李葉麗，岳 云，吳雨婷，付 舒，楊丹莉

(遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

蛇床子素通過下調(diào)TGF-β1信號通路抗野百合堿所致大鼠右心室重構(gòu)

李葉麗，岳 云，吳雨婷，付 舒，楊丹莉

(遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

目的研究蛇床子素(Ost)對野百合堿(MCT)所致大鼠右心室重構(gòu)的作用，并探討其可能的機(jī)制。方法200～220 g SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(Control組，n=8)，模型組(Model組，n=8)，Ost低、高劑量組(Ost10、Ost20組，10、20 mg/kg，n=8)。除正常對照組外的其余大鼠均經(jīng)頸背部一次性皮下注射MCT 50 mg/kg復(fù)制右心室重構(gòu)模型，造模后第1天開始給藥(ig，qd)。給藥28 d后稱大鼠體重(BW)，右室自由壁重量(RV)，計算右室相對質(zhì)量(RV/BW)；通過HE染色觀察右心室顯微結(jié)構(gòu)；透射電鏡觀察右心室超微結(jié)構(gòu)；Western blot 檢測右心室轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)蛋白的表達(dá)；real time RT-PCR檢測右心室結(jié)締組織生長因子(CTGF)和纖維連接蛋白(Fn)mRNA的表達(dá)。結(jié)果與Control組相比，Model組大鼠右室相對質(zhì)量明顯升高(P<0.05)；右心室心肌細(xì)胞肥大畸形且排列紊亂，胞漿腫脹明顯；心肌細(xì)胞線粒體腫脹，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張；TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；CTGF和Fn mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05)。與Model組相比，Ost10、Ost20組大鼠右室相對質(zhì)量明顯降低(P<0.05)；右心室心肌細(xì)胞排列較為整齊；心肌細(xì)胞線粒體腫脹及肌漿網(wǎng)擴(kuò)張情況均有所減輕；TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；CTGF和Fn mRNA的表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論Ost具有抗MCT所致大鼠右心室重構(gòu)的作用，其機(jī)制至少部分與其下調(diào)TGF-β1信號通路有關(guān)。

蛇床子素；野百合堿；右心室重構(gòu)；轉(zhuǎn)化生長因子β1；結(jié)締組織生長因子；纖維連接蛋白

心室重構(gòu)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞核肥大畸形、纖維組織增生、炎性細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β的過度表達(dá)等[1-2]。故抑制或逆轉(zhuǎn)右心肥厚、下調(diào)TGF-β的表達(dá)等均可在一定程度上減輕右心室重構(gòu)的發(fā)生。野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的肺動脈高壓繼發(fā)的右心室重構(gòu)模型是公認(rèn)的制備右心室重構(gòu)的模型之一[3]。右心室重構(gòu)及衰竭也是導(dǎo)致肺動脈高壓患者預(yù)后差及死亡的主要原因[4-5]。故抑制右心室重構(gòu)，尋找有效的防治藥物具有重要意義。

蛇床子素(Osthole，Ost)又名甲氧基歐芩酚，是從傘形科蛇床屬植物蛇床Cnidiummonnier(L.)Cusson的果實中提取的一種香豆素類化合物，具有抗炎、抗氧化、擴(kuò)張血管、抗腫瘤、調(diào)血脂等藥理作用[6-9]。已有研究表明，Ost對腎性高血壓誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚具有治療作用[10]。也有研究表明，Ost可通過下調(diào)TGF-β1的表達(dá)抗野百合堿所致大鼠肺動脈高壓[11]。因此，本課題組推測Ost可能通過抑制右心肥厚、下調(diào)TGF-β1的表達(dá)發(fā)揮抗右心室重構(gòu)的作用。故本研究采用MCT誘導(dǎo)右心室重構(gòu)模型，觀察Ost對該模型的影響，并分析其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心，雄性，SPF級， 200～220 g，許可證號：SCXK(渝)2012-0005。

1.2 主要試劑 Ost(純度≥98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；MCT(美國Sigma公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL+發(fā)光劑(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)；HRP標(biāo)記的GAPDH抗體(上?？党缮锛夹g(shù)有限公司)；TGF-β1抗體(美國Abcam公司)；HRP標(biāo)記的二抗(英國CST公司)；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光混合物，GAPDH、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)引物(TaKaRa 生物工程公司)。

1.3 主要儀器 Olympus BX43光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus)；Mini-PROTEAN3電泳儀、Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、CCD成像系統(tǒng)、real time RT-PCR 擴(kuò)增儀、通用酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)；RNA 逆轉(zhuǎn)錄儀(德國Eppendorf 公司)；透射電子顯微鏡(TECNAI10; Philips,Eindhoven,The Netherlands)。

1.4 分組、造模及給藥 隨機(jī)抽取8只大鼠經(jīng)頸背部一次性皮下注射生理鹽水5mL/kg作為Control組(n=8)，其余大鼠經(jīng)頸背部一次性皮下注射MCT 50 mg/kg復(fù)制右心室重構(gòu)模型，造模后將大鼠隨機(jī)分為Model組(n=8)，Ost10組(10 mg/kg，n=8)和Ost20組(20 mg/kg，n=8)。其中，Ost10、Ost20組于造模后第1天開始給藥(ig，qd)，Control組和Model組給予等量溶媒(ig，qd)。溶媒為含有0.5%吐溫80的雙蒸水。

1.5 右室相對質(zhì)量的測定 給藥28 d后稱重(body weight，BW)，7%水合氯醛5mL/kg麻醉成功后分離心臟，于生理鹽水中清洗干凈，游離右心室壁并稱取右室質(zhì)量(right ventricle，RV)，計算右室相對質(zhì)量(RV/ BW)。

1.6 蘇木精-伊紅(HE)染色 取2～3 mm右心室組織塊于4%甲醛溶液中固定48h，脫水、包埋、切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察并拍照記錄。

1.7 右心室超微結(jié)構(gòu)的觀察 取右心室心尖處約1 mm3標(biāo)本置于2.5%戊二醛中固定24 h后洗滌，再放入1%餓酸-磷酸緩沖液固定1.5～2.0 h(4 ℃)，脫水、包埋、染色后于透射電鏡下觀察并拍照記錄。

1.8 Western blot 檢測右心室TGF-β1蛋白的表達(dá) 取各組大鼠右心組織提取總蛋白，BCA法定量后經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，用電轉(zhuǎn)移半干轉(zhuǎn)30 min，將TGF-β1、GAPDH蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉2 h，一抗孵育16 h(4 ℃，TGF-β1按1∶400稀釋，GAPDH按1：5 000稀釋)，二抗室溫孵育1 h，暗室曝光，采用Quantity One定量分析軟件進(jìn)行灰度分析。

1.9 real time RT-PCR 檢測右心室CTGF和Fn mRNA 的表達(dá) 取各組大鼠右心組織， Trizol法提取總RNA，參照GenBank 中大鼠GAPDH、CTGF和Fn mRNA 的序列設(shè)計引物。各引物序列如下：GAPDH：上游5′-GGGGCTCTCTGCTCCTCCCT-3′，下游5′- AGTTCGCTGCACCCTCAAA-3′；CTGF：上游5′- CATGGTCAGGCCCTGTGAA -3′，下游5′- CACAGAACTTAGCCCGGTAGGTC-3′；Fn：上游5′-CATCAGCCCGGATGTCAGAA -3′，下游5′- GGCATTGTCGTTGAGCGTGTA-3′。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，real time RT-PCR 擴(kuò)增儀按如下條件進(jìn)行檢測：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參基因，熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)(Ct值)為統(tǒng)計參數(shù)，基因的表達(dá)用2-△△Ct表示，相對定量法分析結(jié)果。

0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ost對大鼠右室相對質(zhì)量的影響 如圖1所示，與Control組比較，Model組右室相對質(zhì)量明顯升高(P<0.05)。而與Model組相比，Ost10、Ost20組大鼠右室相對質(zhì)量均降低(P<0.05)。

#P<0.05 vs control；*P<0.05 vs model。圖1 Ost對大鼠右室相對質(zhì)量的影響(n=8)

2.2 Ost對大鼠右心室顯微結(jié)構(gòu)的影響 與Control組比較，Model組大鼠右心室心肌細(xì)胞肥大，結(jié)構(gòu)紊亂，部分胞核寬大畸形，胞漿腫脹明顯。與Model組比較，Ost10、Ost20組大鼠心肌細(xì)胞肥大、核畸形及胞漿腫脹情況均明顯改善，結(jié)果(見圖2)。

A：Control；B：Model；C：Ost10；D：Ost20。黑色箭頭所指的是胞漿腫脹的心肌細(xì)胞，紅色箭頭指的是寬大畸形的胞核。圖2 Ost對大鼠右心室心肌細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的影響(心肌細(xì)胞橫切面，HE×400)

2.3 Ost對大鼠右心室超微結(jié)構(gòu)的影響 與Control組相比，Model組大鼠右心室心肌細(xì)胞線粒體腫脹，部分呈髓鞘樣退變。與Model組相比，Ost10、Ost20組心肌細(xì)胞線粒體腫脹情況均明顯減輕。結(jié)果(見圖3)。

2.4 Ost對大鼠右心室TGF-β1蛋白表達(dá)的影響 與Control組比較，Model組右心室TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。而Ost10和Ost20組右心室TGF-β1蛋白的表達(dá)均較Model組明顯下調(diào)(P<0.05)，結(jié)果(見圖4)。

#P<0.05 vs control；*P<0.05 vs model。圖4 Ost對右心室TGF-β1蛋白表達(dá)的影響(n=4)

2.5 Ost對大鼠右心室CTGF和Fn mRNA表達(dá)的影響 與Control組相比，Model組大鼠右心室CTGF和Fn mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。與Model組相比，Ost10、Ost20組大鼠右心室CTGF和Fn mRNA的表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05),結(jié)果(見圖5)。

#P<0.05 vs control；*P<0.05 vs model。圖5 Ost對右心室CTGF和Fn mRNA表達(dá)的影響(n=8)

3 討論

野百合堿(MCT)是從野百合種子中提取的一種吡咯烷生物堿，經(jīng)肝代謝后生成野百合堿吡咯，可誘發(fā)右心室重構(gòu)。該模型是目前公認(rèn)的制備右心室重構(gòu)的模型之一[3]。本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組大鼠右室相對質(zhì)量明顯升高；心肌細(xì)胞肥大且結(jié)構(gòu)紊亂，部分胞核寬大畸形，胞漿腫脹明顯；心肌細(xì)胞線粒體腫脹，部分呈髓鞘樣退變，提示Model組大鼠出現(xiàn)了明顯的右心室重構(gòu)。與Model組相比，Ost10、Ost20組大鼠右室相對質(zhì)量均降低；心肌細(xì)胞肥大、線粒體腫脹情況均明顯減輕，提示Ost具有抗MCT誘導(dǎo)的右心室重構(gòu)的作用。

在哺乳動物中TGF-β有四種亞型，分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2。其中TGF-β1以其活性最強(qiáng)且在體細(xì)胞系中所占比例最高的特性成為目前研究的熱點(diǎn)。研究表明，TGF-β1是促心肌纖維化的重要細(xì)胞因子之一，參與調(diào)節(jié)胚層發(fā)育、器官形成、細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等，可刺激成纖維細(xì)胞的增生、促進(jìn)膠原合成、使心肌纖維化，心室順應(yīng)性降低，影響心肌舒縮功能等，在心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[12-14]。CTGF是即刻早期基因CCN 家族成員，生理狀態(tài)下在人類的多種組織器官中廣泛表達(dá)，病理狀態(tài)下CTGF 的過度表達(dá)與疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)[15]。Fn是一種非膠原性的a2糖蛋白，在人體的發(fā)育、細(xì)胞分化、遷移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程及炎癥損傷修復(fù)、免疫應(yīng)答、腫瘤轉(zhuǎn)移等病理過程中發(fā)揮重要作用[16]。CTGF作為TGF-β1的下游因子，可促使TGF-β1發(fā)揮促增生和細(xì)胞外基質(zhì)合成等作用[17]，也可在TGF-β1的誘導(dǎo)下參與成纖維細(xì)胞合成Fn，使細(xì)胞外基質(zhì)沉積，心室重構(gòu)加重。

已有研究表明，TGF-β1蛋白的表達(dá)在MCT誘導(dǎo)的右心室重構(gòu)模型中明顯升高[18]。而Ost可通過下調(diào)TGF-β1的表達(dá)抑制異丙腎上腺素所致心肌纖維化的發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組大鼠右心室TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯升高，CTGF和Fn mRNA的表達(dá)也明顯上調(diào)，提示在該模型中TGF-β1信號通路被激活。與Model組相比，Ost10、Ost20組大鼠右心室TGF-β1蛋白的表達(dá)及CTGF、Fn mRNA的表達(dá)均明顯下調(diào)，提示Ost可能通過抑制TGF-β1信號通路抗右心室重構(gòu)的發(fā)生。

[1] Choudhary G,Troneales F,Martin D,et al.Bosentan attenuates right ventrieular hypertrophy and fibrosis in normoharie hypoxia model of pulmonary hypertension[J].J Heart Lung Transplant,2011,30(7):827-833.

[2] 魏大闖，肖學(xué)鈞.肺動脈高壓與右心室重構(gòu)的關(guān)系[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,2013,34(5):648-651.

[3] Campian M E,Hardziyenka M,Michel M C,et al.How valid are animal models to evaluate treatments for pulmonary hypertension[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2006,373(6):391-400.

[4] Prins K W,Thenappan T.World Health Organization Group I Pulmonary Hypertension:Epidemiology and Pathophysiology [J].Cardiol Clin,2016,34(3):363-374.

[5] Barnett C F,Alvarez P,Park M H.Pulmonary Arterial Hypertension:Diagnosis and Treatment[J].Cardiol Clin,2016,34(3):375-389.

[6] 孔亮，姚瓔珈，教亞男，等.蛇床子素對機(jī)械性腦損傷小鼠的抗炎抗凋亡作用研究[J].中國藥理學(xué)通報,2015,31(7):999-1004.

[7] Zhang Z R,Leung W N,Cheung H Y,et al.Osthole:A Review on Its Bioactivities,Pharmacological Properties,and Potential as Alternative Medicine[J].Evid Based Complement Alternat Med,2015,2015:919616.

[8] Liu Y W,Chiu Y T,Fu S L,et al.Osthole ameliorates hepatic fibrosis and inhibits hepatic stellate cell activation[J].J Biomed Sci,2015,22(1):63.

[9] 張曉平，陳新梅，崔清華，等.蛇床子素藥理作用及其相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國執(zhí)業(yè)藥師,2013,11(10):28-32.

[10]周峰，鐘文，薛潔，等.蛇床子素對腎性高血壓大鼠心肌肥厚的治療作用[J].蘇州大學(xué)學(xué)報,2012,32(3):349-353.

[11]李葉麗，王穎婉，錢志強(qiáng)，等.蛇床子素通過下調(diào)TGF-β1/Smad2信號通路抗野百合堿所致大鼠肺動脈高壓[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2015,38(6):13-16.

[12]李博，朱平先，劉強(qiáng)，等.NF-κB和TGF-β1與左心室舒張功能衰竭心室重構(gòu)的相關(guān)性研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2013,7(19):8573-8576.

[13]Mascareno E,Galatioto J,Rozenberg I,et al.Cardiac lineage protein-1 (CLP-1) regulates cardiac remodeling via transcriptional modulation of diverse hypertrophic and fibrotic responses and angiotensin Ⅱtransforming growth factor β (TGF-β1) signaling axis[J].J Biol Chem,2012,287(16):13084-13093.

[14]Xiao X,Chang G,Liu J,et al.Simvastatin ameliorates ventricular remodeling via the TGF?β1 signaling pathway in rats following myocardial infarction[J].Mol Med Rep,2016,13(6):5093-5101.

[15]包晶晶，達(dá)林泰，烏蘭其其格.結(jié)締組織生長因子的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,35(2):164-168.

[16]程紅新，楊曉萍，蔣雅紅，等.纖維連接蛋白在腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織中的表達(dá)[J].中國組織工程研究,2012,16(31):5837-5842.

[17]李葉麗，王穎婉，李意奇，等.淫羊藿苷通過降低醛固酮水平減輕自發(fā)性高血壓大鼠腎間質(zhì)纖維化[J].中國藥理學(xué)通報,2014,30(4):519-522.

[18]郭雯，馬涵英，趙鐵夫，等.肺動脈高壓對右心重構(gòu)及右心室AT1R、TGF-β1、ERK1/2蛋白表達(dá)的實驗研究[J].心肺血管病雜志,2014,33(2):296-299.

[19]Chen R,Xue J,Xie M L.Reduction of isoprenaline-induced myocardial TGF-β1 expression and fibrosis in osthole-treated mice[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2011,256(2):168-173.

(編輯：譚秀榮)

Osthole reverses the right ventricle remodeling in monocrotaline-treated rats by decreasing the TGF-β1 pathways

Li Yeli,Yue Yun,Wu Yuting,Fu Shu,Yang Danli

(Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo investigate the effect of osthole (Ost) on the right ventricle(RV)remodeling in monocrotaline (MCT)-treated rats,and to explore the mechanisms.Methods200～220 g Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups,which were control group (n=8),model group (n=8),low-dose (10 mg/kg,n=8) and high-dose (20 mg/kg,n=8) of Ost treatment group.Except the control group,the other rats were given a single injection of MCT (50 mg/kg) subcutaneously to establish the RV remodeling.Then the rats in the Ost10and Ost20treatment group were administrated orally once daily from the first day after the injection to the 28th day.The rats in the control group and the model group were given the same amount of menstruum.After 28 days of administration,the body and the RV were weighed separately.RV relative weight was measured by the relative weight ratio of RV to BW.The morphological change of the RV was observed by light microscope and transmission electron microscope.The protein level of transforming growth factor (TGF-β1) was examined by western blot.The mRNA expression of connective tissue growth factor (CTGF) and fibronectin (Fn) were detected by real time RT-PCR.ResultsCompared with the control group,the RV relative weight were increased obviously (P<0.05),myocardial hypertrophy,structure disorders and mitochondrial swelling were observed in the model group.The protein level of TGF-β1 and the mRNA expression of CTGF and Fn were remarkably up-regulated (P<0.05) in the model group.However,in comparison with the model group,the RV relative weight were decreased (P<0.05),myocardial hypertrophy,structure disorders and mitochondrial swelling were improved significantly in the Ost treatment groups.The protein level of TGF-β1 and the mRNA expression of CTGF and Fn were down-regulated in the Ost treatment groups (P<0.05).ConclusionOst can resist the RV remodeling induced by MCT in rats,which may be related to decrease the TGF-β1 pathways.

osthole; monocrotaline; RV remodeling; TGF-β1; CTGF; Fn

國家自然科學(xué)基金資助項目(NO:81360498)；遵義醫(yī)學(xué)院碩士啟動基金項目(NO：F-773)。

楊丹莉，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，抗炎免疫藥理學(xué)，E-mail:zmuyangdanli@foxmail.com。

R961

A

1000-2715(2017)04-0383-06

[收稿2017-05-16;修回2017-07-10]