg細(xì)胞的抑制功能發(fā)揮也具有重要的作用。已有報道顯示，在多種非致命性自身免疫反應(yīng)疾病模型中，當(dāng)功能性的IL-35表達(dá)下調(diào)后， Treg細(xì)胞的抑制功能明顯降低，機體的炎癥反應(yīng)也進一步加重[11]。值得注意的是，有研究表明，在過敏性哮喘患者體內(nèi)，IL-35蛋白及mRNA水平均顯著低于健康對照人群，而患者血漿中的IL-4及IL-17則顯著高于健康對照，此外，患者血清總IgE、IL-4、嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)也顯著高于健康對照，IL-35與以上指標(biāo)呈明顯的負(fù)相關(guān)[12]。這表明，IL-35可能作為一種重要的負(fù)向調(diào)控細(xì)胞因子，在機體免疫功能異常中扮演著重要的角色。而AR作為一種過敏性的非感染性炎癥性疾病，主要原因是致敏原導(dǎo)致機體細(xì)胞免疫功能出現(xiàn)異常。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在AR中，IL-35的表達(dá)明顯低于正常健康人，進一步的研究則表明，IL-35能夠降低致敏原導(dǎo)致的T細(xì)胞的反應(yīng)性，同時還能調(diào)控部分炎癥因子的表達(dá)從而抑制AR的炎癥反應(yīng)。

眾所周知，在AR的發(fā)病過程中，CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯增多，這一異常增多，導(dǎo)致IL-2家族某些成員的異常升高表達(dá)，如IL-4、IL-5、IL-13等[13,14]。研究表明，IL-4、IL-5、IL-13在過敏性哮喘、AR的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著非常重要的作用[12]。因此，調(diào)控IL-4、IL-5、IL-13的表達(dá)，能夠降低AR過程中的炎癥反應(yīng)，在本研究中，IL-35能夠顯著降低CD4+CD25-T細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13。IL-12、IL-23、IL-27及IL-35是IL-12家族的成員，有研究表明，IL-23信號途徑能夠提高Th2的極化水平，當(dāng)小鼠過表達(dá)IL-23后，支氣管肺泡沖洗液中的嗜酸性粒細(xì)胞和血清中IgE、IL-23、IL-17及IL-4水平則顯著升高，而當(dāng)沉默IL-23 RNA后，則正好相反[15]。在本研究中，IL-35能夠顯著抑制IL-23的表達(dá)，這表明，IL-35可能是通過調(diào)控IL-23的表達(dá)，從而抑制AR的炎癥反應(yīng)。IL-27在免疫反應(yīng)中具有兩種不同的功能，其一可以作為Th1型免疫反應(yīng)的引發(fā)劑，另一種是作為免疫或炎癥反應(yīng)的衰減器[16]。研究表明，在卵清蛋白致敏的小鼠，鼻腔給予IL-27可抑制卵清蛋白誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥[17]。因此，IL-27可能是治療Th2細(xì)胞相關(guān)疾病的一個新的治療靶點，如支氣管哮喘、變應(yīng)性鼻炎等。在本研究中，IL-35能顯著上調(diào)IL-27的表達(dá)，這一結(jié)果表明，IL-35在AR小鼠模型中，可能是通過上調(diào)IL-27的表達(dá)從而減輕變應(yīng)性鼻炎。

IL-17在驅(qū)動中性粒細(xì)胞浸潤至氣道中起著關(guān)鍵的作用[18]。研究表明，鼻腔黏膜中IL-17的表達(dá)與鼻腔嗜酸性粒細(xì)胞增多癥和AR的臨床嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，IL-35在AR模型小鼠中能夠抑制CD4+CD25-T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17。此外，IL-23也具有誘導(dǎo)幼稚前體T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞的能力，并誘導(dǎo)CD4 Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17[20]，因此，IL-35減輕變應(yīng)性鼻炎的機制之一可能是通過抑制IL-23的產(chǎn)生，從而降低Th17細(xì)胞的反應(yīng)，減少IL-17的產(chǎn)生。此外，在過敏原驅(qū)動的氣道炎癥小鼠模型中，TNF-α能通過上調(diào)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子從而介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在炎癥組織中的募集[21]。而在小鼠AR模型中，抗TNF-α治療后，能明顯減輕AR的過敏反應(yīng)、減少鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、降低總IgE和特異性IgE水平、抑制Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生[22]。在本研究中，IL-35能夠抑制TNF-α的表達(dá)，這提示IL-35調(diào)控TNF-α可能是其抑制AR過敏反應(yīng)的機制之一。IL-2在天然免疫自身耐受的維護中起著至關(guān)重要的作用[23]，本研究結(jié)果表明，IL-35能夠顯著的增加IL-2的量，這提示IL-35在AR中可能是通過調(diào)控IL-2從而誘導(dǎo)天然免疫自身耐受。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-10能減輕鼻黏膜過敏[24]，為此，我們檢測了AR模型小鼠中IL-35對CD4+CD25-T細(xì)胞IL-10表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，IL-35能夠上調(diào)IL-10的表達(dá)。這提示，IL-35不僅誘導(dǎo)CD4效應(yīng) T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞，同時還能通過增加IL-10的表達(dá)量促進Treg細(xì)胞的存活。

研究表明，IL-35能夠通過抑制MAPK信號途徑的激活而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的激活，從而抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)[25]。為此，我們檢測了AR模型中，IL-35對CD4+CD25-T細(xì)胞MAPK信號途徑的影響，結(jié)果顯示，IL-35能夠明顯抑制JNK、Erk1/2及p38的激活水平，這提示，IL-35可能是通過抑制MAPK信號途徑的激活從而減輕AR的，其具體機制尚需深入研究。

綜上所述，我們的研究闡明了IL-35在AR中的表達(dá)變化，同時我們也發(fā)現(xiàn)，在AR中，IL-35通過抑制炎癥反應(yīng)和T細(xì)胞的反應(yīng)性，減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而減輕變應(yīng)性鼻炎。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在AR病理過程中，IL-35能夠抑制MAPK信號途徑的激活，其減輕變性鼻炎的機制是否是通過該信號途徑實現(xiàn)的，尚需進一步的研究證明。

[1] 李華斌.變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機制及診治進展[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2014,49(4):347-352.

[2] 張念武，董曦文，王利霞，等.變應(yīng)性鼻炎患者的生活質(zhì)量狀況及影響因素[J].山東醫(yī)藥,2014,54(13):78-79.

[3] 張羅.變應(yīng)性鼻炎是臨床嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2014,49(4):265-267.

[4] 梁美君，徐 睿，許 庚.變應(yīng)性鼻炎研究新進展[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2015,29(3):202-206.

[5] Whitehead GS,Wilson RH,Nakano K,etal.IL-35 production by inducible costimulator(ICOS)-positive regulatory T cells reverses established IL-17-dependent allergic airways disease[J].J Allergy Clin Immunol,2012,129(1):207-215.

[6] Suzuki M,Zheng X,Zhang X,etal.A novel allergen-specific therapy for allergy using CD40-silenced dendritic cells[J].J Allergy Clin Immunol,2010,125(3):737-743.

[7] Odeh AN,Simecka JW.Regulatory CD4+CD25+T cells dampen inflammatory disease in murine mycoplasma pneumonia and promote IL-17 and IFN-γ responses[J].PLoS One,2016,11(5):e0155648.

[8] Amo G,García-Menaya J,Campo P,etal.A nonsynonymous FCER1B SNP is associated with risk of developing allergic rhinitis and with IgE levels[J].Sci Rep,2016,6:19724.

[9] Yan B,Wei JJ,Yuan Y,etal.IL-6 cooperates with G-CSF to induce protumor function of neutrophils in bone marrow by enhancing STAT3 activation[J].J Immunol,2013,190(11):5882-5893.

[10] Li X,Mai J,Virtue A,etal.IL-35 is a novel responsive anti-inflammatory cytokine--a new system of categorizing anti-inflammatory cytokines[J].PLoS One,2012,7(3):e33628.

[11] Hu D.Role of Anti-inflammatory cytokines IL-35 and IL-37 in asthma[J].Inflammation,2017,40(2)：697-707.

[12] Huang CH,Loo EX,Kuo IC,etal.Airway inflammation and IgE production induced by dust mite allergen-specific memory/effector Th2 cell line can be effectively attenuated by IL-35[J].J Immunol,2011,187(1):462-471.

[13] Wills-Karp M,Luyimbazi J,Xu X,etal.Interleukin-13:central mediator of allergic asthma[J].Science,1998,282(5397):2258-2261.

[14] Benson M,Carlsson L,Guillot G,etal.A network-based analysis of allergen-challenged CD4+T cells from patients with allergic rhinitis[J].Genes Immun,2006,7(6):514-521.

[15] Peng J,Yang XO,Chang SH,etal.IL-23 signaling enhances Th2 polarization and regulates allergic airway inflammation[J].Cell Res,2010,20(1):62-71.

[16] Yoshida H,Nakaya M,Miyazaki Y.Interleukin 27:a double-edged sword for offense and defense[J].J Leukoc Biol,2009,86(6):1295-1303.

[17] Cao J,Wong CK,Yin Y,etal.Activation of human bronchial epithelial cells by inflammatory cytokines IL-27 and TNF-α:implications for immunopathophysiology of airway inflammation[J].J Cell Physiol,2010,223(3):788-797.

[18] Fogli LK,Sundrud MS,Goel S,etal.T cell-derived IL-17 mediates epithelial changes in the airway and drives pulmonary neutrophilia[J].J Immunol,2013,191(6):3100-3111.

[19] Guo C,Chen G,Ge R.IL-23,rather than IL-17,is crucial for the development of ovalbumin-induced allergic rhinitis[J].Mol Immunol,2015,67(2 Pt B):436-443.

[20] Hunter CA.New IL-12-family members:IL-23 and IL-27,cytokines with divergent functions[J].Nat Rev Immunol,2005,5(7):521-531.

[21] Lukacs NW,Strieter RM,Chensue SW,etal.TNF-α mediates recruitment of neutrophils and eosinophils during airway inflammation[J].J Immunol,1995,154(10):5411-5417.

[22] Mo JH,Kang EK,Quan SH,etal.Anti-tumor necrosis factor-alpha treatment reduces allergic responses in an allergic rhinitis mouse model[J].Allergy,2011,66(2):279-286.

[23] Banchereau J,Pascual V,O′Garra A.From IL-2 to IL-37:the expanding spectrum of anti-inflammatory cytokines[J].Nat Immunol,2012,13(10):925-931.

[24] Fu CL,Ye YL,Lee YL,etal.Effects of overexpression of IL-10,IL-12,TGF-beta and IL-4 on allergen induced change in bronchial responsiveness[J].Respir Res,2006,7:72.

[25] Sha X,Meng S,Li X,etal.Interleukin-35 inhibits endothelial cell activation by suppressing MAPK-AP-1 pathway[J].J Biol Chem,2015,290(31):19307-19318.

[收稿2017-01-10 修回2017-03-05]

(編輯 許四平 劉格格)

MechanismofIL-35inhibitionofinflammatoryresponseandTcellresponseinalleviateofallergicrhinitis

XUXiang,HEQing-Wen,XIAOCai-Wen,XINPeng.

ENTHypersensitivityDepartment,AffiliatedHospitalofJianghanUniversity(TheSixthHospitalofWuhan),Wuhan430015，China

Objective:To investigate the effect of IL-35 on inflammatory response and T cell response in allergic rhinitis.Methods: 37 patients(observation group) with allergic rhinitis and 35 healthy volunteers(control group) after allergen detection of allergic rhinitisin in our hospital from Jan 2012 to Jan 2016 were selected as study subjects.The peripheral blood of observation group and control group were collected,and the serum levels of IL-35 were detected by ELISA.The animal model of allergic rhinitis in mice was established,the peripheral blood of mice was collected,and the serum level of IL-35 and IgE were detected by ELISA.The eosinophils that infiltrated in nasal mucosa were detected after tissue biopsy in mice.The mouse spleen cells were isolated and the ovalbumin antigen was added in the culture medium,IL-35 was or was not added into the culture medium,the ovalbumin specific T cell responses was detected.The cytokines IL-2,IL-4,IL-5,IL-10,IL-13,IL-17,IL-23,IL-27 and TNF-α in culture supernatant of ovalbumin specific T cells were detected by ELISA.The expression of IL-2,IL-4,IL-5,IL-10,IL-13,IL-17,IL-23,IL-27 and TNF-α in ovalbumin specific T cells were detected by Real-time PCR.The activation of JNK,Erk1/2 and p38 signal pathway in ovalbumin specific T cells were detected by Western blot.Results: The serum level of IL-35 in observation group was significantly lower than control group(P<0.05).The results showed that the number of eosinophils which infiltrated in AR mice nasal mucosa was significantly higher than normal mice(P<0.05),while the serum level of IL-35 in AR mice was significantly lower than normal mice(P<0.05).Ovalbumin specific T cell reactivity assay showed that IL-35 could significantly inhibit the T cell response.ELISA and Real-time PCR results showed that IL-35 could significantly down regulate the expression of IL-4,IL-5,IL-13,IL-17,IL-23 and TNF-α,and up regulate the expression of IL-2,IL-10 and IL-27.The Western blot results showed that IL-35 can inhibit the activation of JNK,Erk1/2 and p38 signal pathway of ovalbumin specific T in cells.Conclusion: IL-35 can regulate the expression of inflammatory cytokines in inflammatory response and inhibit T cell response,thus reducing allergic rhinitis,the mechanism may be through regulation of JNK,Erk1/2 and p38 signal pathway activation.

IL-35;Inflammation;T cell response;Allergic rhinitis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.023

徐 翔(1980年-)，男，主治醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉方面的研究，E-mail：xuxiang34451@163.com。

及指導(dǎo)教師：辛 鵬(1980年-)，男，主治醫(yī)師，主要從事變態(tài)反應(yīng)方面的研究。

R765.21

A

1000-484X(2017)09-1386-06

①江漢大學(xué)附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院)變態(tài)反應(yīng)科，武漢430015。