陳金東

(羅切斯特大學醫(yī)學中心泌尿科腎癌研究室，紐約羅切斯特市，NY 14642，美國)

候鳥之窗

腎癌敲基因小鼠模型建立及應用的研究進展

陳金東

(羅切斯特大學醫(yī)學中心泌尿科腎癌研究室，紐約羅切斯特市，NY 14642，美國)

腎癌是一種高度遺傳異質性的遺傳疾病。目前多個重要的腎癌相關基因已被克隆。這些基因包括VHL、FH、c-Met、TSC1、TSC2、FLCN、PBRM1、BAP1、SETD2 、Trp53、PTEN及APC等。為了研究腎癌的發(fā)病機理和測試新的治療方法，與這些基因相應的敲基因腎癌小鼠模型已經(jīng)建立?？墒牵薚SC1、TSC2、FLCN和Trp53外，大部分單基因敲除小鼠模型未能產(chǎn)生與人類腎癌相似的表型。最近的VHL-PBRM1、VHL-BAP1、PBRM1-BAP1腎特異性雙基因敲除小鼠模型普遍產(chǎn)生透明腎細胞癌(CCRCC)，是腎癌敲基因小鼠模型發(fā)展史上的一個新的里程碑， 為腎癌的研究和藥物測試提供了新的工具。腎特異性FLCN敲基因小鼠模型和VHL-Trp53-Kif3a三基因敲除小鼠模型已用于藥物試驗，并成功地取得了預期的結果。

腎癌；腎癌基因；敲基因小鼠模型； 腎癌治療

在研究人類疾病發(fā)病機理和治療方法的過程中，由于倫理和安全方面的原因，需要建立疾病動物模型來真實模擬人類疾病，通過這些動物模型探索人類疾病發(fā)生和發(fā)展機理、發(fā)現(xiàn)藥物新靶點以及進行臨床前藥效學評價等。我國在這方面的不足已經(jīng)影響了相關基礎研究和應用基礎研究的發(fā)展。2017年度國家自然科學基金委員會醫(yī)學科學部在面上項目中就設立了“疾病動物模型”專項，肯定了人類疾病的動物模型在醫(yī)學科學研究領域中的理論價值和臨床意義。 在所有動物模型中,小鼠基因敲除模型因其可操縱性及其表型的可預期性而被廣泛用于基因功能、疾病機制和藥物篩選研究。

癌癥是當今對人類健康影響最大的一類遺傳疾病之一，建立基因敲除小鼠模型來研究癌癥的致病機理和探討其治療策略就十分有意義。一些癌癥已有了較好的敲基因小鼠模型。然而，對于腎癌，基因敲除小鼠模型的研究進程卻頗為波折。腎癌主要分為腎透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,CCRCC，80%)、乳頭狀腎細胞癌(Papillary renal cell carcinoma,PRCC，10%)、嫌色腎細胞癌(Chromophobe renal cell carcinoma,CRCC，5%)、腎集合管癌 (Colleting duct carcinoma) 及尚未分類的腎癌(5%)[1]。已發(fā)現(xiàn)的幾個重要的腎癌相關基因包括VHL、FH、c-Met、TSC1、TSC2、FLCN、PBRM1、BAP1、SETD2 、Trp53、PTEN及APC等[2]。每個基因被克隆出來后，研究人員就著手建立相應的敲基因腎癌小鼠模型?？墒?，大部分基因敲除小鼠模型的結果都令人失望，比如其中最重要的VHL、FH、c-Met基因在小鼠腎上敲除后僅偶爾產(chǎn)生腎囊腫外，未見有腎癌產(chǎn)生[3]，雖然TSC1/TSC2基因敲除小鼠可以產(chǎn)生腎癌[4]，但出現(xiàn)遲、發(fā)病率低，不利于藥物篩選和藥效判斷。此后直到FLCN基因的克隆和腎特異性FLCN敲基因小鼠模型的建立及FLCN腎敲基因小鼠能產(chǎn)生多種類型的腎癌，使腎癌基因敲除小鼠模型的研究上了一個新的臺階。最近VHL-PBRM1、VHL-BAP1、PBRM1-BAP1雙基因敲除小鼠模型的建立及這些模型能有效地產(chǎn)生與人類相似的透明細胞腎細胞癌，是腎癌研究史上一個新的里程碑。如果從腎癌類型來分，腎癌敲基因小鼠模型可分為透明細胞腎細胞(CCRCC)敲基因小鼠模型、乳頭狀腎細胞癌(PRCC)敲基因小鼠模型、嫌色腎細胞癌(CRCC)敲基因小鼠模型和綜合型腎細胞癌敲基因小鼠模型。本文將分類介紹各種腎癌敲基因小鼠模型的建立及其表型與可能的應用。

1 透明細胞腎細胞癌敲基因小鼠模型

透明細胞腎細胞癌(CCRCC)是一類主要的腎癌，約占腎癌的80%。目前發(fā)現(xiàn)與CCRCC相關的基因主要有VHL、PBRM1、BAP1、SETD2。除SETD2外，目前已有VHL、PBRM1、BAP1的單基因敲除小鼠模型和VHL-PBRM1、VHL-BAP1及PBRM1-BAP1的雙基因敲除小鼠模型。這些模型中，所有單基因敲除小鼠模型均不能產(chǎn)生腎癌，而所有雙基因敲除小鼠模型的表型在程度上既有相似之處，又有一些差別，但均可產(chǎn)生CCRCC。

1.1VHL敲基因小鼠模型VHL基因是第1個克隆到的腎癌抑制基因，是從一種稱為 von-Hippel-Lindau的常染色體顯性遺傳癌癥綜合癥的病人中發(fā)現(xiàn)的[5]。VHL病人常因VHL基因突變或基因沉默(gene silencing)而患有腎囊腫和雙側透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinomas,CCRCC)。大部分的CCRCC表現(xiàn)為實體瘤，大約5% 呈現(xiàn)出囊腫樣，腫瘤細胞則分布在囊腫壁上。VHL基因位于3p25.3，只有3個外顯子，編碼大小分別為213個氨基酸和160 個氨基酸的兩個蛋白。研究發(fā)現(xiàn)大概70%的CCRCC是由VHL突變引起[6-7]。VHL突變在遺傳性和散發(fā)性的CCRCC都存在。由于80%以上的腎癌屬于CCRCC，這一數(shù)據(jù)表明VHL是一個十分重要的腎癌抑制基因。在VHL克隆后，幾個研究小組就著手建立VHL敲基因小鼠模型，因為如果VHL敲基因小鼠能夠表現(xiàn)出類似人類的CCRCC,將為腎癌的分子機制和治療研究提供有力的研究工具。由于傳統(tǒng)的敲基因技術會將小鼠全身的VHL基因敲除，致使純合子VHL敲基因小鼠在胚胎期死亡。為此，Rankin等采用PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase promoter) 作為Cre基因的啟動子[8]，由于PEPCK-Cre只在腎近曲小管和肝細胞中表達，因此VHL-PEPCK-Cre只特異性的敲除腎近曲小管和肝細胞中的VHL基因，這樣在一般情況下就不會導致敲基因小鼠在胚胎期死亡。當VHL的外顯子1和2 在腎近曲小管中被敲除后，研究者預期敲基因小鼠將產(chǎn)生CCRCC。然而，雖然個別VHL敲基因小鼠能產(chǎn)生腎囊腫或增生(見圖1)，VHL敲基因小鼠并沒有像預期的那樣產(chǎn)生腎癌，更沒有產(chǎn)生類似人類的透明細胞腎細胞癌[3,8-11]。即使在VHL敲基因小鼠中同時失活Hif基因，也只是引起腎小球囊腫(見圖1C)。我們也曾用另一個近曲小管表達啟動子Sglt2-Cre來敲除VHL,結果也沒有產(chǎn)生腎癌。然后又用Ksp-Cre(Ksp-cadherin gene promoter)作為Cre基因的啟動子，來敲除其它腎小管如遠曲小管、集合管及亨氏套(loop of Henle),同樣未能導致腎腫瘤的發(fā)生。這些結果說明以下兩點問題：①單一的VHL基因突變尚不能引起腎癌，VHL腎腫瘤可能是多基因突變所致的結果；②小鼠的VHL突變相關的致瘤通路與人類的有一定差異。

A：VHLf/f對照；B：敲基因小鼠產(chǎn)生腎小管囊腫；C：敲基因小鼠在去除Hif基因后產(chǎn)生的腎小囊囊腫。T-Cy,tubular cyst；G-Cy,glomerular cyst。(來自：Cancer Res,2006, 66:2576-2583)圖1 VHL敲基因小鼠不產(chǎn)生腎腫瘤

1.2PBRM1敲基因小鼠模型PBRM1是繼VHL后發(fā)現(xiàn)的第2個重要的腎癌抑制基因，且也位于3號染色體短臂(3p21)[12]。與VHL相似，PBRM1主要與CCRCC有關，有約40% CCRCC是由PBRM1突變引起[12-14],而與其它類型的腎癌幾乎沒有什么關系[15-16]。PBRM1編碼一個1852個氨基酸的BAF180蛋白，而BAF180是SWI/SNF復合物的成員之一，與ATP依賴性的染色體重構有關。當PBRM1被發(fā)現(xiàn)也與CCRCC有關時，多個研究組即著手腎特異性PBRM1敲基因小鼠的建立，期望PBRM1基因敲除小鼠模型能產(chǎn)生CCRCC。然而，PBRM1敲基因小鼠與VHL敲基因小鼠一樣，不僅沒能產(chǎn)生CCRCC，而且也沒有產(chǎn)生別的腎癌。我們研究組也采用Ksp-Cre和Sglt2-Cre技術對PBRM1進行了敲除，雖然一部分敲基因小鼠產(chǎn)生腎囊腫，但均未得到預期的腎癌表型。說明PBRM1與VHL一樣，在小鼠中單一的PBRM1突變并不能導致CCRCC的產(chǎn)生，CCRCC的產(chǎn)生應是兩個以上基因變異的結果。其實研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些腎癌同時有VHL和PBRM1突變[12,17]。而另一研究發(fā)現(xiàn)很多轉移性腎癌(CCRCC)同時具有BAP1和PBRM1突變[17-18]。這些發(fā)現(xiàn)提示CCRCC的產(chǎn)生可能需要同時敲除兩個或以上與CCRCC相關的基因。因此，一些研究小組就著手建立起VHL-PBRM1雙基因敲除小鼠模型。

1.3VHL-PBRM1雙基因敲除小鼠模型 由于VHL和PBRM1的單基因敲除小鼠未能產(chǎn)生預期的腎癌，而一部分透明細胞腎細胞癌同時攜帶有VHL和PBRM1基因突變[12]，這些現(xiàn)象表明，透明細胞腎細胞癌很可能是多基因突變共同作用的結果，如果同時敲除小鼠腎的VHL和PBRM1基因，受累小鼠就很有可能產(chǎn)生CCRCC。為此，Nargund 等采用Ksp-Cre方法敲除了小鼠腎遠曲小管、亨氏套管和集合管的VHL和PBRM1基因，獲得的VHL-PBRM1雙基因敲除模型除了產(chǎn)生腎囊腫外，Nargund等還成功觀察到了透明細胞腎細胞癌(見圖2)[19]。大概58%的雙基因敲除小鼠產(chǎn)生腎囊腫，33%(12/36)的小鼠產(chǎn)生CCRCC。我們小組則采用Sglt2-Cre系統(tǒng)建立了腎近曲小管VHL-PBRM1雙基因敲除小鼠模型，同樣也觀察到了透明細胞腎細胞癌，大約30% (6/21) 的受累小鼠產(chǎn)生腎癌。敲基因小鼠能存活超過12個月以上。這個模型將可用于VHL和PBRM1相關的分子機制的研究，也將能用于藥物篩選。這些結果說明小鼠的VHL和PBRM1與人的一樣，都與腎癌的發(fā)生有關，同時也進一步證明了CCRCC 的產(chǎn)生需要至少兩個CCRCC腎癌相關基因的突變才能實現(xiàn)。下面的VHL-BAP1雙基因敲除小鼠模型也能說明這一點。

1.4VHL-BAP1雙基因敲除小鼠模型 前面已經(jīng)描述VHL和PBRM1為兩個主要的CCRCC 相關基因。后來發(fā)現(xiàn)BAP1基因也是一個CCRCC相關基因，BAP1在CCRCC的突變率大約為15%[12,17,20]，是第3個最重要的CCRCC相關基因。研究還發(fā)現(xiàn)，PBRM1一般與較低級別的CCRCC有關，而BAP1突變則引起高級CCRCC。有趣的是，與VHL和PBRM1一樣，BAP1基因也位于人的3號染色體短臂(3p21.1),含有17個外顯子，編碼一個729個氨基酸的BAP1蛋白，BAP1也叫BRCA1相關蛋白1，是一個去泛素化的泛素分解酶。為了在小鼠中了解BAP1基因突變與腎癌的關系，Wang等采用Six2-Cre系統(tǒng)建立了BAP1腎特異性敲基因小鼠模型[20]，發(fā)現(xiàn)純合子BAP1敲基因小鼠在出生后即表現(xiàn)為病態(tài)，而且個體比正常對照小鼠要小，大約30 d后死于高血尿氮引起的尿毒癥。腎臟多處出現(xiàn)腎囊腫，而且這些囊腫似乎在出生時即已經(jīng)形成。BAP1雜合子敲基因小鼠卻沒有腎囊腫等腎損傷發(fā)生，更沒有觀察到CCRCC的出現(xiàn)，因此BAP1單基因敲除小鼠模型也不能產(chǎn)生CCRCC?？紤]到VHL也是CCRCC的重要基因，Wang等進一步建立了VHL-BAP1雙基因敲除小鼠模型[21]。由于VHL-BAP1純合子敲基因小鼠(Six2-Cre;VHLlf/f;BAP1f/f)出生后一個月內(nèi)死亡，只有VHL純合子BAP1雜合子(Six2-Cre;VHLlf/f;BAP1f/+)小鼠能夠存活至少6個月以上，并產(chǎn)生腎囊腫和較小的初級CCRCC。由于BAP1的雜合性，致使所產(chǎn)生的CCRCC不能長大或惡性化。因此，VHL-BAP1腎特異性雙基因敲除小鼠與VHL-PBRM1類似，也能產(chǎn)生CCRCC。

(來自: Cell Reports, 2017,18: 2893-2906)圖2 腎特異性VHL-PBRM1雙基因敲除小鼠產(chǎn)生CCRCC腎癌

1.5PBRM1-BAP1雙基因敲除小鼠模型 雖然VHL、PBRM1和BAP1都位于人的3號染色體短臂上，且均在一個50 MB的區(qū)域，但在小鼠中，VHL位于6號染色體上，而PBRM1和BAP1均位于14號染色體上。因此，在小鼠中，PBRM1和BAP1的關系可能更為密切，如果同時敲除小鼠腎中PBRM1和BAP1，被敲除基因的小鼠更易于產(chǎn)生腎腫瘤。PBRM1和BAP1突變都可引起CCRCC,但二者引起的CCRCC 在表型上卻有差異。PBRM1突變所致的腎癌為低惡性度CCRCC，而BAP1引起的腎癌為高惡性度CCRCC。患有BAP1突變CCRCC的病人的生存期明顯低于患有PBRM1突變CCRCC的病人[22]。最近，Gu等采用Pax8-Cre系統(tǒng)建立了BAP1-PBRM1雙基因敲除小鼠模型(見圖3)[23]，并觀察到BAP1-PBRM1雙基因敲除小鼠產(chǎn)生高惡性度CCRCC，與人類CCRCC十分相似。這一雙基因敲除小鼠模型進一步說明CCRCC的產(chǎn)生需要兩個或兩個以上相關基因的突變，且PBRM1和BAP1在小鼠中的相互作用比VHL和PBRM1或VHL和BAP1要強。綜合分析以上三個雙基因敲除小鼠模型的表型，VHL-PBRM1產(chǎn)生惡性度低的CCRCC，而PBRM1-BAP1則可產(chǎn)生惡性度高的CCRCC，二者均能用于CCRCC發(fā)病機制的研究，還將可用于抗CCRCC藥物的篩選和藥效測試。而VHL-BAP1因純合子敲基因小鼠出生后不久將死亡，雜合子(Six2-Cre;VHLlf/f;BAP1f/+)小鼠表型強度和效率較低，使其應用受到限制。

上一行為惡性度低的腎腫瘤；下一行為惡性度高的腎腫瘤(來自：Cancer Discovery， 2017，DOI: 10.1158/2159-8290.CD-17-0292)圖3 腎特異性PBRM1-BAP1雙基因敲除小鼠產(chǎn)生CCRCC腎癌

2 乳頭狀腎細胞癌小鼠模型

前面已經(jīng)介紹了CCRCC的腎特異性基因敲除小鼠模型，這里介紹乳頭狀腎細胞癌(PRCC)基因敲除小鼠模型。PRCC是第二類重要的腎癌，約占所有腎癌的15%，乳頭狀腎細胞癌又分為I型和II型[24]。目前發(fā)現(xiàn)與乳頭狀腎細胞癌有關的基因有c-Met和FH。

2.1c-Met基因突變小鼠模型c-Met基因是一個原癌基因，位于染色體7q31.2[25]。c-Met編碼肝細胞生長因子 (hepatocyte growth factor,HGF) 的一個長為1390氨基酸的受體Met?；蛲蛔儗е翸et基因激活，致使Met蛋白高度表達，血管生成，導致腫瘤生長及腫瘤轉移。在腎臟中，c-Met基因的激活主要與散發(fā)的 I 型乳頭狀腎細胞癌有關，占所有乳頭狀腎細胞癌的5%左右[26]。為了研究c-Met突變在體內(nèi)的致瘤性，Graveel 等建立了5種c-Met突變的小鼠模型：D1226N、Y1228C、M1248T、 M1248T 和 L1193V。結果發(fā)現(xiàn)D1226N、Y1228C、M1248T 和 L1193V突變小鼠產(chǎn)生大量肉瘤(sarcoma)和淋巴瘤(lymphoma)，而M1248T則產(chǎn)生上皮細胞癌(carcinoma)和淋巴瘤。然而，這些c-Met突變小鼠并沒有產(chǎn)生類似人類的腎腫瘤，即乳頭狀腎細胞瘤。不過發(fā)現(xiàn)上述腫瘤細胞中存在有6號染色體三體和c-Met突變重復，這一點和人乳頭狀腎細胞癌的染色體變異相似。

2.2FH敲基因小鼠模型FH是在2002年從遺傳性平滑肌瘤病伴乳頭狀腎細胞癌(Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Cancer， HRLCC)病人中發(fā)現(xiàn)的[27]，因此，F(xiàn)H只與人乳頭狀腎細胞癌(PCRR)有關。FH位于人染色體1q43，編碼一個由468個氨基酸組成的線粒體三羧酸循環(huán)中延胡索酸水化酶(Fumarate hydratase,FH)。FH主要和 II 型乳頭狀腎細胞癌有關，而在其它類型的腎癌中并未發(fā)現(xiàn)有FH突變。而且這類乳頭狀腎細胞癌需伴有平滑肌瘤病，也就是FH突變只存在于HLRCC綜合癥中。為了更進一步研究FH的功能，Pollard等于2007年建立了一個FH敲基因小鼠模型，F(xiàn)H的外顯子2和3被敲除。由于FH全身敲基因小鼠在胚胎期死亡，因而又采用Ksp-Cre技術建立了FH腎特異性敲基因小鼠模型，可是FH敲基因小鼠也只產(chǎn)生腎囊腫，未見有腎癌發(fā)生(見圖4)。由于Ksp-Cre只在遠曲小管、集合管和亨氏套中表達，而近曲小管的FH并沒有被敲除，是否敲除近曲小管里的FH可以產(chǎn)生腎癌尚不清楚。從現(xiàn)有結果看，與VHL情況類似，僅僅敲除FH基因不足以導致PRCC的生成，還有哪些基因也參與了FH-相關的乳頭狀細胞癌的產(chǎn)生還有待進一步研究。目前還沒有產(chǎn)生PRCC的雙基因敲除小鼠模型。

A：FH敲基因小鼠腎臟；B：野生型小鼠腎H&E染片；C：FH敲基因小鼠腎囊腫H&E染片。(來自: Cancer Cell,2007,11,311-319)。圖4 FH腎特異性敲基因小鼠模型產(chǎn)生腎囊腫

3 嫌色腎細胞癌敲基因小鼠模型——FLCN敲基因小鼠模型

FLCN是目前唯一一個主要與人類嫌色腎細胞癌(CRCC)有關的基因，但并非是CRCC特異性的，F(xiàn)LCN也與其它類型的腎癌有關。FLCN基因于2002年從Birt-Hogg-Dube綜合癥 (Birt-Hogg-Dube syndrome,BHD) 病人中克隆獲得[28-29]。BHD病人易發(fā)皮膚腫瘤，腎癌，肺部囊腫，氣胸，及其它癥狀如腸道息肉。大概50%的BHD家族有腎癌歷史[30]，有34%的BHD病人有腎癌。人的FLCN位于染色體17p11.2，共有 14個外顯子，編碼一個579氨基酸的FLCN蛋白，并可能調節(jié)mTOR和TGF-β等信號傳導途徑。FLCN與VHL基因不同，VHL基因突變一般只導致CCRCC的產(chǎn)生，而FLCN突變幾乎引起各類腎癌的發(fā)生，一項對來自30個BHD家系中的130例腎癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LCN突變出現(xiàn)在34%嫌色腎細胞癌，5%的大嗜酸粒細胞瘤(oncocytoma)，50%的嫌色腎細胞癌與大嗜酸粒細胞瘤混合型腎癌，9%的透明細胞腎細胞癌及2%的乳頭狀腎細胞癌中[31]。FLCN在腎癌中常發(fā)生突變，其中以11外顯子突變最多[32]，其類型有大片段缺失[33]、雜合性丟失[34]、點突變等[35]。此外，在狗和大鼠的腎癌中也發(fā)現(xiàn)有FLCN突變[36-38]。與其它腎癌基因不同的還有，F(xiàn)LCN敲基因小鼠模型能復制出人類BHD腎癌。因此，這是目前唯一能同時與各類腎細胞癌有關的基因。

最初建立的FLCN全身敲除小鼠模型的純合子小鼠在胚胎期就死亡，而雜合子小鼠發(fā)病很遲，發(fā)病率偏低且不穩(wěn)定[39-41]。基于上述問題，研究人員又采用Ksp-Cre系統(tǒng)建立了FLCN腎遠曲小管-亨氏套管-集合管特異性基因敲除小鼠和FLCN腎近曲小管基因敲除小鼠模型，首次成功建成了具有腎癌表型的腎小管特異的FLCN基因敲除小鼠模型[42-44]。這兩個模型中，前者小鼠在出生后一周即出現(xiàn)腎囊腫和細胞增生，隨后伴有囊腫腺癌的產(chǎn)生(見圖5)，小鼠血尿素氮快速增高，三周左右即死于尿毒癥。由于受累小鼠生存時間太短，因此并沒有實體瘤產(chǎn)生。

(來自: 本人的研究工作)。圖5 FLCN腎遠曲小管-亨氏套管-集合管特異性基因敲除小鼠產(chǎn)生腎囊腫和腺癌

與前者不同，腎近曲小管FLCN基因敲出模型能產(chǎn)生各類腎癌(腎囊腫發(fā)病率為100%，腫瘤發(fā)病率約70%)(見圖 6)，而且腎癌出現(xiàn)在出生后6～7個月，生存時間長達24個月，因而具有很高的研究應用價值。尤其重要的是，從該小鼠模型能動態(tài)觀察腎癌的發(fā)生發(fā)展過程。即在1～2個月時，可觀察到腎囊腫；3～4個月時，囊腫增多，可見腎細胞增生；5～6個月時，增生組織向癌轉化；6～7個月時，已能觀察到微型腎細胞癌，主要為腎嫌色細胞癌；到了10個月左右時，已能觀察到中等大小的癌；12個月后，大型腫瘤出現(xiàn)，此時乳頭狀腎細胞癌開始占主要；16個月后，一些腫瘤已轉化為肉瘤狀腎癌，一類惡性化程度較高的腎癌[43],很適合做藥物篩選和藥效研究。我們利用FLCN腎特異性敲基因小鼠的這一特點，用雷帕霉素對小鼠進行了10個月的治療[43]。由于研究已經(jīng)證明FLCN缺失導致mTOR信號傳導通路的激活，從而促進腎癌細胞的生長，而雷帕霉素是mTOR的抑制劑。雷帕霉素治療能抑制腎癌的生長，但不能完全消除癌細胞。這說明，F(xiàn)LCN相關癌細胞的產(chǎn)生需要不止一個信號通路的激活。這些結果證明，F(xiàn)LCN腎近曲小管基因敲除小鼠模型可以用于腎癌的分子機制研究和藥物的測試篩選。是目前一個較為理想的腎癌敲基因小鼠模型。

(來自: 本人的研究工作)。圖6 腎近曲小管FLCN基因敲出模型能產(chǎn)生各類腎癌

4 綜合型腎細胞敲基因小鼠模型

綜合型腎細胞癌敲基因小鼠模型是指小鼠在基因敲除后可產(chǎn)生多類腎細胞癌，包括CCRCC、PRCC、CRCC、腎集合管癌及其它腎細胞癌。其實前面描述的FLCN敲基因小鼠模型也屬于這一類，只是FLCN突變主要與人嫌色腎細胞癌有關，約占50%，就將其視為嫌色腎細胞癌基因敲除小鼠模型。此外，TSC1、TSC2和NF2的敲基因小鼠也產(chǎn)生多類腎細胞癌，故也屬于綜合型腎細胞癌敲基因小鼠模型。

4.1TSC1/TSC2敲基因小鼠模型TSC1/TSC2是兩個緊密相關的基因，均從結節(jié)性硬化癥(Tuberous sclerosis,TS)病人中發(fā)現(xiàn)的[45-46]。由于結節(jié)性硬化癥病人常有腎癌發(fā)生[47]，因此也將TSC1/TSC2作為腎癌相關基因，但在散發(fā)性腎癌中很少發(fā)現(xiàn)有這兩個基因的突變。TSC1基因位于染色體9q34.13,而TSC2則位于染色體16p13.3。TSC1基因有23個外顯子，編碼一個1164個氨基酸的錯構瘤蛋白(hamartin)，而TSC2基因有41個外顯子，編碼一個長達1807氨基酸的薯球蛋白(tuberin)，兩蛋白結合形成蛋白復合物，抑制mTOR信號傳導途徑。因此，我們一般將這兩個基因一起討論。Kobayashi等于2001年通過傳統(tǒng)的基因敲除法去除了TSC1基因的第6、7和8三個外顯子，TSC1純合子敲基因小鼠在胚胎期致死，雜合子能成活至成年，除了產(chǎn)生腎囊腫外，還可產(chǎn)生多種腎囊腫腺瘤，但腎囊腫腺瘤出現(xiàn)的很晚。此外，還發(fā)現(xiàn)有肝臟血管瘤和子宮瘤等。TSC2敲基因小鼠的表型與TSC1敲基因小鼠的相似。其實TSC2敲基因小鼠模型早于TSC1敲基因小鼠模型建成。Kobayashi等在敲基因小鼠模型中去除了TSC2基因的第3號和第4號外顯子。TSC2純合子敲基因小鼠也是胚胎期致死，雜合子小鼠也產(chǎn)生腎囊腫和多種腎囊腫腺癌及肝臟血管瘤，但二者的腫瘤出現(xiàn)很晚，發(fā)病率很低。因此，這兩個模型均不能用于腎癌藥物的篩選和藥效評價。但可以用于TSC1/TSC2的分子機制的研究。

4.2NF2敲基因小鼠模型NF2基因突變與II型神經(jīng)纖維瘤(neurofibromatosis)和施萬瘤病(schwannomatosis) 的發(fā)生有關。NF2有19個外顯子，位于染色體22q2.2，編碼一個595個氨基酸的神經(jīng)纖維瘤蛋白(neurofibromin 2或merlin)。由于NF2調節(jié)EGFR的表達，而高表達的EGFR在腎癌中很常見，因此，NF2的突變也與腎癌的發(fā)生有關。不過NF2基因在腎癌中的突變率只有大約2%。為了進一步了解NF2在腎癌中的作用，Morris于2009年采用了Villin-Cre方法建立了腎近曲小管特異性NF2敲基因小鼠模型[48]。在這個模型中，NF2基因的第2和3號外顯子被敲除。幾乎所有NF2腎近曲小管純合子敲基因小鼠在15 d大時就可觀察到腎細胞增生和腎囊腫，在3個月大時就長出小的腎小管內(nèi)腫瘤，當受累小鼠長到6～10個月大時，腎腫瘤已轉變?yōu)榍趾π阅I癌，同時也發(fā)現(xiàn)這些腎癌中EGFR高度表達，表明NF2的失活導致了EGFR信號通路的激活，從而引起了腎癌的產(chǎn)生。NF2敲基因小鼠的生存期達10個月以上。此外，未發(fā)現(xiàn)有雜合子小鼠產(chǎn)生腎癌。雖然NF2不是一個主要的腎癌相關基因，但這個腎癌小鼠模型似乎是一個外顯率比較高，發(fā)病較早的腎癌模型，理論上應該能用于NF2相關的腎癌發(fā)病機制的研究及相關藥物的篩選?？上ё髡邲]有進一步利用這個模型進行藥物篩選試驗。

4.3 其它雙基因或三基因腎癌敲除小鼠模型 除了上述雙基因敲除小鼠模型外，還有腎VHL-Trp53雙基因敲除小鼠模型和腎VHL-PTEN雙基因敲除小鼠模型[9-10]。雖然VHL-Trp53敲除小鼠模型也能產(chǎn)生少量體積較小的腎癌[10]，但考慮到Trp53是一個廣譜抑癌基因，其突變與多種癌癥的產(chǎn)生有關， 已經(jīng)有報道表明Trp53單基因敲除小鼠模型也能導致腎癌的產(chǎn)生，而作者并沒有對VHL-Trp53 雙基因敲除小鼠模型與Trp53單基因敲除小鼠模型的表型做比較。因此， 很難確定VHL的突變在VHL-Trp53 基因敲除小鼠模型中的真實作用。PTEN是另一個廣譜抑癌基因，但腎特異性PTEN基因敲除小鼠模型并沒有產(chǎn)生腎細胞癌，而是產(chǎn)生了腎盂泌尿上皮細胞癌(urothelial carcinoma of the renal pelvis)。VHL-PTEN腎雙基因敲除小鼠模型除了有腎囊腫外，同樣也未能長出腎細胞癌[9]。最近也有研究者建立了腎特異性的VHL-Trp53-Kif3a和VHL-Trp53-Rb1三基因敲除小鼠模型[49-50]，雖然這些小鼠也能產(chǎn)生腎癌，但VHL-Kif3a敲基因小鼠只能產(chǎn)生腎囊腫，說明p53 在腎癌的生成中起著決定性的作用。因此，從這些結果看，VHL和p53 或PTEN在功能上并沒有明確的互補作用，因此，VHL在這些雙基因或三基因的敲除小鼠中的致癌作用并不明顯。其應用還需進一步的研究。

5 腎癌小鼠模型的應用前景

隨著分子生物學和分子遺傳學技術的不斷發(fā)展，生物信息學的應用以及大數(shù)據(jù)的出現(xiàn)，人們已對各類疾病發(fā)病的分子基礎有了更深入的了解和認識。然而對各類遺傳疾病的治療方面的研究卻并沒有多大進展。其原因之一是沒有合適的動物模型來用于各種藥物及治療方案的測試。癌癥作為一類復雜的遺傳疾病，更需要動物模型作為研究的平臺。小鼠因其個體小，繁殖快，生命周期短，其基因組已被全部測序，且95%以上的基因與人類基因相似，是目前相對理想的動物模型研究對象。就癌癥而言，癌癥小鼠模型體內(nèi)的腫瘤可以反應人類癌癥相關基因和腫瘤的分子及細胞特性，因此，在理論上，癌癥的致病機制的研究和新藥物的測試及新療法的檢測都可以依賴于經(jīng)遺傳工程精確改造的癌癥小鼠模型。然而，幾十年來，各類癌癥小鼠模型不斷出現(xiàn)，但真正有研究及應用價值的癌癥小鼠模型卻寥寥無幾。一個癌癥小鼠模型需滿足以下四點才可以考慮用于藥物測試和新療法的檢驗：①產(chǎn)生的癌癥和人類的相似；②小鼠癌癥發(fā)病要早，在一歲以前發(fā)病較好；③發(fā)病率要高；④發(fā)病小鼠的壽命要足夠長，以便于有足夠的時間觀察療效。以本文提及的腎癌小鼠模型為例，VHL、FH、c-Met、PBRM1、BAP1等腎敲基因小鼠模型均未能產(chǎn)生腎腫瘤，無法用于進一步的腫瘤分子機制及藥物測試等研究；而一小部分TSC1、TSC2腎敲基因雜合子小鼠雖能產(chǎn)生腎腫瘤，但腫瘤出現(xiàn)在小鼠生命的晚期，也沒法用于藥物試驗。直到最近出現(xiàn)的腎近曲小管FLCN敲基因小鼠模型和VHL-PBRM1、VHL-BAP1及PBRM1-BAP1等腎雙基因敲除小鼠模型的出現(xiàn)，為腎癌的分子發(fā)病機制研究及藥物測試研究提供了新的希望。目前，腎近曲小管FLCN敲基因小鼠模型已用于雷帕霉素的藥物試驗，并取得了一定療效[43]，雷帕霉素抑制腎囊腫及腫瘤細胞的生長。因此，腎近曲小管FLCN敲基因小鼠模型將可以用于FLCN相關信號傳導通路的研究及更多藥物的測試，可為將來的藥物臨床試驗提供有用的實驗依據(jù)，是一個很有研究價值的腎基因敲除小鼠模型。最近，Harlander 等也利用其建立的VHL-Trp53-Rb1三基因敲除小鼠模型進行了藥物試驗[50]，他們首先采用舒尼替尼(sunitinib) 對4只受累小鼠進行了初級治療，發(fā)現(xiàn)受治療的19個腫瘤中，3個出現(xiàn)了消退，10 個表現(xiàn)為停止生長或生長很慢，6個繼續(xù)生長。接著他們又對這四只小鼠用依維莫司(everolimus)進行了二級治療，發(fā)現(xiàn)78% 的腫瘤停止生長或發(fā)生消退，只有4個腫瘤產(chǎn)生了抗性。舒尼替尼和依維莫司是臨床上已用于腎癌治療的藥物[51]。說明這個模型同樣可以用于臨床前藥物的篩選和新療法的測試。VHL-PBRM1、VHL-BAP1及PBRM1-BAP1等腎雙基因敲除小鼠模型目前還沒有用于藥物試驗[18,21,23]，但因這些模型能產(chǎn)生與人類CCRCC相似的腎癌，且發(fā)病較早，發(fā)病率較高，小鼠生存期較長等特點，也將是很有潛力的腎癌分子機制和藥物測試的研究工具。這些模型的應用將會大大加速腎癌藥物的研究與開發(fā)的速度。

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(編輯：譚秀榮)

Advances in development and application of knockout mouse models of kidney cancer

Chen Jindong

(Kidney Cancer laboratory,Department of Urology,University of Rochester Medical Center,Rochester,NY 14642,USA)

Kidney cancer is a highly genetic heterogenic disease.To date,many key kidney cancer-related genes have been cloned.These genes includeVHL,FH,c-Met,TSC1,TSC2,FLCN,PBRM1,BAP1,SETD2,PTEN,Trp53,andAPC.To investigate renal pathogenic mechanisms and test new therapeutic strategies,corresponding knockout kidney cancer mouse models have been developed following the identification of these genes.However,most of the single-gene knockout models failed to recapitulate the human renal cancer except fromTSC1,TSC2,FLCN,andTrp53 models.The development ofVHL-PBRM1,VHL-BAP1,andPBRM1-BAP1double-gene knockout mouse models has represented a new milestone in kidney cancer research and provided new tools for the investigation of kidney cancer and drug test.Kidney-specificFLCNandVHL-Trp53-Kif3atriple-gene knockout mice have been used for renal cancer drug test， which successfully led to expected results.

kidney cancer; kidney cancer genes; knockout mouse model; renal carcinoma therapeutics

陳金東，2000年于瑞典卡羅林斯卡醫(yī)科大學分子醫(yī)學系獲得博士學位，現(xiàn)為美國羅切斯特大學醫(yī)學中心腎癌研究室副教授和主任，美國癌癥研究協(xié)會(AACR)資深會員。2003年克隆了NORE1和LSAMP兩個腎癌相關基因，并在第94屆AACR大會上獲得Bristol-Myer Squibb獎。此后致力于腎癌敲基因小鼠模型的建立，現(xiàn)在已經(jīng)建立了多個腎癌小鼠模型，其中一個FLCN腎近曲小管特異性敲基因小鼠模型是世界上唯一能產(chǎn)生各類腎癌細胞的腎近曲小管敲基因小鼠模型，并再次在第100屆AACR大會上獲得Sanofi-Aventis獎。至今已發(fā)表論文90余篇。

R737.1

A

1000-2715(2017)04-0347-11

[收稿2017-06-12;修回2017-07-12]