趙 睿， 李 娟， 王 亮， 孔 銀， 丁 潔， 王娟霞， 李光明， 張嶺漪

(蘭州大學第二醫(yī)院 肝病科， 蘭州 730030)

鐵調(diào)素和IL-6在非酒精性脂肪性肝病大鼠模型肝臟炎癥進程中的表達水平及相關(guān)性分析

趙 睿， 李 娟， 王 亮， 孔 銀， 丁 潔， 王娟霞， 李光明， 張嶺漪

(蘭州大學第二醫(yī)院 肝病科， 蘭州 730030)

目的利用非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠模型觀察鐵調(diào)素(Hepc)、IL-6在肝臟炎癥進程中表達水平的變化。方法NAFLD肝組織標本均來自本課題組前期利用高脂乳劑灌胃法成功構(gòu)建的大鼠NAFLD模型(M組)及同期生理鹽水灌胃替代構(gòu)建的正常大鼠對照組(C組)。Hepc、IL-6單克隆抗體應(yīng)用免疫組織化學法分別檢測4、8、12周M組(M4、M8、M12)和12周C組大鼠肝組織中Hepc、IL-6的表達水平，同期評估各組肝脂肪炎癥程度積分。檢測2組大鼠肝組織Hepc和IL-6的表達水平，并計算肝組織NAS積分。多組間比較采用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較采用LSD-t相關(guān)法。相關(guān)性分析均采用Pearson相關(guān)法。結(jié)果隨試驗周期延長，Hepc和IL-6在M4組、M8組、M12組表達水平呈逐漸升高的趨勢，且與C12組相比差異均有統(tǒng)計學意義(Hepc：0.372±0.216、1.213±0.193、2.390±0.192 vs 0.166±0.192；IL-6：0.499±0.218、1.290±0.210、2.644±0.441 vs 0.240±0.109，P值均<0.05)；M組大鼠肝組織Hepc和IL-6表達呈正相關(guān)(r=0.944，P<0.05)；M組大鼠肝組織Hepc和IL-6表達水平均與NAS呈正相關(guān)(r值分別為0.927和0.907，P值均<0.001)。結(jié)論初步觀察到實驗性NAFLD炎癥進程可影響肝組織Hepc、IL-6表達且Hepc與肝組織炎癥損傷因子IL-6表達強度相關(guān)性明顯。Hepc和IL-6作為NAFLD疾病進展的預(yù)測因子值得進一步研究。

脂肪肝； 鐵調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)類； 白細胞介素6

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以肝細胞脂肪變性和肝脂毒性炎癥為特征的代謝應(yīng)激性肝損傷，鐵代謝紊亂被認為是其損傷機制之一[1]；鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子鐵調(diào)素(hepcidin, Hepc)是鐵代謝調(diào)節(jié)依賴的主要相關(guān)蛋白，在肝細胞中正常表達[2]；胰島素抵抗及氧化應(yīng)激不僅是NAFLD形成機制中重要的打擊因素，同時可刺激Hepc異常高表達，致肝組織中鐵異常沉積，后者反過來又促進NAFLD炎癥進展[3]，其中，細胞因子IL-6是介導Hepc表達上調(diào)的主要炎性信號因子[4]；但是，NAFLD炎癥進程與Hepc及IL-6相關(guān)性研究較少。因此，本研究旨在利用NAFLD大鼠模型初步探討Hepc、IL-6在實驗性NAFLD肝臟炎癥進程中表達強度的變化。

1 材料與方法

1.1 標本來源 本實驗所用NAFLD大鼠肝組織蠟塊標本源于本課題組前期應(yīng)用高脂乳劑灌胃法成功構(gòu)建的NAFLD模型組(M組)和同期應(yīng)用生理鹽水灌胃替代構(gòu)建的正常對照組(C組)大鼠[5]。

1.2 主要試劑 兔濃縮型單克隆抗體Hepcidin-25 (ab30760)一抗(Abcam公司)；兔濃縮型單克隆抗體IL-6 (ab83339)一抗(Abcam公司)；免疫組化二抗采用通用型試劑(ZSGB-BIO公司)。

1.3 分組 M組分別隨機選用4周(M4組)、8周(M8組)、12周(M12組)各10只NAFLD大鼠的肝組織蠟塊標本；C組(C12組)為10只正常對照組大鼠的肝組織蠟塊標本(本研究僅選取12周大鼠作為對照觀察)。

1.4 實驗方法

1.4.1 檢測NAFLD大鼠肝組織Hepc、IL-6的表達

標本常規(guī)脫蠟、水化、3%雙氧水、37 ℃孵育、PBS沖洗、正常山羊血清封閉、37 ℃孵育；根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選取Hepcidin-25一抗?jié)舛?∶100、單克隆抗體IL-6一抗?jié)舛?∶50；應(yīng)用免疫組化分別檢測M組(M4、M8、M12)和C組大鼠肝組織(各10張2～5 μm切片)Hepc、IL-6表達結(jié)果，采用免疫組化積分計量觀察方法:(1)每張切片在400倍顯微鏡下隨機采集10個視野(避開邊緣效應(yīng))，每個觀察視野包含一個匯管區(qū)或一個中央靜脈并選擇細胞表達最密的地方觀察，計算Hepc、IL-6的陽性細胞數(shù)百分比，以百分數(shù)表示；(2)同時觀察陽性著色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(3)相乘計算綜合積分，采用計算公式：(+)%×1 +(++)%×2+(+++)%×3，總數(shù)值<1.0者為(+)，1.0～1.5者為(++)， >1.5者為(+++)，隨機觀察5個高倍視野[6]。

1.4.2 NAFLD大鼠肝組織炎癥程度積分 依據(jù)《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[7]中NAFLD炎癥程度積分(NAFLD activity score，NAS)標準，對肝組織病理切片在高倍鏡下進行觀察。(1)肝細胞脂肪變NAS0～8分；(2)小葉內(nèi)炎癥NAS(高倍鏡下壞死灶數(shù))，0分(無)，1分(<2個)，2分(2～4個)，3分(>3個)；(3)肝細胞氣球樣變：0分(無)，1分(少見)，2分(多見)；NAS<3分可診斷細胞脂肪變性，NAS>4分診斷非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

2 結(jié)果

2.1 NAFLD大鼠肝組織Hepc、IL-6表達水平的變化 與C組相比，M組Hepc和IL-6表達均隨著時間的延長明顯高表達，且炎癥表現(xiàn)也越來越強(圖1)。Hepc在M4組、M8組、M12組表達水平呈逐漸升高的趨勢，且與C12組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，M8組、M12組與M4比較，M12組與M8組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；IL-6在M4組、M8組、M12組表達水平呈逐漸升高的趨勢，且與C12組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，M12組與M4組、M8組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表1)。

2.2 NAFLD大鼠肝組織Hepc和IL-6的相關(guān)性 對M組(M4、M8、M12)肝組織Hepc與IL-6進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示Hepc與IL-6呈正相關(guān)(r=0.944，P<0.05)(圖2)。

2.3 NAFLD大鼠NAS HE染色觀察到M4組肝細胞索以肝小葉中央靜脈為中心，呈放射狀排列，匯管區(qū)未見炎性細胞浸潤及纖維組織增生，肝細胞可見少量脂肪空泡形成；M8組肝細胞大部分脂肪變性，細胞增大，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不一、數(shù)量不等的脂肪空泡，細胞核被推向周邊，匯管區(qū)部分炎癥細胞浸潤；M12肝腺泡3區(qū)大泡性或以大泡為主的混合性肝細胞脂肪變，伴有肝細胞氣球樣變、小葉內(nèi)炎癥細胞，但未見竇周纖維化；C12組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無脂肪空泡形成(圖3)。各組NAS積分見表2，M4組NAS主要集中在2分，M8組NAS主要集中在4和5分，M12組NAS主要集中在6分，而C12組NAS主要集中在0分。

圖1 NAFLD大鼠肝組織M組和C組Hepc、IL-6表達水平變化(免疫組化，×400) a、c、e、g：Hepc-C12、M4、M8、M12；b、d、f、h：IL-16-C12、M4、M8、M12

注：與C12組比較，1)P<0.05；與M4組比較，2)P<0.05；與M8組比較，3)P<0.05

圖2 NAFLD大鼠M組肝組織Hepc與IL-6綜合計量積分的相關(guān)性

圖3 NAFLD大鼠M組和C組大鼠肝組織形態(tài)變化(HE染色，×400) a: M4；b:M8；c:M12; d: C12，細紅色箭頭表示炎癥細胞浸潤的部分， 炎癥細胞被染成藍色并聚集；粗紅色箭頭表示肝細胞氣球樣變：細胞極度水腫，胞核腫脹，被推向周邊

2.4 NAFLD大鼠肝組織Hepc、IL-6表達水平與NAS積分的相關(guān)性 NAFLD大鼠肝組織Hepc、IL-6表達水平與NAFLD肝組織NAS積分均呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.927、0.907，P值均<0.001)(圖4)。

圖4 Hepc、IL-6綜合計量積分與NAS積分的相關(guān)性

3 討論

NAFLD是一組多病理狀態(tài)的慢性炎癥性肝病，從肝脂肪變性到更具進展性的疾病狀態(tài)包括NASH和肝硬化，許多患者可能最終進展至肝衰竭和肝細胞癌[8-9]。肝臟是體內(nèi)鐵代謝的重要器官，肝細胞分泌鐵代謝調(diào)節(jié)依賴相關(guān)蛋白，其中Hepc的正常表達是維持機體鐵穩(wěn)態(tài)最主要的物質(zhì)。NAFLD和鐵代謝之間的關(guān)系仍然存在爭議。盡管近期有研究[10]表明肥胖、NAFLD/NASH引發(fā)的肝臟慢性低水平炎癥狀態(tài)可致肝細胞內(nèi)鐵穩(wěn)定受到破壞，反過來又增加了肝臟Hepc的產(chǎn)生。然而，迄今為止尚無更多的研究證實NAFLD炎癥進程中Hepc及IL-6表達的變化。

NAFLD所產(chǎn)生的一系列病理狀態(tài)勢必會引起體內(nèi)相關(guān)炎癥細胞因子的表達發(fā)生一定的顯著變化，其中IL-6就是這一病理過程中重要的致炎因子之一。IL-6是由單核細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、脂肪細胞等產(chǎn)生，可能在NAFLD 疾病的發(fā)生與發(fā)展中起到一定的作用，同時又可介導巨噬細胞浸潤。IL-6炎癥因子水平的升高是 NAFLD 患者普遍存在的一個現(xiàn)象，并對NAFLD的病情進展起到正反饋的效應(yīng)，即隨著脂肪肝程度的逐漸加重IL-6的表達水平也逐漸增加[11]，這一點在本研究結(jié)果中也得到了進一步證實,同期觀察到IL-6隨著脂肪變性及炎癥程度的進展而逐漸加深，與疾病的進程呈正相關(guān)。Hepc被認為是一種介導與感染和炎癥相關(guān)的急性期蛋白，Ganz等[12]闡述了IL-6是Hepc在肝臟表達的信號通路中的關(guān)鍵誘導因子，IL-6可以通過與其相應(yīng)的受體結(jié)合并通過一定的細胞因子信號轉(zhuǎn)導通路影響Hepc的表達。進一步研究[13]顯示，IL-6可能是通過BMP/SMD信號通路的參與或STAT3通路來刺激Hepc轉(zhuǎn)錄。盡管本實驗在大鼠NAFLD模型中初步觀察到實驗性NAFLD炎癥進程可影響肝組織Hepc，IL-6表達上調(diào)且Hepc與肝組織炎癥損傷因子IL-6表達強度相關(guān)性明顯，但在NAFLD肝臟炎癥中Hepc與IL-6之間相互作用的關(guān)系還需進一步探討。

綜上所述，NAFLD病情進展與肝臟炎癥程度息息相關(guān)，但目前仍缺乏判斷NAFLD炎癥程度可靠的血清生物學指標，血清Hepc、IL-6是否可做為NAFLD疾病進展的預(yù)測因子值得進一步研究。

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引證本文：ZHAO R, LI J, WANG L, et al. Expression of hepcidin and interleukin-6 and their correlation in liver inflammation process in a rat model of nonalcoholic fatty liver disease[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(9): 1774-1777. (in Chinese) 趙睿， 李娟， 王亮， 等. 鐵調(diào)素和IL-6在非酒精性脂肪性肝病大鼠模型肝臟炎癥進程中的表達水平及相關(guān)性分析[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(9): 1774-1777.

(本文編輯：王 瑩)

Expressionofhepcidinandinterleukin-6andtheircorrelationinliverinflammationprocessinaratmodelofnonalcoholicfattyliverdisease

ZHAORui,LIJuan,WANGLiang,etal.

(DepartmentofHepatology,LanzhouUniversitySecondHospital,Lanzhou730030,China)

ObjectiveTo investigate the changes in the expression of hepcidin (Hepc) and interleukin-6 (IL-6) in liver inflammation process in a rat model of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD).MethodsThe rats were given high-fat emulsion by gavage to establish the model of NAFLD (group M) and normal rats were given normal saline by gavage as controls (group C). Liver tissue samples were collected from these rats, and immunohistochemistry was used to measure the expression of Hepc and IL-6 in liver tissue in group M at 4, 8, and 12 weeks (M4, M8, and M12groups) and in group C at 12 weeks (C12group). The NAFLD activity score (NAS) was assessed for both groups. The expression of Hepc and IL-6 in liver tissue was measured, and NAS was calculated. A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant differencet-test was used for comparison between two groups. Pearson correlation analysis was also performed.ResultsOver the course of treatment, the M4, M8, and M12groups had gradual increases in the expression of Hepc and IL-6, and there were significant differences between these groups and the C12group (Hepc: 0.372±0.216/1.213±0.193/2.390±0.192 vs 0.166±0.192, allP<0.05; IL-6: 0.499±0.218/1.290±0.210/2.644±0.441 vs 0.240±0.109, allP<0.05). In group M, the expression of Hepc was positively correlated with that of IL-6 (r=0.944,P<0.05), and the expression Hepc and IL-6 was positively correlated with NAS (r=0.927 and 0.907, bothP<0.001).ConclusionBased on the results of this preliminary study, liver inflammation process in NAFLD can upregulate the expression of Hepc and IL-6 in liver tissue, and Hepc is significantly correlated with the inflammatory factor IL-6. Further studies are needed to investigate the roles of Hepc and IL-6 in predicting the progression of NAFLD.Keywords：fater liver; iron-regulatory proteins; interleukin-6

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.09.030

2017-06-10；

：2017-07-10。

2014年甘肅省自然科學基金項目(145RJZA147)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(223000-861240)

趙睿(1980-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事非酒精性脂肪性肝病的研究。

張嶺漪，電子信箱: zhanglymd@126.com。

R575.5

：A

：1001-5256(2017)09-1774-04