馬永賓 葛鎖華 汪雪峰 蘇建華

(江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院，金壇213200)

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)RSC96細(xì)胞生物學(xué)功能的影響①

馬永賓 葛鎖華 汪雪峰②蘇建華

(江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院，金壇213200)

目的：探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)培養(yǎng)上清液對(duì)大鼠RSC96細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法：體外培養(yǎng)、純化SD大鼠BMSC并進(jìn)行鑒定；收集第3代BMSC培養(yǎng)上清液(BMSC-CM)；采用MTT法檢測(cè)BMSC-CM對(duì)RSC96細(xì)胞增殖的影響；平板克隆實(shí)驗(yàn)分析BMSC-CM對(duì)RSC96單個(gè)細(xì)胞增殖的影響；劃痕實(shí)驗(yàn)和TranswellTM小室實(shí)驗(yàn)分析BMSC-CM對(duì)RSC96細(xì)胞遷移的作用，Western blot法檢測(cè)BMSC-CM對(duì)RSC96細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的改變。結(jié)果：SD大鼠第3代BMSC形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，旋渦樣生長(zhǎng)；成骨染色為陽(yáng)性結(jié)果；成脂誘導(dǎo)后有脂滴出現(xiàn)；BMSC-CM作用后抑制RSC96細(xì)胞的增殖和遷移能力，且作用后的RSC96細(xì)胞Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低。結(jié)論：BMSC-CM促進(jìn)RSC96細(xì)胞凋亡，抑制其增殖和遷移。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；RSC96細(xì)胞；增殖；遷移

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)是一種具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞[1]。由于其可以在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，具有多向分化潛能且保持其遺傳性狀的穩(wěn)定，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，被認(rèn)為是組織工程的種子細(xì)胞。研究表明，BMSC體內(nèi)移植能促進(jìn)外周神經(jīng)損傷的再生修復(fù)。施萬(wàn)細(xì)胞是外周神經(jīng)損傷后促進(jìn)神經(jīng)再生營(yíng)養(yǎng)成分的主要來(lái)源，并且在促進(jìn)神經(jīng)損傷近端和遠(yuǎn)端的銜接上又發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[2]。有研究指出，BMSC-CM能顯著提高受損的神經(jīng)細(xì)胞的存活率，且保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受外界刺激因素的損傷[3,4]；然而B(niǎo)MSC-CM在對(duì)周?chē)窠?jīng)損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用的施萬(wàn)細(xì)胞的影響，仍然不明。為此，本實(shí)驗(yàn)以RSC96施萬(wàn)細(xì)胞株為研究對(duì)象，初步探討B(tài)MSC-CM對(duì)RSC96細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，從而探討B(tài)MSC-CM對(duì)外周神經(jīng)損傷的作用。

1 材料與方法

1.1材料 RSC96細(xì)胞購(gòu)自上海恒圓生物科技有限公司；低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco公司；小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體(Monoclonal antibody,mAb)、小鼠抗大鼠Bax mAb、小鼠抗大鼠Bcl-2 mAb購(gòu)自Immuway公司；辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司；MTT四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；成骨、成脂誘導(dǎo)液，茜素紅、油紅O染色液均購(gòu)自Cyagen公司；12 mm TranswellTM小室購(gòu)自Corning公司；全自動(dòng)凝膠成像儀購(gòu)自北京賽智公司；722型分光光度計(jì)購(gòu)自上海成光公司；倒置顯微鏡購(gòu)自Nikon公司；二氧化碳孵育箱購(gòu)自Formal公司。

1.2方法

1.2.1BMSC的分離及培養(yǎng) 取體質(zhì)量為80～100 g 的SD大鼠，安樂(lè)死后，75%酒精溶液消毒5～10 min；無(wú)菌條件下取股骨，用吸有PBS的1 ml無(wú)菌注射器沖洗骨髓于無(wú)菌平皿中，加入3滴抗生素(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml)靜置 1 min 混勻后，放于含有100 ml/L FBS 低糖DMEM 10 ml離心管中。1 000 r/min離心5 min，棄上清；用含有100 ml/L FBS低糖DMEM培養(yǎng)基重懸后，置于T25 培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2孵育箱培養(yǎng)。第4天首次換液去除不貼壁細(xì)胞，之后每間隔2 d換液一次，隨時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%，0.25%胰酶消化細(xì)胞，800 r/min離心5 min，然后用10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種于T25培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。此時(shí)雜細(xì)胞較多，待傳至第3代即可得到較為純凈的BMSC[5]，收集第3代BMSC，液氮冷凍貯存，備用。

1.2.2BMSC成骨分化誘導(dǎo) 取第3代對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BMSC，用含100 ml/L FBS低糖DMEM培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液，接種于24孔板(1×104個(gè)/孔)，第2天選取6孔換成成骨誘導(dǎo)液，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，誘導(dǎo)2周后，茜素紅染色，倒置顯微鏡拍照。

1.2.3BMSC成脂分化誘導(dǎo) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BMSC，用含100 ml/L FBS低糖DMEM培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液，接種于24孔板(1×104個(gè)/孔)，細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上，換成成脂誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)3周后，油紅O染色，倒置顯微鏡拍照。

1.2.4BMSC-CM的制備 計(jì)數(shù)BMSC細(xì)胞以5×105個(gè)/瓶，接種于T25培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液，12 h后提取培養(yǎng)液，0.2 pm濾膜過(guò)濾。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5MTT法檢測(cè)BMSC-CM對(duì)RSC96細(xì)胞的增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RSC96細(xì)胞，接種于96孔板(5 000個(gè)細(xì)胞/孔)，每孔加入180 μl不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基；置于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)過(guò)夜后，加入不同濃度的BMSC-CM，分別為10%BMSC-CM、20%BMSC-CM。設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、未經(jīng)BMSC-CM處理的RSC96細(xì)胞作為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μl MTT，37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)4 h，棄上清培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO溶液，振蕩器上搖勻10 min，酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm處的吸光度值。

1.2.6細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSC-CM對(duì)RSC96細(xì)胞的增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RSC96細(xì)胞，用含有100 ml/L FBS的高糖DMEM重懸，接種于6孔板(500個(gè)細(xì)胞/孔)，放置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜后更換含有不同濃度的BMSC-CM(10%BMSC-CM、20%BMSC-CM)，同時(shí)設(shè)未經(jīng)BMSC-CM處理的RSC96細(xì)胞作為對(duì)照組。每3 d換液1次，第6天棄去培養(yǎng)上清，PBS沖洗2～3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min；PBS沖洗2～3次，結(jié)晶紫染色15 min，PBS沖洗2～3次，拍照并計(jì)數(shù)每視野下細(xì)胞克隆個(gè)數(shù)。

1.2.7TranswellTM遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSC-CM對(duì)RSC96細(xì)胞遷移能力的影響 用不同濃度BMSC-CM(10%BMSC-CM、20%BMSC-CM)處理RSC96細(xì)胞24 h。收集處理后的RSC96細(xì)胞，用無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)基重懸后，以1×105/200 μl的劑量滴加于TranswellTM小室中，在下室中加入800 μl含100 ml/L FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)未經(jīng)BMSC-CM處理的RSC96細(xì)胞作為對(duì)照組。置于37℃、含5%CO2孵箱內(nèi)10 h；用鑷子小心拿出TranswellTM小室，吸干上室內(nèi)液體，棉簽除去小室內(nèi)未遷移細(xì)胞；PBS沖洗2～3次，將小室移入40 g/L多聚甲醛中進(jìn)行固定30 min，PBS沖洗2～3次；室溫下結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗2～3次，顯微鏡下隨機(jī)選擇小室直徑線上4個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)每視野下的細(xì)胞數(shù)。

1.2.8劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSC-CM對(duì)RSC96細(xì)胞遷移能力的影響 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RSC96細(xì)胞，用含有100 ml/L FBS高糖DMEM重懸。接種于6孔板(1×105/孔)，置于37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度大于80%。棄去上清培養(yǎng)液，無(wú)血清的高糖DMEM培養(yǎng)基漂洗2～3次，用200 μl移液槍槍頭，在6孔板中均等劃3條直線，無(wú)血清的高糖DMEM培養(yǎng)基漂洗，換用不同濃度的BMSC-CM，同時(shí)設(shè)未經(jīng)BMSC-CM處理的RSC96細(xì)胞作為對(duì)照組。倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄0、48 h細(xì)胞生長(zhǎng)情況，計(jì)算0 ～48 h劃痕愈合率。劃痕愈合率=(寬度0 h-寬度48 h)/寬度0 h×100%。

1.2.9Western blot法檢測(cè)BMSC-CM處理RSC96細(xì)胞后Bcl-2、Bax蛋白水平的變化 用不同濃度BMSC-CM(10%BMSC-CM、20%BMSC-CM)處理RSC96細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞24 h后，RIPA緩沖液中裂解并收集總蛋白，用12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(100 V、350 mA)，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入小鼠抗大鼠Bcl-2 mAb、小鼠抗大鼠Bax mAb(1∶200)、小鼠抗大鼠GAPDH抗體(1∶5 000)，4℃孵育過(guò)夜；用含有5 g/L Tween-20的TBS洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶2 000)，室溫孵育1 h；用含有5 g/L Tween-20的TBS洗膜3次，化學(xué)發(fā)光底物顯色，應(yīng)用ELC化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

2 結(jié)果

2.1BMSC的分離培養(yǎng)以及成骨、成脂分化鑒定 第3代BMSC形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，“旋渦”樣生長(zhǎng)。經(jīng)成骨和成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)2周和3周后，分別應(yīng)用茜素紅和油紅O染色可見(jiàn)橘紅色鈣化物和胞內(nèi)脂滴(圖1)。

2.2BMSC-CM處理后RSC96細(xì)胞增殖活性降低 MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，10%BMSC-CM、20%BMSC-CM處理后的RSC96細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞吸光度值分別為0.540±0.054、0.308±0.06、0.765±0.109，其中10%BMSC-CM、20%BMSC-CM處理組吸光度值顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，且20%BMSC-CM處理組吸光度值相較10%BMSC-CM處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。說(shuō)明BMSC-CM處理RSC96細(xì)胞后其增殖活性顯著降低且隨著B(niǎo)MSC-CM濃度的增加增殖活性降低越顯著。

圖1 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及成骨、成脂圖Fig.1 Mesenchymal stem cells morphology and osteoge-nic,adipogenic Note: A.×100;B.×100;C.×400.

2.3BMSC-CM處理后RSC96細(xì)胞克隆形成能力降低 10%BMSC-CM、20%BMSC-CM處理后的RSC96細(xì)胞克隆數(shù)分別為(212.667±20.428)個(gè)、(173.334±6.65)個(gè)、(276.212±12.767)個(gè)，其中10%BMSC-CM、20%BMSC-CM處理組單個(gè)細(xì)胞的增殖集落明顯比對(duì)照組小，數(shù)目少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，且20%BMSC-CM處理組克隆數(shù)相較10%BMSC-CM處理組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3A、B)。說(shuō)明BMSC-CM處理RSC96細(xì)胞后克隆形成能力明顯降低且隨著B(niǎo)MSC-CM濃度的增加克隆數(shù)量減少越明顯。

2.4BMSC-CM處理后RSC96細(xì)胞遷移能力明顯降低 10%BMSC-CM、20%BMSC-CM處理后的RSC96細(xì)胞劃痕愈合率分別為(21.367±5.590)%、(14.033±1.358)%；與對(duì)照組(38.433±5.613)%相比，10%BMSC-CM、20%BMSC-CM處理組邊緣間的愈合面積小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4A、B)。表明BMSC-CM處理RSC96細(xì)胞后其遷移能力減弱。

TranswellTM結(jié)果表明，10%BMSC-CM、20%BMSC-CM處理后的RSC96細(xì)胞穿過(guò)小孔的細(xì)胞數(shù)分別為(220.667±23.029)、(137.667±25.146)；與對(duì)照組(340.333±43.108)相比，10%BMSC-CM、20%BMSC-CM處理組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，圖5A、B)，且20%BMSC-CM處理組穿過(guò)小孔細(xì)胞數(shù)相較10%BMSC-CM處理組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5A、B)。表明BMSC-CM處理RSC96細(xì)胞后其遷移能力減弱且隨著B(niǎo)MSC-CM濃度增加其遷移能力減弱的程度越明顯。

圖2 BMSC-CM抑制RSC96細(xì)胞增殖Fig.2 BMSC-CM inhibits proliferation on RSC96 cellsNote: 10%BMSC-CM，20%BMSC-CM vs Control,*.P<0.05,**.P<0.01;20%BMSC-CM vs 10%BMSC-CM,# .P<0.05.

圖3BMSC-CM抑制RSC96細(xì)胞克隆形成

Fig.3BMSC-CMinhibitscloneformationonRSC96cell

Note: A.Clone formation test results (crystal violet staining);B.Semi-quantitative analysis of clonogenic ability.10%BMSC-CM,20%BMSC-CM vs Control,*.P<0.05,**.P<0.01;20%BMSC-CM vs 10%BMSC-CM,#.P<0.05.

圖4BMSC-CM抑制RSC96細(xì)胞的遷移

Fig.4BMSC-CMinhibitsmigrationonRSC96cells

Note: A.Scratch test was used to detect cell migration (phase contrast microscope,×40)；B.Semi-quantitative analysis of relative healing rate.10%BMSC-CM,20%BMSC-CM vs Control,*.P<0.05.

圖6 BMSC-CM對(duì)RSC96細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)影響Fig.6 Effect of BMSC-CM on Bax and Bcl-2 protein expression on RSC96 cells

圖5BMSC-CM抑制RSC96細(xì)胞TranswellTM遷移

Fig.5BMSC-CMinhibitsTranswellTMmigrationonRSC96cells

Note: A.TranswellTMmigration assay was used to detect cell migration (crystal violet staining,×100);B.Semi-quantitative analysis of migrating cells.10%BMSC-CM,20%BMSC-CM vs Control,*.P<0.05,**.P<0.01;20%BMSC-CM vs 10%BMSC-CM,#.P<0.05.

2.5BMSC-CM作用后RSC96細(xì)胞凋亡增加 與對(duì)照組相比，BMSC-CM作用于RSC96后，凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，且隨著濃度的增大Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)更加明顯，表明BMSC-CM作用后RSC96細(xì)胞增殖和遷移能力減弱，這可能與BMSC-CM促進(jìn)RSC96細(xì)胞凋亡增加有關(guān)(圖6)。

3 討論

BMSC是一種具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。研究表明，BMSC是一種免疫逃逸細(xì)胞，自身不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體及其共刺激分子，具有對(duì)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的逃逸功能[6-9]。被認(rèn)為是應(yīng)用于臨床中的最優(yōu)干細(xì)胞。然而，目前BMSC仍沒(méi)有特異性表面標(biāo)志，只能通過(guò)功能形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)全骨髓貼壁法，傳代培養(yǎng)獲得純化的細(xì)胞，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，“旋渦”樣生長(zhǎng)；經(jīng)成骨成脂誘導(dǎo)后，可分化為紅色鈣化物和胞內(nèi)脂滴。其符合國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)對(duì)干細(xì)胞的基本認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。提示，本實(shí)驗(yàn)成功分離了BMSC。

外周神經(jīng)損傷后，施萬(wàn)細(xì)胞胞體肥大增生形成Bungner帶，并且分泌大量神經(jīng)生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促使受損的神經(jīng)元的存活及其軸突的再生[10]。研究發(fā)現(xiàn)，BMSC可通過(guò)多種途徑影響機(jī)體反應(yīng)，針對(duì)BMSC移植治療可顯著促使大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)，其修復(fù)機(jī)制為：①BMSC移植到受損的外周神經(jīng)組織后分化為神經(jīng)元[11]；②BMSC移植到受損的外周神經(jīng)組織后通過(guò)分泌多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子促使受損神經(jīng)組織修復(fù)[12]。隨著研究的不斷深入，諸多學(xué)者更加傾向于后者，認(rèn)為BMSC對(duì)組織損傷的修復(fù)可能是通過(guò)旁分泌途徑[13]。然而，是否也間接影響施萬(wàn)細(xì)胞的生物學(xué)功能，仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取BMSC的培養(yǎng)上清，經(jīng)不同濃度刺激施萬(wàn)細(xì)胞系RSC96細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，隨著B(niǎo)MSC-CM濃度的增加，RSC96細(xì)胞的增殖和遷移能力顯著降低，提示BMSC通過(guò)旁分泌途徑抑制RSC96細(xì)胞的增殖和遷移。國(guó)外學(xué)者Ribeio等[12]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC-CM促使了原代施旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)的增殖和遷移，當(dāng)用FGF-2特異性抑制劑處理BMSC-CM后，SCs增殖和遷移能力降低。提示，BMSC通過(guò)旁分泌FGF-2促使SCs細(xì)胞的增殖和遷移。然而，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Ribeio等[12]的研究結(jié)果不一致。這種研究結(jié)果的不一致可能與細(xì)胞類(lèi)型有關(guān)。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們只對(duì)施旺細(xì)胞系RSC96細(xì)胞進(jìn)行研究，存在一定的局限性，接下來(lái)我們將對(duì)原代細(xì)胞增殖和遷移的影響及作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

Bcl-2、Bax同屬于Bcl-2家族成員，Bcl-2通過(guò)關(guān)閉線粒體膜上的轉(zhuǎn)換孔，減少細(xì)胞色素C的釋放進(jìn)入細(xì)胞漿，抑制下游凋亡途徑的激活；Bax可與Bcl-2形成二聚體拮抗Bcl-2對(duì)線粒體膜轉(zhuǎn)換孔的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而激活下游凋亡途徑。Bcl-2、Bax相互協(xié)調(diào)，保持機(jī)體平衡，如果受外部或機(jī)體內(nèi)部因素的影響，Bcl-2占主導(dǎo)地位，會(huì)促使細(xì)胞增殖，反之Bax占主導(dǎo)地位，會(huì)促使細(xì)胞凋亡[14,15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)Bcl-2與Bax的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，隨著B(niǎo)MSC-CM濃度的增加，RSC96細(xì)胞Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)。提示BMSC通過(guò)旁分泌途徑下調(diào)了RSC96細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)了Bax的表達(dá)，促使RSC96細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，BMSC通過(guò)旁分泌途徑促使RSC96細(xì)胞的凋亡，并抑制其增殖和遷移。BMSC-CM促使RSC96細(xì)胞的凋亡可能與Bcl-2、Bax蛋白的異常表達(dá)有關(guān)。然而其具體機(jī)制仍需深入研究。

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[收稿2017-01-05 修回2017-04-07]

(編輯 倪 鵬)

EffectofculturesupernatantofratbonemesenchymalstemcellsonbiologicalcharacteristicsofRSC96cells

MAYong-Bin,GESuo-Hua,WANGXue-Feng,SUJian-Hua.

JintanHospital,JiangsuUniversity,Jintan213200，China

Objective:To study the effect of culture supernatant of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on biological characteristics of RSC96 Schwann cells.Methods: BMSCs of Sprague Dawley rat were cultured and purified in vitro.The BMSCs culture supernatant medium (BMSC-CM) was collected from the third generation of BMSCs.Using MTT method to detect proliferation influence of BMSC-CM on RSC96 cells,and using plate cloning assay to analysis a single cell proliferation effect.The migration analysis of BMSC-CM on RSC96 cells were detected by scratch and TranswellTMchamber assay,Western blot tested Bax and Bcl-2 proteins changes in RSC96 cells.Results: The third generation of BMSCs was long spindle-shaped and vortex-like;the result of Osteogenesis staining was positive;lipid droplets appeared after adipogenesis induction.BMSC-CM inhibited the proliferation and migration of RSC96 cells.Meanwhile,Bcl-2 protein decreased and Bax protein increased in RSC96 cells after BMSC-CM treatment.Conclusion: BMSC-CM can promote apoptosis and inhibit the proliferation and migration of RSC96 cells.

Bone marrow mesenchymal stem cells;RSC96 cells;Proliferation；Migration

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.003

①本文為江蘇省自然科學(xué)基金(BK20141295)、江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展基金項(xiàng)目(JLY20160081)和江蘇省“六個(gè)一”工程項(xiàng)目(LGY2016055)。

馬永賓(1985年-)，男，碩士，初級(jí)檢驗(yàn)師，主要從事神經(jīng)損傷修復(fù)方面的研究，E-mail：mayongbin2009@163.com。

及指導(dǎo)教師：蘇建華(1969年-)，男，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)損傷修復(fù)研究，E-mail：sjh2385225@163.com。

R392-33Q255Q954.67+3

A

1000-484X(2017)09-1291-05

②江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江212001。