胡青青 趙肅清 賀 攀 焦洛瑩

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院,廣州510006)

抗須癬毛癬菌細(xì)胞壁蛋白的卵黃抗體制備和鑒定

胡青青 趙肅清 賀 攀 焦洛瑩

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院,廣州510006)

目的：提取須癬毛癬菌的細(xì)胞壁蛋白作為免疫原制備特異性卵黃抗體，并鑒定其生物活性,為卵黃抗體在預(yù)防與治療皮膚癬疾病的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法：本研究采用冷堿抽提的方法提取須癬毛癬菌的細(xì)胞壁蛋白，并用其免疫健康的產(chǎn)蛋母雞。采用聚乙二醇兩步沉淀法及飽和硫酸銨鹽析提純卵黃抗體；用Bradford法檢測(cè)卵黃抗體中蛋白含量；SDS-PAGE凝膠電泳分析測(cè)定卵黃抗體的純度以及相對(duì)分子質(zhì)量；ELISA檢測(cè)純化的卵黃抗體的效價(jià)；Western blot分析特異性卵黃抗體的免疫反應(yīng)性。結(jié)果：提取的卵黃抗體中蛋白純度達(dá)到87.27%。由細(xì)胞壁蛋白制備的特異性卵黃抗體在初免20 d后效價(jià)開始升高，到45天達(dá)到最高值(1∶32 000)。Western blot結(jié)果顯示由細(xì)胞壁蛋白制備的卵黃抗體能與其良好的特異性結(jié)合，具有較好的免疫反應(yīng)性。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)提取的須癬毛癬菌細(xì)胞壁蛋白作為免疫原可以制備出特異性較強(qiáng)的卵黃抗體，為須癬毛癬菌感染的皮膚疾病提供了治療新思路。

須癬毛癬菌；細(xì)胞壁蛋白；卵黃抗體

須癬毛癬菌是引起皮膚癬疾病的主要病原之一，是一類侵犯人體角蛋白組織的絲狀真菌[1,2]，能感染人體皮膚、指(趾)甲和毛發(fā)等而引起皮膚癬菌病，還可以引起膿癬、膿腫和肉芽腫等皮膚深部感染。目前，針對(duì)由皮膚癬菌引起的疾病主要通過(guò)抗真菌的藥物、激光等進(jìn)行治療[3-6]。市面上治療皮膚癬類疾病的藥物主要有酮康唑、氟康唑和伊曲康唑等。此外，還有一些植物的精油提取物[7,8]。然而，隨著真菌感染率的不斷升高,現(xiàn)有抗真菌藥物耐藥性日趨嚴(yán)重，并且治療周期長(zhǎng)，見效慢，病情的反復(fù)性，給個(gè)人、家庭甚至社會(huì)都帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。因此，研發(fā)出安全、高效的抗菌制劑以解決緊迫的市場(chǎng)需要變得更為迫切。

近年來(lái)，由于卵黃抗體生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)安全，利用細(xì)菌、真菌、病毒作為免疫原制備卵黃抗體成為一個(gè)熱門[9]。朱思思等[10]制備了抗腸道病毒71型特異性卵黃抗體，為進(jìn)一步研發(fā)含有抗EV71 IgY的預(yù)防治療產(chǎn)品提供了前期工作。胥亞夫等[11]以3種主要的腐敗菌腐敗希瓦氏菌、熒光假單胞菌和腐臭假單胞菌作為混合抗原制備了卵黃抗體，這種卵黃抗體對(duì)于這三種細(xì)菌均有抑制作用。Ibrahim等[12]的研究表明抗白色念珠菌的卵黃抗體不僅能夠體外抑制白色念珠菌對(duì)宿主細(xì)胞的吸附作用，在體內(nèi)也能夠有效地治療小鼠的口腔感染。

本文提取了須癬毛癬菌的細(xì)胞壁蛋白作為免疫原，制備特異性卵黃抗體。利用ELISA、SDS-PAGE凝膠電泳和免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵黃抗體的生物活性。根據(jù)SDS-PAGE和Western blot結(jié)果，卵黃抗體與提取的須癬毛癬菌細(xì)胞壁蛋白特異性結(jié)合?？箃mCWP的IgY的制備為由其感染的皮膚癬疾病的預(yù)防和治療方案的研發(fā)提供了基礎(chǔ)性研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株 須癬毛癬菌(GIM 3.598)由中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚科提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 廣州太和良田養(yǎng)雞場(chǎng)健康產(chǎn)蛋母雞4只，未經(jīng)任何免疫，正常飼養(yǎng)。

1.1.3主要培養(yǎng)基 沙氏瓊脂培養(yǎng)基，沙氏液體培養(yǎng)基。

1.1.4主要試劑和儀器 弗氏佐劑(Freund′s adjuvant)購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗雞 IgY二抗購(gòu)自Promega公司；PEG6000為日產(chǎn)購(gòu)自廣東國(guó)奧生物科技公司；BSA購(gòu)自上海博奧生物科技公司；考馬斯亮藍(lán)G250購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑有限公司，ECL發(fā)光液(Millipore,America)；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。酶標(biāo)分析儀Tecaninfinite 200(Tecan,Switzerland)；真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；高速冷凍離心Allegra TM64R Centrifuge(Beckman,America)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1真菌的培養(yǎng) 將須癬毛癬菌劃線接種到沙氏瓊脂培養(yǎng)基斜面，放置生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d(28℃)。用無(wú)菌的PBS沖洗孢子，轉(zhuǎn)入到沙氏液體培養(yǎng)基中，置于搖床培養(yǎng)5 d(28℃，160 r/min)。離心得到菌絲，用無(wú)菌的PBS反復(fù)沖洗，得到的沉淀冷凍干燥，放置-20℃保存。

1.2.2細(xì)胞壁蛋白的提取 須癬毛癬菌的細(xì)胞壁蛋白的提取方法參照張成省等[13]的冷堿抽提的方法并加以改進(jìn)。凍干的菌絲加入液氮反復(fù)研磨，加入適量的PBS溶解，加入200 μl的10 mmol/L PMSF，在冰浴中利用超聲細(xì)胞破碎儀充分破碎細(xì)胞，工作2 s，間隔5 s，處理300次。離心10 min(4℃，6 000 r/min)后得到沉淀，并用蒸餾水反復(fù)沖洗、離心，沉淀即為須癬毛癬菌的細(xì)胞壁組分。隨后，加入0.1 mol/L預(yù)冷的氫氧化鈉溶液，混合攪拌24 h，離心20 min(4℃，10 000 r/min)，得到上層清夜。用1 mol/L鹽酸中和至7 d，用1×PBS緩沖液(pH 7.2)透析3 d，透析液即為細(xì)胞壁蛋白。利用BCA試劑盒測(cè)定提取的蛋白濃度，并用PBS稀釋至 1 mg/ml。

1.2.3免疫方法 取1 mg/ml的蛋白溶液與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后，經(jīng)肌肉多點(diǎn)注射實(shí)驗(yàn)?zāi)鸽u，每只500 μl；間隔14 d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫采用弗氏不完全佐劑與蛋白溶液等體積混合乳化，共加強(qiáng)免疫4次。第二次免疫后收集雞蛋，連續(xù)收集3個(gè)月，按照天數(shù)進(jìn)行編號(hào)，取未免疫的雞蛋作為陰性對(duì)照。

1.2.4卵黃抗體的提純 將收集的雞蛋用75%的酒精浸泡消毒，破殼去除蛋清和蛋黃膜，收集卵黃液。采用PEG兩步沉淀的方法提取卵黃抗體[14]:加入卵黃液3倍體積的3.5%的PEG6000的PBS溶液，調(diào)節(jié)pH至7.2，攪拌40 min后，4℃靜置過(guò)夜。離心20 min(4℃，10 000 r/min)后取上清液，用4層紗布過(guò)濾,并緩慢加入固體PEG6000使最終濃度為12%，調(diào)pH至7.2，攪拌30 min。離心20 min(4℃，10 000 r/min)，棄上清得沉淀，即為IgY粗品。 沉淀用少量4℃ PBS(1 mol/L，pH7.2)溶解后，離心10 min(4℃，10 000 r/min)，取上層清液，緩慢滴加與濾液等體積的飽和硫酸銨溶液，4℃靜置過(guò)夜。離心10 min(4℃，10 000 r/min)，得到沉淀，用少量的PBS緩沖液(pH7.2)溶解，再加入1/2體積的飽和硫酸銨溶液，4℃靜置2 h。離心20 min(4℃，10 000 r/min)，得到沉淀物。再用少量的PBS溶解，轉(zhuǎn)入透析袋，透析3 d，收集透析液，在-60℃下真空冷凍干燥12 h，凍干粉放于-20℃保存。

1.2.5卵黃抗體的蛋白含量測(cè)定 采用Bradford法檢測(cè)卵黃抗體凍干粉中的蛋白含量。

1.2.6SDS-PAGE電泳 采用變性SDS-PAGE凝膠電泳(4%濃縮膠、12%分離膠)檢測(cè)提取的細(xì)胞壁蛋白；卵黃抗體粗品與純品的檢測(cè)采用4%濃縮膠，10%分離膠。

1.2.7間接ELISA法檢測(cè)卵黃抗體的效價(jià) 將須癬毛癬菌菌懸液用0.01 mol/L PBS 調(diào)至濃度為1.2×108CFU/ml，包被于96孔酶標(biāo)板上(100 μl/孔)，37℃溫浴2 h后，放置4℃過(guò)夜，用PBST洗滌3次，拍干。加入含3%脫脂奶粉的PBS作為封閉液(200 μl/孔)，37℃溫浴1 h后，倒出，用PBST洗滌3次，拍干。卵黃抗體用0.01 mol/L PBS倍比系列稀釋后加入96孔酶標(biāo)板(100 μl/孔)，37℃溫浴1 h后用PBST洗滌3次，拍干。加入1∶5 000稀釋后的酶標(biāo)二抗HRP-GAM IgY(100 μl/孔)，37℃溫浴 1 h，用PBST洗滌3次，拍干。加入TMB顯色液(100 μl/孔)放置37℃水浴15 min，2 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)(50 μl/孔)，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定OD=450 nm處的吸光值。以未免疫雞陰性IgY作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性孔值OD值≥陰性孔OD值的2.1倍的最高稀釋倍數(shù)為卵黃抗體的效價(jià)，且陰性IgY吸光值大于0.1作為抗體陽(yáng)性的判定閥值。

1.2.8免疫印跡(Western blot) 將SDS-PAGE凝膠電泳分離的細(xì)胞壁蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉作為封閉液，室溫封閉2 h，用TBST洗滌3次，每次15 min。卵黃抗體用0.01 mol/L PBS稀釋50倍，4℃孵育過(guò)夜，用TBST洗滌3次，HRP標(biāo)記山羊抗雞IgY 作為二抗，稀釋1∶5 000，孵育2 h，用TBST洗滌3次。最后滴加ECL發(fā)光液置于暗室曝光。

2 結(jié)果

2.1蛋白濃度的測(cè)定 采用BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞壁的蛋白濃度為1.312 4 mg/ml。Bradford法標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，得到的蛋白濃度計(jì)算公式為：y=0.006 4x+0.020 9,R2=0.991 5。由卵黃抗體的OD平均值為0.579 4可以算出，用須癬毛癬菌細(xì)胞壁蛋白制備的卵黃抗體的蛋白濃度為87.27 μg/ml，其蛋白純度為87.27%。

2.2SDS-PAGE凝膠電泳 須癬毛癬菌細(xì)胞壁蛋白的SDS-PAGE電泳圖表明(圖2)采用冷堿抽提的方法提取得到的主要蛋白條帶有7條，分子量約在34～130 kD的范圍內(nèi)。由卵黃抗體的SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖3)可見抗tmCWP的特異性IgY 在加熱情況下二硫鍵被還原打開，裂解成分子量約為70 KD的重鏈和25 kD的輕鏈。由PEG兩步沉淀法提取的卵黃抗體在90 kD，28～35 kD存在一些雜蛋白，經(jīng)過(guò)飽和硫酸銨溶液純化后的卵黃抗體純度明顯提高。

2.3ELISA 檢測(cè)IgY效價(jià) 用ELISA檢測(cè)抗tmCWP的IgY抗體效價(jià)及其消長(zhǎng)規(guī)律(圖4)。初免后約20 d卵黃中特異性抗體效價(jià)逐漸增長(zhǎng)，加強(qiáng)免疫后，效價(jià)呈明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)。當(dāng)初免后40 d卵黃抗體的效價(jià)達(dá)到了最高值1∶32 000，并且最高效價(jià)持續(xù)時(shí)間為40 d左右，初免后80 d，卵黃抗體的效價(jià)開始下降，95 d后效價(jià)降到最低。

2.4Western blot結(jié)果 抗tmCWP特異性IgY采用PEG兩步沉淀法和飽和硫酸銨法進(jìn)行提取和純化，并且對(duì)純化后的IgY用Western blot進(jìn)一步鑒定，證明其能與提取的tmCWP發(fā)生特異性結(jié)合。在130、95、68、62、47、38和34 kD處均有特異性結(jié)合，與此相反，陰性IgY則對(duì)tmCWP沒有任何反應(yīng)(圖5)。分子量為47 kD的蛋白可能為須癬毛癬菌的烯醇化酶，其余的蛋白可能為以共價(jià)鍵與糖類連接的結(jié)構(gòu)蛋白，也可能為殼多糖合成酶、甘露糖轉(zhuǎn)移酶和1,3-β葡聚糖合成酶的催化亞單位等參與細(xì)胞壁合成的關(guān)鍵酶，這與文獻(xiàn)相符[15,16]。由此說(shuō)明，所制備的抗tmCWP的IgY具有良好的抗tmCWP特異性。

圖1 BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of BSA

圖2 須癬毛癬菌細(xì)胞壁蛋白的SDS-PAGE電泳Fig.2 SDS-PAGE of tmCWPNote: 1 .Protein marker;2 .The tmCWP.

圖3 抗tmCWP特異性IgY的SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE pattern of anti-tmCWP special IgYNote: 1 .Protein marker;2.IgY extracted by PEG6000;3.IgY purified by saturated ammonium sulfate.

圖4 抗tmCWP的IgY抗體效價(jià)消長(zhǎng)規(guī)律Fig.4 Development pattern of anti-tmCWP IgY

3 討論

采用液氮研磨和超聲細(xì)胞破碎儀破壁，得到的細(xì)胞壁純度較高，由胞質(zhì)所引起的實(shí)驗(yàn)誤差降低[13]。由于真菌的細(xì)胞壁上存在大量多糖，影響細(xì)胞壁上蛋白質(zhì)的提取，本文采用冷堿抽提的方法提取細(xì)胞壁蛋白，預(yù)冷后的氫氧化鈉能夠有效地提取細(xì)胞壁上的蛋白組分，并且減少細(xì)胞壁上多糖的影響。提取的低溫環(huán)境能夠降低提取蛋白的降解及變性。另外，采用透析的方法減少提取蛋白中小離子雜質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)采用PEG兩步沉淀法提取卵黃抗體是比較常規(guī)的方法。制備周期短，操作簡(jiǎn)單，便于實(shí)驗(yàn)室大量提取卵黃抗體。相比直接加入硫酸銨固體的方法，采用飽和硫酸銨溶液滴加方法能夠減少因局部濃度過(guò)大導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性。得到的卵黃抗體中蛋白含量達(dá)到87.27%。

須癬毛癬菌的細(xì)胞壁主要是由β-(1,3)-葡聚糖、甘露糖蛋白、殼多糖等成分組成，參與細(xì)胞壁合成途徑的各類酶是理想的作用靶點(diǎn)。烯醇化酶是位于真菌胞外的細(xì)胞壁表面的管家蛋白[17]，可能是引起人類真菌感染的主要變應(yīng)原并增強(qiáng)了真菌的毒力效應(yīng)。以須癬毛癬菌細(xì)胞壁蛋白作為免疫原，通過(guò)免疫母雞獲得抗tmCWP的特異性卵黃抗體，采用ELISA檢測(cè)其效價(jià)達(dá)到1∶32 000。通過(guò)對(duì)比蛋白電泳圖和免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果，抗原抗體在分子量34～130 kD范圍內(nèi)對(duì)應(yīng)處均有特異性結(jié)合。本研究中提取的蛋白成分可能為須癬毛癬菌細(xì)胞壁的糖蛋白、合成酶以及烯醇化酶等。

圖5 免疫印跡分析Fig.5 Western blot analysisNote: 1 .Protein marker;2.Anti-tmCWP IgY;3.IgY combine with HRP affinipure rabbit anti-chicken IgY;4.Non-immunizated IgY.

皮膚癬真菌感染的第一步是黏附皮膚表皮細(xì)胞，然后出芽、產(chǎn)生菌絲入侵角質(zhì)層。皮膚癬菌與宿主細(xì)胞表面產(chǎn)生的特異性識(shí)別可能是通過(guò)真菌細(xì)胞壁蛋白與宿主細(xì)胞表面的碳水化合物結(jié)合[18]。IgY預(yù)防疾病的作用機(jī)理是通過(guò)特異性抗原抗體的結(jié)合，減少真菌對(duì)于宿主細(xì)胞的黏附，從而對(duì)宿主產(chǎn)生保護(hù)作用[19]。因此，本研究主要制備了抗tmCWP的特異性IgY，為研發(fā)治療須癬毛癬菌導(dǎo)致的皮膚癬疾病的藥物提供了基礎(chǔ)?？蛇M(jìn)一步研究其體外抑菌活性，建立感染須癬毛癬菌的豚鼠模型，檢測(cè)卵黃抗體的治療效果。具有抑菌效果的特異性卵黃抗體可作為產(chǎn)品添加劑，促進(jìn)其預(yù)防與治療效果。

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[收稿2017-03-02 修回2017-03-22]

(編輯 許四平 劉格格)

PreparationandidentificationofspecificchickeneggyolkimmunoglobulinsagainstcellwallproteinofTrichophytonmentagrophytes

HUQing-Qing,ZHAOSu-Qing,HEPan,JIAOLuo-Ying.

SchoolofChemicalEngineeringandLightIndustry,GuangdongUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China

Objective:Prepared the specific chicken egg yolk immunoglobulins (IgY) against the cell wall protein of Trichophyton mentagrophytes (tmCWP) and detected its biological activities,which was to establish the basis for the preventment and treatment in dermatophytes disease.Methods: In this work,tmCWP was extracted and purified by cold alkali method,and being used as immunogen to immunized healthy laying hens.The IgY was extracted from the egg yolk by polyethylene glycol method and purified by saturated ammonium sulfate method,respectively.The concentration of the extracted IgY was detected by Bradford method.The purity and molecular weight of the specific anti-tmCWP IgY were analysed by SDS-PAGE.The titer of IgY was obtained by ELISA.The immunoreactivity of IgY was performed by Western blot.Results: The purity of the extracted IgY reached to 87.27%.ELISA indicated that the titer of the specific anti-tmCWP IgY gradual rised 20 days after primary immunization and reached to the highest value (1∶32 000) after 45 days.Western blot revealed that the specific IgY showed a good immunoreactivity and a specifically combination capacity.Conclusion: In our work,the tmCWP could be regarded as the immunogen to prepare the specific anti-tmCWP IgY,which could provide a novel thought for the therapy of Trichophyton mentagrophytes infection.

Trichophyton mentagrophytes;Cell wall protein;IgY

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.015

胡青青(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事抗皮膚癬菌卵黃抗體的制備及性能研究，E-mail：hqq2218@126.com。

及指導(dǎo)教師：趙肅清(1969年-)，男，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事免疫學(xué)方面的研究，E-mail:sqzhao@gdut.edu.cn。

R318

A

1000-484X(2017)09-1350-05