李向陽，姚永琴，吳光澤，徐慶鋒，吳 芹，石京山

(1.商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥理學(xué)教研室，河南 商丘 476005；2.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理學(xué)教育部重點實驗室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

基于MT3、SOD2mRNA表達(dá)調(diào)控的醒腦再造膠囊抗腦缺血再灌注損傷作用

李向陽1,2，姚永琴1，吳光澤2，徐慶鋒2，吳 芹2，石京山2

(1.商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥理學(xué)教研室，河南 商丘 476005；2.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理學(xué)教育部重點實驗室，貴州 遵義 563099)

目的觀察醒腦再造膠囊的抗腦缺血再灌注損傷作用并探討其作用機(jī)制。方法灌胃給藥醒腦再造膠囊1周后，建立SD大鼠大腦中動脈缺血2 h再灌注24 h模型，進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評分，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法觀察腦組織梗死范圍，實時熒光定量PCR檢測腦組織缺血半暗帶區(qū)域金屬硫蛋白3(MT3)和超氧化物歧化酶2(SOD2)mRNA的表達(dá)。結(jié)果醒腦再造膠囊預(yù)處理可明顯降低大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能評分，縮小腦組織梗死范圍，并使腦組織缺血半暗帶區(qū)域MT3和SOD2mRNA的表達(dá)顯著增加。結(jié)論醒腦再造膠囊抗大鼠腦缺血再灌注損傷作用與上調(diào)腦組織抗氧化損傷基因MT3和SOD2mRNA的表達(dá)有關(guān)。

腦缺血再灌注損傷；金屬硫蛋白3；超氧化物歧化酶2；氧化損傷；SD大鼠

缺血性腦卒中具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率的特點[1-2]，腦組織缺血后的血流恢復(fù)有可能導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步損傷，這種情況稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)，減輕CIRI已成為目前治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

醒腦再造膠囊由石菖蒲、膽南星、僵蠶、冰片、石決明、珍珠、地龍、天麻、豬牙皂、細(xì)辛和紅花組成，具有益氣活血、化痰醒腦、祛風(fēng)活絡(luò)之功效，用于神志不清、語言蹇澀、口角流涎、腎虛痿痹、筋骨酸痛、手足拘攣、半身不遂及腦血栓形成的恢復(fù)期和后遺癥的治療[3]，但其療效的具體作用機(jī)制不清。本實驗觀察了醒腦再造膠囊對CIRI大鼠模型的效應(yīng)并在基因水平進(jìn)行了作用機(jī)制探討。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥 Master-cycler Gradient PCR儀(德國Eppendorf 公司)；iCycler iQReal-Time PCR 儀(美國Bio-Rad)；MACO栓線(北京西濃科技有限公司)；醒腦再造膠囊(XNZZ，中美華醫(yī)河北制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z13020394，批號：150702)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC，北京索萊寶科技有限公司)；RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系列試劑盒及β肌動蛋白(β-actin)、金屬硫蛋白3(MT3)和超氧化物歧化酶2(SOD2)基因引物[大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司，見表1]；SYBR? GREEN PCR Master Mix(ABI公司)。

1.2 實驗動物 健康♂SD大鼠[第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0005，清潔級]，10周齡，體重250～270 g。

表1實時熒光定量PCR檢測基因擴(kuò)增引物的序列

基因基因編號 上游引物(5'—3') 下游引物(3'—5')β-actinNM_031144TCTTCCAGCCTTCCTTCCTGCACACAGAGTACTTGCGCTCMT3NM_053968CCCTGTCCTACTGGTGGTTCTTGGCACACTTCTCACATCCSOD2NM_017051TCTGTGGGAGTCCAAGGTTCCAGTGGAATAAGGCCTGTGG

1.3 實驗分組、制模 將60只健康♂SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組(sham)、模型組(model)、XNZZ低劑量組(LXNZZ)、中劑量組(MXNZZ)、高劑量組(HXNZZ)。經(jīng)一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將動物稱重，計算給藥量，每天上午ig給藥一次，XNZZ低、中、高劑量組分別按0.5、1、2 g/kg給藥，假手術(shù)組和模型組均給予相應(yīng)體積的生理鹽水，給藥時間持續(xù)1周。給藥結(jié)束的當(dāng)天下午各組大鼠禁食、自由飲水。第2天用7%水合氯醛(0.5 ml/100g)對各給藥組大鼠ip麻醉后頸部備皮，仰臥位固定，消毒皮膚，做頸部正中切口，分離、暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，用動脈夾夾住頸總動脈并結(jié)扎頸外動脈，于頸總動脈分叉處切口向頸內(nèi)動脈插入MACO栓線約(18.5±0.5)mm，至大腦中動脈起始部位出現(xiàn)明顯阻力感以完全阻斷血流，然后松開動脈夾，并結(jié)扎頸內(nèi)動脈，術(shù)后縫合傷口，2 h后拔出尼龍線，即造成大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組不插入尼龍線和結(jié)扎血管，其他操作步驟同上。

1.4 神經(jīng)功能評分 缺血2 h再灌注24 h后參照Bederson法[4]對實驗動物進(jìn)行神經(jīng)功能評分：0分為無任何癥狀或僅有同側(cè)眼裂縮?。?分為提尾時對側(cè)肢體屈曲內(nèi)收；2分為抗側(cè)方推力減弱；3分為爬行時向?qū)?cè)劃圈；4分為意識喪失且不能行走。

1.5 腦組織TTC染色及實時熒光定量PCR檢測 制模結(jié)束后于每組中隨機(jī)取6只大鼠進(jìn)行TTC染色。將大鼠麻醉后斷頭取腦，去除嗅球，小腦和低位腦干后，將腦于-20℃冰箱10min凍至半硬狀后，沿冠狀面平均切成5片，避光放置于1% 的TTC 溶液中(37℃約15min)染色，然后放入10%多聚甲醛溶液中過夜固定，第二天用濾紙吸干腦片表面溶液后拍照，經(jīng)染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗死組織呈白色且界限分明；腦組織梗死體積比=蒼白區(qū)重量/(蒼白區(qū)重量+非蒼白區(qū)重量)。制模結(jié)束后于每組中隨機(jī)取6只大鼠采用實時熒光定量PCR檢測腦組織缺血半暗帶區(qū)域MT3和SOD2mRNA的表達(dá)，將大鼠麻醉后斷頭取腦，按Trizol法提取腦組織總RNA，紫外分光光度計檢測A260/A280在1.8～2.0。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并稀釋，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。以β-actin為參照，用相對量法計算MT3和SOD2mRNA的表達(dá)水平。以Ct值為統(tǒng)計參數(shù)，用目的基因表達(dá)/β-actin基因表達(dá)，對MT3和SOD2mRNA進(jìn)行相對定量。

2 結(jié)果

2.1 醒腦再造膠囊(XNZZ)對大鼠神經(jīng)功能評分的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組比較，XNZZ低、中、高劑量組可明顯降低CIRI動物模型的神經(jīng)功能評分(見表2)。

2.2 醒腦再造膠囊(XNZZ)對大鼠腦組織梗死范圍的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組發(fā)生明顯腦梗死，假手術(shù)組未出現(xiàn)腦組織梗死灶，與模型組比較XNZZ低、中、高劑量組腦組織梗死范圍均有明顯縮小(見圖1和表2)。

2.3 醒腦再造膠囊(XNZZ)對大鼠腦組織缺血半暗帶區(qū)域MT3和SOD2mRNA表達(dá)的影響 與模型組比較，XNZZ低、中、高劑量組可明顯增加CIRI動物模型腦組織缺血半暗帶區(qū)域MT3和SOD2mRNA的表達(dá)(見表2)。

圖1 醒腦再造膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織梗死范圍的影響

表2醒腦再造膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)功能評分、腦梗死體積比和MT3、SOD2 mRNA表達(dá)的影響(n=6)

組別神經(jīng)功能評分腦梗死體積比MT3mRNASOD2mRNA假手術(shù)002.55±0.65627.20±258.37模型3.28±0.69#0.26±0.07#16.29±4.15971.56±350.26醒腦再造膠囊低劑量2.29±0.70*0.21±0.0225.61±6.60*1523.85±456.34*醒腦再造膠囊中劑量2.14±0.64*0.19±0.02*23.68±5.46*1807.36±643.05*醒腦再造膠囊高劑量1.86±0.63*0.14±0.06*20.36±5.31*2076.43±685.08*

與假手術(shù)組比較：#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是指腦組織缺血一定時間自然恢復(fù)血液供應(yīng)或通過溶栓治療后恢復(fù)血流供應(yīng)，其功能不但未能恢復(fù)，還出現(xiàn)腦水腫、部分受損的腦組織神經(jīng)元繼續(xù)死亡或凋亡等更加嚴(yán)重的腦組織損傷，從而進(jìn)一步加重腦功能的障礙。研究發(fā)現(xiàn)，腦組織血流中斷和再灌注使腦組織細(xì)胞受到損傷是一個快速級聯(lián)反應(yīng)，包括細(xì)胞中毒、興奮性氨基酸釋放增加、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、自由基產(chǎn)生、凋亡基因激活等一系列病理生理學(xué)過程。這些環(huán)節(jié)互為因果，彼此重疊，相互聯(lián)系，形成惡性網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致腦組織神經(jīng)元凋亡或壞死[5]。在治療學(xué)上，目前尚無理想的治療藥物，因此繼續(xù)探索有效的神經(jīng)保護(hù)劑具有重要意義。

MT-3由α和β兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，MT-3分布主要限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在海馬齒狀回顆粒細(xì)胞、苔狀纖維和海馬錐狀神經(jīng)元尤為豐富，Ren等發(fā)現(xiàn)在MT-3存在情況下，能有效降低體外自由基對皮層和PC12 細(xì)胞的毒性，并且其α結(jié)構(gòu)域的潛在抗活性氧能力可能比β結(jié)構(gòu)域強(qiáng)[6]。MT3作為腦組織中的一種特異性生長抑制因子，具有清除自由基、調(diào)節(jié)腦細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)、參與重金屬解毒、抗炎癥反應(yīng)和抗細(xì)胞凋亡等多種重要生物學(xué)功能[7-8]，對腦缺血性應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的腦組織損傷具有明顯保護(hù)作用，在腦組織缺血性損傷早期和后期增加MT3的表達(dá)均能有效減輕腦組織缺血級聯(lián)反應(yīng)所帶來的神經(jīng)損傷[9]；在腦缺血時，細(xì)胞色素氧化酶受到抑制，使NADH不能及時氧化而大量存積在細(xì)胞內(nèi)，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)能將溶解在生物膜脂質(zhì)中的氧分子還原，生成超氧陰離子。當(dāng)恢復(fù)血供時，可致氧自由基大量產(chǎn)生。SOD是生物體產(chǎn)生的天然氧化酶，它通過歧化反應(yīng)清除體內(nèi)生成的氧自由基，阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)。在腦缺血再灌注后，SOD明顯減少，則使氧自由基對腦組織細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、死亡[10]。SOD2的重要生理功能表現(xiàn)在它是一種目前所知最有效的氧自由基清除劑之一，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可通過清除氧自由基顯著降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，維持線粒體功能穩(wěn)定，阻遏蛋白質(zhì)酪氨酸殘基亞硝基化，抑制細(xì)胞凋亡，減輕缺血性腦組織損傷[11-12]。醒腦再造膠囊具有化痰醒腦、祛風(fēng)活絡(luò)、醒腦益智的功能，臨床用于中風(fēng)后遺癥和缺血性腦病，但其作用機(jī)制尚不完全明了，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，醒腦再造膠囊膠囊0.5、1、2 g/kg預(yù)給藥1周能夠使大腦中動脈缺血2 h再灌注24 h大鼠模型腦組織缺血半暗帶區(qū)域MT3和SOD2mRNA的表達(dá)顯著增加。

綜上所述，醒腦再造膠囊預(yù)處理可以明顯降低大鼠CIRI動物模型神經(jīng)功能評分、縮小腦組織梗死范圍，對大鼠CIRI具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)腦組織抗氧化損傷基因MT3和SOD2mRNA的表達(dá)有關(guān)。

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(編輯：譚秀榮)

The protective effects of Xingnaozaizao capsule on cerebral ischemia reperfusion injury based on MT3,SOD2mRNA expressions

Li Xiangyang1,2,Yao Yongqin1,Wu Guangze2,Xv Qingfeng2,Wu Qin2,Shi Jingshan2

(1.Department of Pharmacology,Shangqiu Medical School,Shangqiu Henan 476005,China;2.The Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo observe the protective effects of Xingnaozaizao capsule (XNZZ) on cerebral ischemia reperfusion injury and explore the mechanism.MethodsAfter intragastric administration of XNZZ for 7 days,the SD rat model of cerebral injury was established by 2 h ischemia and 24 h reperfusion.Effects of XNZZ on neurological scale were observed,the infarction volume of brain was detected by TTC staining,and the mRNA expressions of MT3,SOD2were determined by real-time PCR.ResultsXNZZ can obviously reduce the neurological scale,decrease the infarction volume of brain,and increase the mRNA expressions of MT3,SOD2of rats after cerebral ischemia reperfusion injury.ConclusionThe protective effects of XNZZ on cerebral ischemia reperfusion injury would be associated with inducing the activation of the antioxidant genes MT3and SOD2.

cerebral ischemia reperfusion injury;metallothionein 3;superoxide dismutase 2;oxidative damage;SD rats

河南省教育廳高等學(xué)校重點科研項目(NO：15B310012)。

吳芹，女，本科，高級實驗師，研究方向：基礎(chǔ)藥理學(xué)，E-mail:1258874930@qq.com。

R964

A

1000-2715(2017)04-0394-04

[收稿2017-06-11;修回2017-07-12]