周聯(lián)東　柳繼鳳　孫佩

摘要 以玉米品種沃玉964及其親本為試驗材料，進行了沃玉964玉米品種SSR指紋圖譜的構(gòu)建研究。結(jié)果表明，從72對玉米SSR引物中篩選出在沃玉964雙親間多態(tài)性好、重復性高的6對引物（分別為Phi090、umc2105、bnlg2305、umc1125、phi065和umc1506），可用于沃玉964的真實性檢測，同時可為鑒定種子純度提供參考。該方法準確可靠、實用性強，為生產(chǎn)上沃玉964真實性的快速、有效鑒定提供了科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞 玉米；沃玉964；SSR標記；指紋圖譜

中圖分類號 S513 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）15-0001-01

Abstract Taking Woyu 964 and its parents as test material，fingerprint construction of corn variety Woyu 964 was studied.The results showed that six pairs of primers（Phi090，umc2105，bnlg2305，umc1125，phi065 and umc1506） screening from 72 pairs of maize SSR primers could be applied in authenticity detection of Woyu 964，which presented polymorphism，stable and clear between the parents. The method with high accuracy and strong practicality was applicable for testing seed purity of Woyu 964 rapidly and efficiently.

Key words maize；Woyu 964；SSR marker；fingerprinting

玉米品種的真實性檢驗和純度鑒定對玉米種子質(zhì)量管理具有重要意義。SSR標記具有數(shù)量豐富、信息含量高、呈共顯性、檢驗程序簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于許多作物的DNA指紋圖譜構(gòu)建。近年來，前人在利用SSR分子標記技術(shù)構(gòu)建DNA指紋圖譜方面做了大量的研究工作。王鳳格等[1]利用10個SSR引物對420份已知玉米雜交種進行DNA指紋分析，確定bnlg161和bnlg1450為玉米雜交種純度鑒定的首選核心引物，5個引物bnlg439、bnlg125、umc2105、umcl705和bnlg1792為玉米雜交種純度鑒定的備選核心引物。趙 靜等[2]采用100對玉米SSR引物分析了陜西省23個主要玉米自交系的遺傳多態(tài)性，從中篩選出擴增帶型清晰、穩(wěn)定的30對引物作為構(gòu)建23個玉米自交系指紋圖譜的核心引物。邱紅波等[3]利用86對SSR引物分析了36份喀斯特高海拔山區(qū)玉米骨干自交系的多態(tài)性，從中確立了多態(tài)性、重復性均較好的34對核心引物。

蓋樹鵬等[4]分別利用74對SSR引物對35份骨干自交系和19份主栽雜交種進行了SSR分析，分別篩選出10對和20對適于玉米自交系和雜交種分析的核心引物。王文潔等[5]從50對SSR引物中篩選出雙親間多態(tài)性明顯、重復性較好的5對引物bmc1792、bmc1496、umc2105、bnlg2291和phi065，可用于鑒定玉米品種新科19的真實性，同時為鑒定該種子的純度提供參考。邸仕忠等[6]選用32對玉米SSR引物檢測重慶市部分常用及新選玉米自交系間的遺傳差異，從中篩選出10對引物作為構(gòu)建66個玉米自交系指紋圖譜的核心引物。

沃玉964是河北沃土種業(yè)股份有限公司選育的高產(chǎn)廣適多抗玉米品種，目前已通過河北、河南兩省審定、天津市引種認定和山西省引種備案。為了準確、高效地鑒定沃玉964，本研究對該品種及其親本進行了分子指紋圖譜構(gòu)建。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為沃玉964雜交種及其親本ND140和Z598，均由河北沃土種業(yè)股份有限公司提供。DNA聚合酶、dNTP購自寶生物工程（大連）有限公司。SSR分析中所用的72對引物序列由玉米基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.maizegdb.org/ssr.php）獲得，分布在玉米10條染色體上[7-8]，由上海英駿生物工程有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取。將沃玉964雜交種及其親本種子在25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)8 d左右，取黃化葉片混樣，置于液氮中冷凍、研磨，用CTAB法提取基因組DNA[7]。紫外分光光度計檢測DNA濃度和質(zhì)量，將DNA樣品濃度稀釋至20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 擴增體系及電泳分析。20 μL的反應體系包括2 μL 10×PCR Buffer、1 U Taq DNA 聚合酶、0.2 mmol/L dNTPs、0.25 μmol/L引物和20 ng模板DNA。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 變性40 s，60 ℃ 退火35 s，72 ℃延伸 45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR儀上進行。反應結(jié)束后置于4 ℃貯藏備用。反應產(chǎn)物變性后用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（75W， 1 h），銀染[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR多態(tài)性引物篩選

用分布在玉米10條染色體上的72對SSR標記引物，對沃玉964的2個親本DNA進行擴增，初步篩選到能夠擴增出條帶并在親本間有差異的10對引物。用這10對引物擴增沃玉964及其親本，通過多次重復和比較最終選擇出6對引物，可以用于構(gòu)建沃玉964的指紋圖譜（表1）。endprint

2.2 指紋圖譜構(gòu)建

在擴增條帶中，引物Phi090、umc2105、bnlg2305、umc1125、phi065、umc1506的指紋圖譜中（圖1）沃玉964及其親本均表現(xiàn)出較好的雜種共顯性圖譜特征，而且這些引物所擴增出的主帶大小集中在100～400 bp之間。

3 結(jié)論與討論

SSR分子標記技術(shù)在遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、自交系系譜研究、雜種優(yōu)勢類群劃分和DNA指紋圖譜構(gòu)建等方面的研究都有很好的應用價值[11-12]。本研究篩選出6對SSR引物對沃玉964雜交種和親本進行了SSR圖譜的構(gòu)建，這6對SSR引物重復性好，可為沃玉964真實性鑒定和純度檢驗提供參考。

4 參考文獻

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