張 琳，周雯靜，黃建廷，喻 田

(貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

缺血后處理心肌細(xì)胞線粒體比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究

張 琳，周雯靜，黃建廷，喻 田

(貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

目的以大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)純化的大鼠心肌細(xì)胞線粒體進(jìn)行分析和鑒定，探討缺血后處理大鼠心肌細(xì)胞線粒體蛋白表達(dá)的變化。方法24只大鼠隨機(jī)分為正常組(Normal，Nor)、缺血再灌注損傷組(Control，Con)、缺血后處理組(ischemic postconditioning，IPO)、5-羥葵酸拮抗缺血后處理組(5-hydroxydecanoate，5-HD+IPO)，利用Langendorff灌注裝置構(gòu)建各組大鼠離體心臟模型。以Nycodenz密度梯度離心法分離大鼠心肌線粒體，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)其純度，提取各組線粒體蛋白，進(jìn)行2D-DIGE分離，分析差異表達(dá)蛋白，進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定。結(jié)果與Nor組比較，Con組NADH脫氫酶亞基(NDUFA10)表達(dá)水平降低3.84倍；IPO和Con組比較：NDUFA10和琥珀酸脫氫酶-黃素蛋白(SDHA)的蛋白表達(dá)水平分別減少3.33倍和1.68倍。與IPO組比較，5-HD+IPO組的SDHA表達(dá)水平升高1.65倍。結(jié)論心肌缺血再灌注損傷降低了NDUFA10蛋白的活性，可能在缺血后處理線粒體NADH呼吸鏈穩(wěn)定的維持過(guò)程中發(fā)揮作用，SDHA蛋白和線粒體敏感性K+通道(mitoKATP)可能同時(shí)在缺血后處理內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制中具有作用。

缺血后處理；線粒體；蛋白質(zhì)組學(xué)；2D-DIGE；質(zhì)譜分析；心肌保護(hù)

缺血后處理( ischemic postconditioning,IPO)，是指心肌缺血后，進(jìn)行多次短時(shí)間再灌注/缺血的循環(huán)，再進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的再灌注，從而產(chǎn)生減輕心肌缺血再灌注的損傷作用[1]。已有研究明確，與缺血預(yù)處理相似，在心臟再灌注早期進(jìn)行缺血后處理可減輕心肌缺血再灌注造成的損傷，且在臨床上具有應(yīng)用價(jià)值[2]。心臟需氧量大，且主要依靠底物的有氧氧化提供能量，線粒體進(jìn)行氧化磷酸化產(chǎn)生其所需約95%的ATP。IPO內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制與心肌線粒體存在著密切的關(guān)系，因而線粒體在IPO中的作用，對(duì)理解IPO的保護(hù)機(jī)制具有重要意義[3-6]。利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法來(lái)研究心肌細(xì)胞線粒體在不同條件下的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，觀察心肌細(xì)胞線粒體蛋白在缺血再灌注損傷(ischemical reperfusion injury,IRI)及IPO條件下表達(dá)的改變，從亞細(xì)胞器水平(線粒體)和分子水平(蛋白質(zhì))揭示缺血后處理的心肌保護(hù)機(jī)制，為臨床工作提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16～20周齡SPF級(jí)健康雄性SD(Spragye-Dawley)大鼠，體重250～300 g，購(gòu)自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(證書(shū)號(hào):SCXK(渝)2007-0005)。

1.1.2 主要試劑及藥品 甘露醇，蔗糖，Tris，Nycodenz(Sigma公司，美國(guó))，丙烯酰胺，N,N’-亞甲基丙烯酰胺，固相pH值干膠條，蛋白質(zhì)純化定量試劑盒(AmershamBiosciences公司，瑞典)，Trypsin胰酶(Promega公司，美國(guó)) 。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Powerlab /8SP數(shù)據(jù)系統(tǒng)(ADInstrument公司，澳大利亞)，Langendorff離體心臟灌注裝置(PanLab公司，西班牙)，5804R型Eppendorf臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))IPGphor等電聚焦儀，Ettan DALT six電泳系統(tǒng)，掃描儀Typhoon9400，(AmershamBiosciences公司，瑞典)。

1.2 方法

1.2.1 建立Langendorff各組大鼠離體心臟灌注模型 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：正常組(Nor)6只、對(duì)照組(Con)6只、缺血后處理組(IPO)6只、5-羥葵酸拮抗缺血后處理組(5-HD+IPO) 6只。離體心臟37℃時(shí)先使用平衡液進(jìn)行20 min灌注，在平衡灌注末期觀察到室性早搏小于2個(gè)/min、發(fā)展壓大于80 mmHg 、HR大于250次/min。各實(shí)驗(yàn)組心臟灌注按表1灌注方案進(jìn)行。灌注期間左室舒張末壓調(diào)整在4～8 mmHg，灌注壓調(diào)整在70～80 mmHg。

表1各組灌注方案

組別灌注方案Nor平衡20min續(xù)灌100minCon平衡20min缺血40min續(xù)灌60minIPO平衡20min缺血40min復(fù)灌10S,停灌10S,循環(huán)6次續(xù)灌58min5-HD+IPO平衡20min缺血40min5-HD處理5min,復(fù)灌10S,停灌10S循環(huán)6次續(xù)灌53min

1.2.2 線粒體分離和純化 取適量SD大鼠心肌組織放入加有MSTE的EP管中，將心臟組織剪碎，充分勻漿破碎組織；1 500 g 離心 10 min，將上清移至新的EP管中，10 000 g 離心 10 min，沉淀即為粗提線粒體；向粗提線粒體樣品中加入 25% 的Nycodenz 密度梯度介質(zhì)，充分吹打使線粒體懸浮后，在高速離心管中由下向上按體積與順序(0.5 mL 34%，0.8 mL 30%，1.2 mL 25%，0.8 mL 23%，0.3 mL 20%)行不連續(xù)密度梯度介質(zhì)鋪層， 100 000 g離心60 min。抽取線粒體層至新的Ep管中，加入MSTE重懸，10 000 g 離心10 min，棄上清，沉淀即為純化后的線粒體。上述離心均在4 ℃下進(jìn)行。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)純化心肌線粒體的純度 分別向獲得的心肌組織勻漿液、粗提線粒體、純化線粒體中依次加入 RIPA buffer裂解30 min，12 000 g 4 ℃離心10 min，提取上清即為所需蛋白樣品，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，再配膠、上樣、電泳、封閉、孵育一抗(Calnexin：1∶250；β-actin 1∶400 0；COXⅣ：1∶500)、洗膜、孵育二抗、洗膜、顯影。

1.2.4 心肌線粒體差異表達(dá)蛋白檢測(cè) 將2.2中的純化線粒體進(jìn)行超聲破碎后提取蛋白，接著進(jìn)行CyDye熒光標(biāo)記，然后進(jìn)行第一向等電聚焦(IEF)電泳及第二向SDS-PAGE凝膠電泳，再對(duì)凝膠進(jìn)行深紫熒光染色，對(duì)凝膠進(jìn)行掃描后使用Image Quant軟件進(jìn)行熒光圖像采集，圖像選擇信號(hào)介于60 000～90 000，進(jìn)行定量分析；使用DeCyder軟件對(duì)得到的凝膠圖像進(jìn)行差異表達(dá)分析。選取差異表達(dá)1.5倍以上的蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析：清洗、脫色、乙腈脫水、酶切后應(yīng)用Mltraflex質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。每個(gè)樣品經(jīng)過(guò)2D-DIGE凝膠后，使用3種不同波長(zhǎng)(488、532、633 nm)的激光對(duì)凝膠進(jìn)行掃描獲取圖像，得到分別由Cy2(488 nm)、Cy3(532 nm)、Cy5(633 nm) 標(biāo)記的三張圖像及合并的膠內(nèi)差異圖像。比較Nor和Con組、IPO和Con組、5-HD+IPO和IPO組之間蛋白斑點(diǎn)差異變化，并對(duì)各組間進(jìn)行BVA分析。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)線粒體純度和完整性 通過(guò)Western blot檢測(cè)不同細(xì)胞組分標(biāo)志蛋白：線粒體內(nèi)膜標(biāo)志蛋白-細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ (COXⅣ )；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白-鈣聯(lián)接蛋白(Calnexin)；細(xì)胞骨架標(biāo)志蛋白-β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)。Calnexin及β-actin在組織勻漿中條帶顯著(圖1標(biāo)注TH ，Tissue Homogenate，)，而在粗提線粒體中(圖1標(biāo)注CM ，Crude Mitochondria)和純化線粒體中(圖1標(biāo)注PM，Purified Mitochondria)條帶變?nèi)酰f(shuō)明純化后的提取物幾乎不含其他細(xì)胞成分，純度較好。而COXⅣ主要在CM和PM中表達(dá)，說(shuō)明純化后線粒體富集程度及完整性較好。

圖1 Western blot 法驗(yàn)證線粒體完整性

2.2 大鼠心肌線粒體蛋白的2D-DIGE分析 在Nor組和Con兩組之間，有2個(gè)差異表達(dá)大于1.5倍以上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(spot554和spot555)，心肌缺血與正常情況相比，兩個(gè)蛋白斑點(diǎn)上調(diào)；IPO和Con兩組間，檢測(cè)到4個(gè)差異大于1.5倍以上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(spot554、spot254、spot645和spot648)，缺血后處理組與心肌缺血比較組，有三個(gè)蛋白斑點(diǎn)上調(diào)，一個(gè)蛋白斑點(diǎn)下調(diào)；在5-HD+IPO組和IPO兩組之間，有1個(gè)差異表達(dá)大于1.5倍以上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(spot254)，即用5-羥葵酸阻斷缺血后處理時(shí)與缺血后相比，該蛋白表達(dá)上調(diào)。

箭頭所指即為差異蛋白點(diǎn)，數(shù)字為斑點(diǎn)編號(hào)，本文關(guān)注spot554、spot555、spot254。圖2 差異蛋白斑點(diǎn)圖

2.3 質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)獲得了28個(gè)較好的譜圖，質(zhì)譜圖經(jīng)本地Profound檢索和在線Mascot檢索得到了一致的結(jié)果，成功鑒定出28個(gè)蛋白，本研究重點(diǎn)考察Nor和Con組、IPO和Con組、5-HD+IPO和IPO組間表達(dá)差異1.5倍以上的3個(gè)蛋白(見(jiàn)表2)。

表2差異表達(dá)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果

分組比較斑點(diǎn)編號(hào)NCBI編號(hào)鑒定結(jié)果變化比例NorVSCon554gi|32996721NDUFA10-3.84555gi|149037563rCG55630-3.76IPOVSCon554gi|32996721NDUFA10-3.33254gi|18426858SDHA-1.685-HD+IPOVSIPO254gi|18426858SDHA1.65

3 討論

本研究應(yīng)用2D-DIGE技術(shù)對(duì)純化的心肌細(xì)胞線粒蛋白，從蛋白組學(xué)水平，觀察不同狀態(tài)下的心肌細(xì)胞線粒體蛋白表達(dá)變化，包括心肌缺血再灌注損傷、缺血后處理及5-羥葵酸干預(yù)等心肌狀態(tài)，探索心肌缺血過(guò)程中影響線粒體能量代謝的重要蛋白，以及調(diào)控心肌缺血后處理及5-羥葵酸干預(yù)的作用機(jī)制。

與正常組比較，發(fā)現(xiàn)大鼠在心肌缺血再灌注損傷后，心肌線粒體中的NDUFA10蛋白表達(dá)增加。NDUFA10蛋白分布于線粒體內(nèi)膜上，是NADH脫氫酶的亞基，參與組成了線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ(Complex I)。研究發(fā)現(xiàn)NDUFA10由核基因編碼，在細(xì)胞質(zhì)中蛋白合成后，轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾，蛋白進(jìn)行磷酸化，進(jìn)而與NADH結(jié)合，從而影響復(fù)合體Ⅰ的活性[7-9]。當(dāng)編碼Complex I亞基的mtDNA由于損傷影響其蛋白表達(dá)時(shí)，Complex I的蛋白表達(dá)降低或蛋白活性下降，從而抑制細(xì)胞中線粒體ATP的合成，并增加了細(xì)胞線粒體中ROS的產(chǎn)生，最終引起細(xì)胞損傷[10-11]。Kim等[12]研究缺血預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞線粒體蛋白組學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)了23個(gè)蛋白表達(dá)具有顯著變化，其中NDUFA10蛋白表達(dá)水平在心肌缺血再灌注損傷后不但沒(méi)有降低反而顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注后NDUFA10蛋白的表達(dá)趨勢(shì)也得到一致的結(jié)果：與正常灌注比較，缺血40min再灌注后NDUFA10的蛋白表達(dá)量增加了3.84倍。這一結(jié)果可能的原因是：心肌缺血再灌注損傷后，心肌細(xì)胞發(fā)生了線粒體呼吸鏈異常，使復(fù)合體Ⅰ無(wú)法發(fā)揮功能將NADH的氫正常轉(zhuǎn)移給輔酶Q(CoQ)，線粒體中的產(chǎn)生ATP的氧化磷酸化過(guò)程被抑制，而增強(qiáng)了產(chǎn)生ATP的另外一條途徑——無(wú)氧酵解途徑，在該途徑中同時(shí)產(chǎn)生丙酮酸，造成pH值降低，pH值的改變影響了內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)造成NDUFA10蛋白的活性的變化，需要通過(guò)增加NDUFA10蛋白表達(dá)來(lái)代償正常活動(dòng)所需的蛋白量。

與缺血再灌注損傷組比較，缺血后處理組中NDUFA10和SDHA的蛋白表達(dá)量顯著下降。SDHA(黃素蛋白)、SDHB(Fe-S蛋白)、SDHC和SDHD(兩個(gè)膜結(jié)合亞基)四個(gè)亞基共同組成琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase,SDH)，SDH是呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ(ComplexⅡ)重要組成部分，將線粒體基質(zhì)內(nèi)電子傳遞鏈FADH2的電子，催化轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜的CoQ上，形成CoQH2和FAD[13-14]。若SDH功能異常，CoQH2和FAD的含量降低，從而影響以FAD為受氫體的氨基酸代謝酶以及脂酰CoA脫氫酶的正常功能[15-16]。另有研究證實(shí)高濃度的二氮嗪(mitoKATP通道開(kāi)放劑)也可以抑制SDH的功能，以保護(hù)心肌[17]。本研究發(fā)現(xiàn)與Con組比較，SDHA在IPO組的表達(dá)顯著降低，推測(cè)可能是因?yàn)槿毖筇幚硇募〖?xì)胞中mitoKATP通道被激活，從而線粒體中SDHA蛋白的表達(dá)受到影響；也可能是因?yàn)槿毖筇幚碛绊懥司€粒體中SDHA蛋白的活性，繼而激活了心肌細(xì)胞中的mitoKATP，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

與缺血后處理組比較發(fā)現(xiàn)，5-羥葵酸(5-HD)拮抗IPO后心肌SDHA表達(dá)升高1.65倍。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與缺血后處理SDHA蛋白表達(dá)下降，推測(cè)SDHA與mitoKATP通道可能有直接的相互作用，在心肌保護(hù)中共同發(fā)揮作用。

綜上所述，我們認(rèn)為缺血后處理具有心肌保護(hù)作用，NADH呼吸鏈參與了缺血后處理對(duì)心肌的保護(hù)作用。琥珀酸脫氫酶重要亞基SDHA表現(xiàn)出與mitoKATP“負(fù)相關(guān)”的功能，二者之間的相互作用對(duì)心肌保護(hù)具有重要意義，SDHA可能成為心肌保護(hù)的藥物研發(fā)的作用靶點(diǎn)。

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(編輯：譚秀榮)

Comparative proteomics study on myocardial mitochondrial proteins in rats following ischemic postconditioning

Zhang Lin,Zhou Wenjing,Huang Jianting,Yu Tian

(Guizhou Key Laboratory of Anesthesia and Organ Protection,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveUsing rat ischemia/reperfusion injury (IRI) model to purify myocardial mitochondria and harvest mitochondrial protein.Explore the changes of protein expression by using 2D - DIGE in mitochondria following ischemic postconditioning.And investigate the protective effect of ischemic postconditioning on rat which suffered IRI.Methods24 Sprague-Dawley rats were divided into normal (Nor) group,control (Con) group,ischemic postconditioning (IPO) group and IPO plus 5-hydroxydecanoate (IPO+5-HD) group.Langendorff apparatus was used to establish the model of myocardial ischemia /reperfusion injury.Nycodenz density gradient centrifugation was used to purify the myocardial mitochondrial and Western blot analysis was used to verify the purity.The myocardium mitochandrial protein was investigated by using the technique of 2D-DIGE and MALO-TOF-MS.ResultsCompared with the Nor group,the expression level of NDUFA10 was reduced 3.84 times in the Con group.Compared with the Con group,the expression levels of NDUFA10 and SDHA were reduced 3.33 times and 1.68 times separately in the IPO group.Compared with the IPO group,the expression level of SDHA was increased 1.65 times in the IPO+5-HD group.ConclusionIschemia reperfusion injury can change the expression of NDUFA10.Ischemic postconditioning may maintain the stability of mitochondrial NADH activity.SDHA and mitoKATP may together participate in the protection mechanism of endogenous IPO.

Ischemic postconditioning; mitochondrial; proteomics; two-dimensional difference in gel electrophoresis; mass spectrometry; cardioprotection

衛(wèi)生部衛(wèi)生行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(NO：200802173)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字LKZ2010-25)。

喻田，女，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：全身麻醉機(jī)制、疼痛相關(guān)機(jī)制、心肌保護(hù)，E-mail:zunyiyutian@163.com。

R541.4

A

1000-2715(2017)04-0369-05

[收稿2017-05-17;修回2017-06-24]