楊蓉，楊文琦，張崢，詹發(fā)強，侯敏，侯新強， 包慧芳，王寧，龍宣杞

(1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046)

2株番茄早疫病拮抗菌的分離篩選與拮抗作用研究

楊蓉1，楊文琦1，張崢2，詹發(fā)強1，侯敏1，侯新強1， 包慧芳1，王寧1，龍宣杞1

(1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046)

【目的】從新疆昌吉、焉耆、喀什、烏蘇、吉木薩爾五地多年種植番茄的農(nóng)田土壤樣品，進行拮抗菌的篩選，選取對番茄早疫病菌(Alternariasolani)有具有較強抑菌活性的菌株?！痉椒ā坎捎闷桨宸蛛x培養(yǎng)法從加工番茄的根際土壤中分離拮抗菌，平板對峙培養(yǎng)實驗進行初篩和復(fù)篩，根據(jù)培養(yǎng)特征、菌體形態(tài)及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析進行初步鑒定，顯微觀察法觀察拮抗菌對病原菌菌絲生長的拮抗作用，盆栽法測定相對防效?！窘Y(jié)果】共分離得到90株細菌菌株，初篩得到對番茄早疫病菌有明顯拮抗作用的細菌，復(fù)篩選取2株抑制作用顯著的細菌(J2-2、J2-4)，并初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)的萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的近似種；顯微鏡下觀察到2株拮抗菌的發(fā)酵液對番茄早疫病菌絲有明顯的致畸作用；在盆栽試驗中，拮抗菌發(fā)酵液對番茄早疫病菌的相對防效可達到35%以上?！窘Y(jié)論】篩選到的2株拮抗菌對番茄早疫病菌表現(xiàn)出較好的拮抗作用，對番茄早期病害的生物防治具有一定的應(yīng)用價值。

番茄早疫??；分離；篩選；鑒定

0 引 言

【研究意義】番茄種植過程中常見的真菌性病害番茄早疫病、晚疫病、番茄灰霉病、葉霉病、番茄枯萎病等，其中番茄早疫病[Alternariasolani(Ellis et Martin)Jones et Grout .](也稱為輪紋病)，較為常見，在番茄的苗期和成株期發(fā)病，危害較大，嚴重影響到番茄光合產(chǎn)物的積累以及果實的形成，給人們的生產(chǎn)和健康造成危害。番茄早疫病的防治措施一般以化學(xué)農(nóng)藥為主，對土壤生態(tài)結(jié)構(gòu)造成破壞，存在環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留問題，而生物防治具有無毒、高效、成本低等優(yōu)點，成為防治番茄早疫病的新途徑和研究熱點。研究從根際土壤中篩選拮抗菌，為番茄早疫病的生物防治提供材料，以期減少農(nóng)藥的使用量，提高番茄品質(zhì)?！厩叭搜芯窟M展】番茄早疫病的病原菌為茄鏈格孢菌[A.solani( Ell Martin). sorauer]，屬半知菌亞門鏈格孢屬真菌，能引起多種作物病害，如馬鈴薯早疫病、甘藍黑斑病、蘋果斑點落葉病、梨黑斑病、梨黑斑病煙草赤星病等。有關(guān)采用拮抗菌來進行各種植物病害的生物防治比較常見，王杏芹[1]等針對甜瓜細菌性斑點病和甜瓜角斑病篩選到對有明顯拮抗作用的拮抗菌；劉淑芳[2]等篩選到兩株的拮抗菌表現(xiàn)出較好的對蘋果炭疽病原菌的拮抗作用；李偉杰等[3]分離篩選得到的拮抗細菌對番茄青枯病有拮抗作用；張洪濤等[4]篩選出高抗棉花黃萎病的細菌。研究表明，利用拮抗菌進行植物病害的生物防治的機理主要是通過競爭、拮抗，交叉保護、寄生或捕食和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等途徑[5]。不同的微生物對病原菌的拮抗機制有所不同，即使是同一種微生物，其作用機制也可能同時有很多種。如芽孢桿菌就有競爭位點、拮抗病原菌和誘導(dǎo)植物抗性等抑菌機制[6]，同時有些微生物還能夠促進植物生長或者提高營養(yǎng)利用率?！颈狙芯壳腥朦c】新疆土壤類型多樣，光熱資源豐富，是世界上適宜種植番茄的地區(qū)之一。因此，利用資源優(yōu)勢，新疆番茄加工業(yè)迅速發(fā)展，加工番茄種植面積逐年擴大，成為中國番茄加工業(yè)主要的生產(chǎn)地區(qū)，總產(chǎn)量占到世界產(chǎn)量的9.6%，番茄醬也成為新疆重要的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品[7]，中國成為僅次于美國、意大利的世界上第三個番茄醬生產(chǎn)及出口大國[8]。但隨著加工番茄連年種植，多種土傳性病害對作物的危害日益加重[9]，其中番茄早疫病引起落花、落葉、落果和斷枝，對加工番茄的產(chǎn)量影響很大，嚴重時甚至減產(chǎn)50%以上[10]，而且病果內(nèi)含有的毒素能夠?qū)е氯嘶佳翰?，危及健康[11]。研究篩選對番茄早疫病菌具有較強抑菌特性菌株?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究對采自新疆昌吉、焉耆、喀什、烏蘇、吉木薩爾五個地方多年種植番茄的農(nóng)田土壤樣品，進行拮抗菌的篩選，選取具有較強抑菌活性的菌株，并采用形態(tài)特征及16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析方法對篩選得到的菌株進行初步鑒定；分析拮抗菌發(fā)酵液對番茄早疫病菌的拮抗作用，為進一步的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)，為番茄早疫病的生物防治提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病原菌

由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心(ACCC)提供的番茄早疫病菌(Alternariasolani)。

1.1.2 采集根際土樣

2016年6月，在昌吉、焉耆、喀什、烏蘇、吉木薩爾的加工番茄種植地中(C、J、Y、W、K分別代表昌吉、吉木薩爾、焉耆、烏蘇、喀什土樣)，采集幼苗根系和根際土，牛皮紙袋保存后，帶回試驗室，用無菌剪刀剪取番茄幼苗根部，放入盛有100 mL無菌水的500 mL三角瓶中，室溫下以180 r/min的轉(zhuǎn)速震蕩30 min，制成均勻的土壤懸液。

1.1.3 篩選培養(yǎng)基[12]

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)，細菌培養(yǎng)基(LB)；

1.1.4 儀器與試劑

MSSPX-250型培養(yǎng)箱， SW-CJ-1F B型雙人單面凈化工作臺，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，E360K離心機，HWY-100恒溫振蕩培養(yǎng)儀。Bio-Rad Mode 200/2.0型電泳儀，Eppendorf No:5345型PCR儀，United-Bio型凝膠成像儀，TaKaRa Biotechnology 的PCR預(yù)混液，其余試劑選用分析純試劑。

1.2 方 法

1.2.1 拮抗菌的分離和篩選

1.2.1.1 梯度稀釋分離法

先采用梯度稀釋分離法獲得根際土壤懸液的稀釋液：將番茄根際土樣10 g放入90 mL滅菌水的三角瓶中，振蕩20 min 后靜置20～30 s，即為10-1稀釋液，然后通過梯度法分別稀釋成10-2到10-6的稀釋液。再采用平板涂布法進行分離培養(yǎng)：各取0.1 mL 的稀釋液(10-3、10-4、10-5、10-6)分別涂布于PDA 和LB培養(yǎng)基上，分別于32和37℃培養(yǎng)，待培養(yǎng)基上長出分離物，對長出的菌落分離純化進行劃線，最后劃線斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 平板對峙法[13]篩選拮抗菌

采用平板對峙法進行篩選：番茄早疫病菌經(jīng)PDA培養(yǎng)基斜面活化后備用。將分離出的拮抗菌株用LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)后，制成菌懸液，于PDA培養(yǎng)基周圍4點接種4 μL，32℃下繼續(xù)培養(yǎng)1 d，待四周菌落長至1 cm左右，在平板蓋上加入三氯甲烷1 mL，將平板放置4℃冰箱過夜。次日取出平板，用打孔器制備番茄早疫病菌的菌餅，置于上述的PDA培養(yǎng)基平板中央，并撤換平板蓋。放入28℃培養(yǎng)5 d。根據(jù)有無抑菌圈及抑菌帶的大小，判斷其拮抗效果，初選得到拮抗菌株，并對其進行二次對峙實驗，從中篩選出拮抗能力較強的菌株以備后續(xù)實驗。

1.2.2 拮抗菌的形態(tài)學(xué)觀察

將菌株在LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2 d，進行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌落形狀、顏色、透明度、邊緣形狀、生長培養(yǎng)形狀等特征。

1.2.2.2 鏡檢

準備干凈的載玻片，滴一滴無菌水，將平板上的單菌落挑少量涂在載玻片上，使其完全涂開，然后從火焰上干燥固定，用結(jié)晶紫染液染1 min，水洗2～3次，晾干。顯微鏡油鏡下觀察菌體的形態(tài)、是否有芽孢。

1.2.3 優(yōu)勢PGPR菌的16S rDNA序列擴增與分析

選擇LB平板上培養(yǎng)2 d的少量單菌落，挑入盛有25 μL無菌水的離心管中，100℃下8～10 min，迅速置冰浴中5 min，10 000 r/min離心處理5 min，4℃保存，上清液備用[14]。

根據(jù)細菌的16S rDNA序列設(shè)計PCR擴增引物，正向引物為：5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3'；反向引物為：5'-CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3'。

PCR擴增反應(yīng)體系為50 μL，組分如下：24 μL premix Taq，引物各1 μL，模板 2 μL，無菌水 22 μL。擴增條件為：94℃ 4min；94℃ 30 s，55℃ 90 s，72℃ 30 s，循環(huán)為30個；72℃ 7 min。得到的PCR擴增產(chǎn)物(約 1 500 bp)經(jīng)瓊脂糖凝膠(1%)電泳分離，然后直接進行雙向測序，測序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

將測序得到的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進行BLAST 分析，獲取相近的16S rDNA序列，采用ClustalX軟件和 MEGA 4.1 中的Neighbor-joining 法來構(gòu)建拮抗菌的系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 拮抗菌發(fā)酵液對番茄早疫病菌的抑制作用[15]

1.2.4.1 對病菌菌絲抑制作用的顯微觀察

將番茄早疫病菌點接在PDA平板中央，培養(yǎng)2 d，在平皿四周等距離(2.5 cm)處放置含有拮抗菌株發(fā)酵液的濾紙片，28℃恒溫培養(yǎng)6 d，鑷取早疫病菌菌落邊緣的菌絲于在載玻片上，在顯微鏡下觀察其菌絲的形態(tài)變化并拍照。

1.2.4.2 盆栽試驗測定防效

綜上所述，高齡STEMI患者常合并糖尿病、高血壓、血脂異常等危險因素，易發(fā)生無痛性的心肌梗死；冠狀動脈以側(cè)支建立、多支病變、顯著鈣化、重度狹窄、復(fù)雜病變及彌漫病變?yōu)橹鳌?/p>

對于經(jīng)過初篩和復(fù)篩得到的1-2株高效的拮抗菌，采用盆栽試驗法測定其拮抗菌株發(fā)酵液對番茄早疫病的防治作用。在裝土的營養(yǎng)缽中播種加工番茄種子(市售)，當(dāng)幼苗長至 4～5片真葉時，取生長一致的植株，用無菌剪刀損傷幼苗根部，然后放入早疫病菌懸液中30 min，移栽到盆中，再灌根加入 20 mL 供試拮抗菌的發(fā)酵液。每個處理設(shè)10個重復(fù)，空白對照為清水灌根處理。在 25℃下保濕培養(yǎng) 48 h 后，觀察發(fā)病情況，7 d 后調(diào)查發(fā)病率和病情，計算病情指數(shù)和相對防效。

病情調(diào)查中采用十字測量法測量每個病斑直徑，以病斑大小作為病害分級標準。病害分級標準如下：

0 級：葉片上無病斑；

1 級：病斑面積占葉片的 1/4 以下；

2 級：病斑面積占葉片的 1/4-1/2；

3 級：病斑面積占葉片的 1/2-3/4，近一半小葉枯死；

4 級：病斑面積占葉片的 3/4 以上，一半以上或全部小葉枯死；

相對防效(%)=[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)] ×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離

經(jīng)平皿培養(yǎng)，得到可分離細菌。根據(jù)菌株的分離來源對菌株進行編號，從中得到細菌90株：C1-1、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C2-1、C2-2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、J1-1、J1-2、J1-3、J1-4、J1-5、J1-6、J1-7、J1-8、J2-1、J2-2、J2-3、J2-4、J2-5、J2-6、J2-7、J2-8、Y1-1、Y1-2、Y1-3、Y1-4、Y1-5、Y1-6、Y1-7、Y1-8、Y2-1、Y2-2、Y2-3、Y2-4、Y2-5、Y2-6、Y2-7、Y2-8、Y3-1、Y3-2、Y3-3、Y3-4、Y3-5、Y3-6、Y3-7、Y3-8、W1-1、W1-2、W1-3、W1-4、W1-5、W1-6、W1-7、W1-8、W2-1、W2-2、W2-3、W2-4、W2-5、W2-6、W2-7、W2-8、K1-1、K1-2、K1-3、K1-4、K1-5、K1-6、K1-7、K1-8、K2-1、K2-2、K2-3、K2-4、K2-5、K2-6、K2-7、K2-8。

2.2 拮抗細菌篩選

2.2.1 拮抗細菌初篩

從番茄根際土樣中共分離出90株細菌，采用平板對峙法，根據(jù)有無抑菌圈判斷其是否具有拮抗作用，初步篩選出對番茄早疫病菌具有一定拮抗能力的菌株。圖1

圖1 平板對峙試驗初篩

Fig.1 Paired culture for preliminary screening

2.2.2 拮抗細菌復(fù)篩

對具有拮抗作用的菌株進行二次對峙實驗，篩選出拮抗能力較強的菌株以備后續(xù)實驗。復(fù)篩選取2株具有良好拮抗番茄早疫病菌作用的細菌分離物，分別為J2-2和J2-4，培養(yǎng)5d其能夠明顯地抑制番茄早疫病菌菌絲的生長，經(jīng)多次實驗驗證兩株菌的抑菌效果較為穩(wěn)定。圖2

2.3 菌落形態(tài)特征

復(fù)篩得到的拮抗菌菌株的菌落形態(tài)特征。表1，圖3

圖2 平板對峙試驗復(fù)篩

Fig.2 Paired culture for second screening

表1 拮抗菌的培養(yǎng)特征及細胞形態(tài)

Table 1 Morphology of the colony and cell of antagonistic bacteria

菌株菌落特性及細胞形態(tài)J2-2菌落中小型，呈不規(guī)則圓形，邊緣不整齊，折皺，表面干燥不光滑，白色菌落，菌落直徑1-3mm，菌體桿狀，大量芽孢，芽孢中生。J2-4菌體中小型，圓形，邊緣矯正器，有環(huán)狀凸起，中間凹陷，表面平滑，乳白色，菌落直徑0 5～3mm，菌體桿狀，有芽孢，芽孢中生。

圖3 顯微鏡下的菌體形態(tài)

Fig.3Morphologyofbacteriacellundermicroscope

2.4 PCR擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株J2-2和J2-4 16S rDNA PCR研究表明，擴增條帶片段大小約為1 600 bp，與預(yù)計大小相當(dāng)，擴增的樣品整齊度較高，目標條帶清晰，無雜帶。

對所篩選的菌株J2-2和J2-4進行16s rDNA基因序列分析，結(jié)果顯示同屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)在EZbiocloud中進行檢索，利用MEGA5.0軟件對菌株16S rDNA序列跟同源性較高的幾株菌株的核酸序列進行Neighbor-joining法構(gòu)建進化樹(圖5)。結(jié)果表明，J2-2和J2-4菌株與芽孢桿菌屬(Bacillus)的序列同源性達到99.9%。因此，將J2-2和J2-4初步鑒定為萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。圖4

2.5拮抗菌發(fā)酵液對番茄早疫病菌的抑制作用[15]

從拮抗細菌與早疫病病菌對峙的平板中抑菌圈邊緣挑取病菌菌絲，觀察發(fā)現(xiàn)挑出的菌絲，發(fā)現(xiàn)其在形態(tài)上發(fā)生了明顯的變化，菌絲多處都出現(xiàn)了溢縮，破裂的現(xiàn)象，有的部位還發(fā)生了畸變。扭曲變形、變粗、菌絲嚴重交聯(lián)并產(chǎn)生卵形或近圓形的厚垣飽子等現(xiàn)象，說明拮抗菌發(fā)酵液中具有抗菌活性成分，對病菌的菌絲有致畸作用。對照組沒有變化。圖6

通過盆栽試驗，測定出拮抗菌發(fā)酵液對病情的相對防效達到35%以上。表2，圖7

圖4 菌落16s rDNA PCR 結(jié)果(1：J2-2，2：J2-4)

Fig.4 The result of 16S rDNA PCR of colony(1: J2-2, 2: J2-4)

圖5 J2-2和J2-4 16SrDNA基因序列進化樹

Fig.5 16SrDNAcladogramofJ2-2andJ2-4

圖6 拮抗菌發(fā)酵液對番茄早疫病菌菌絲的影響

Fig.6 The effect of fermentation broth of antagonistic bacteria on A. solani mycelium

表2 拮抗菌發(fā)酵液對番茄早疫病的防效作用(盆栽試驗)

Table 2 The control effect of fermentation broth of antagonistic bacteria on A. solani(pot incubation test)

處理Treated病情指數(shù)Diseaseindexes防治效果/%EfficacyJ2-25 17235 4J2-44 82839 65

圖7 盆栽試驗

Fig.7 Pot incubation test

3 討 論

3.1 在我國的新疆、寧夏和內(nèi)蒙古等加工番茄主產(chǎn)區(qū)，加工番茄早疫病普遍發(fā)生，該病在番茄上的發(fā)病率達到30%，嚴重時可以達到50%以上，造成很嚴重的經(jīng)濟損失[10]。而且病果內(nèi)含有的毒素能夠?qū)е氯嘶佳翰?，危及健康[11]。番茄早疫病的危害十分嚴重，迫切需要高效和安全的防治措施，特別是生物防治措施，如利用拮抗菌來進行防治。

3.2 拮抗菌中芽孢桿菌在植物病害生物防治方面的應(yīng)用十分廣泛，因產(chǎn)生內(nèi)生芽孢[16]，易于繁殖，與別的拮抗菌相比，芽孢桿菌抗逆性強，在土壤中的定殖能力強，適應(yīng)環(huán)境能力強，對于拮抗菌制劑的實際生產(chǎn)有重要意義，具有很大的開發(fā)利用價值。馬平[17]等分離得到的枯草芽孢桿菌NCD-2，在溫室和田間中對番茄早疫病的防治效果顯著，田間防效達70%以上。研究對從新疆不同區(qū)域的土樣中分離90株細菌，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，得到2株拮抗能力強的菌株，經(jīng)過初步鑒定為萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，在盆栽試驗中，對番茄早疫病其發(fā)酵液表現(xiàn)出了較好的防效，其價值期待進一步深入研究。研究從本地生境中分離得到的拮抗菌，適應(yīng)本地的生長環(huán)境及氣候特點，對于防治本地的番茄早期病害、提高作物產(chǎn)量、同時減少農(nóng)藥使用量以及構(gòu)建良好的生態(tài)環(huán)境具有積極的作用。

3.3 研究中的芽孢桿菌發(fā)酵液對于番茄早疫病的抑菌效果較好，但模擬對峙實驗只針對植物體外，拮抗菌在自然環(huán)境下的拮抗能力能否持續(xù)？能否在土壤中定植？尚需要開展進一步的應(yīng)用研究。

4 結(jié) 論

4.1 實驗中分離得到對番茄早疫病的拮抗作用的細菌90株，經(jīng)過復(fù)篩，獲得拮抗能力較高的菌株2株，初步鑒定為萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

4.2 對拮抗菌發(fā)酵液的抑菌作用進行了觀察和測定。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，拮抗菌和病原菌在平板上共培養(yǎng)時，病菌的菌絲從形態(tài)上發(fā)生了明顯的變化，菌絲多處都出現(xiàn)了溢縮，破裂的現(xiàn)象，有的部位還發(fā)生了畸變，如變粗、扭曲變形、菌絲嚴重交聯(lián)并產(chǎn)生卵形或近圓形的厚垣孢子等現(xiàn)象，說明拮抗菌發(fā)酵液中具有抗菌活性成分，對病菌的菌絲有致畸作用。盆栽試驗表明，對于早疫病菌脅迫下的番茄幼苗，拮抗菌發(fā)酵液的相對防效達到35%以上。

4.3 拮抗菌發(fā)酵液在盆栽試驗防治效果比較好，但其在田間生產(chǎn)中的實際表現(xiàn)還需要做進一步的驗證試驗和應(yīng)用研究。

References)

[1] 王杏芹，史應(yīng)武，劉文玉,等.甜瓜細菌性斑點病拮抗菌的分離與篩選[J] .新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,(1) ：4-6.

WANGXing-qin，SHIYing-wu，LIUWen-yu,etal．(2008).IsolationandScreeningofBiocontrolStrainsofMuskmelonBacterialSpotDisease[J]. Xinjiang Agricultural Sciences， (1) ：4-6.

[2] 劉淑芳，檀根甲，李娜,等.蘋果采后炭疽病高效拮抗菌的篩選與應(yīng)用[J] .安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，34(1)：111-116.

LIUShu-fang，TANGen-jia，LINa，etal. (2007).Screeninghigh-efficientbiocontrolbacteriumofBacillussubtilisbyionimplantationanditsapplicationagainstpostharvestanthracnoseonapplefruit[J]. Journal of Anhui Agricultural University，34(1):111-116.

[3] 李偉杰，姜瑞波.番茄青枯病拮抗菌X10 的鑒定和田間應(yīng)用[J] .中國土壤與肥料，2007,(5)：60-63.

LIWei-jie，JIANGRui-bo. (2007).IdentificationandfieldapplicationofantagonisticstrainX10againsttomatobacterialwilt[J]. Soil and Fertilizer Sciences in China， (5)：60-63.

[4] 張洪濤，于頻頻.(2007). 棉花黃萎病高效拮抗菌XJUL-6 的篩選鑒定及其特性研究[J].微生物學(xué)報，2007,(6) ：7-9.

ZHANGHong-tao，YUPin-pineta1.CharacteristicsandidentificationofanAntagonisticXJUL-6AgainstCottonVerticilliumWilt[J]. ActaMicrobiologicaSinica， (6) ：7-9.

[5]JohnM.Whipps. (2001).Microbialinteractionsandbiocontrolintherhizosphere[J]. Journal of Experimental Botany， 52(3)：487-511.

[6] 林福呈，李德葆.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)S9 對植物病原真菌的溶菌作用[J] .植物病理學(xué)報，2003，33(2)：174-17.

LINFu-cheng;LIDe-bao. (2003).Cell-lyticeffectofBacillussubtilisonplantfungalpathogens[J]. ActaPhytopathologicaSinica，33(2)：174-17.

[7]張君玲. 新疆番茄出口加工業(yè)現(xiàn)狀問題及戰(zhàn)略對策現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)[J]. 設(shè)施農(nóng),2010，(12): 87-88.

ZHANGJun-ling. (2010).Xinjiangtomatoexportprocessingindustrystatusandthestrategiccountermeasuresforthemodernbusinessindustry. Facility agriculture, (12): 87-88.

[8]龐勝群，王禎麗，張潤,等. 新疆加工番茄產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J]. 中國蔬菜,2005,(2): 39-41.

PANGSheng-qun，WANGZhen-Li，ZHANGRun，etal. (2005).Processingtomatoindustrypresentsituationanddevelopmentprospectinxinjiang[J]. China Vegetables， (2): 39-41.

[9]崔元玗，楊華，孫曉軍,等. 新疆加工番茄主要病害發(fā)生[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2004， 41(3): 160-163.

CUIYuan-yu，YANGHua，SUNXiao-jun，etal．(2004).OccurrenceandDamageofImportantDiseasesofProcessingTomatoinXinjiang[J]. Xinjiang Agricultural Sciences, 41(3): 160-163.

[10] 董金皋，李樹正主編.植物病原菌毒素研究進展(第一卷).北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社,1997:222-226.

DONGJin- ，LIShu-zheng. (1997).AdvancesofresearchonthePlantPathogenicToxin.Beijing.ScienceandtechnologyofChinapress:222-226.

[11] 朱宗源，黃曉敏，呂云華.上海郊區(qū)番茄品種的抗早疫病性鑒定.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報,1987，3(1)：31-43.

ZHUZong-yuan，HUANGXiao-min，LUYun-hua. (1987).Evaluationoffiftytomatovarietiesinshanghaisuburbsforresistancetoearlyblightdisease. ActaAgriculturae Shanghai, 3(1):31-43.

[12]沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實驗(第三版)[D]. 高等教育出版社.

SHENPing，F(xiàn)ANXiu-rong，LIGuang-wu. Microbiology experiment (the third edition) [D].HigherEducationPress.

[13]張璐，丁延芹，杜秉海,等. 黃瓜枯萎病病原拮抗細菌DS-1菌株鑒定及其生防效果研究[J]. 園藝學(xué)報,2010， 37 (4): 575-580.

ZHANGLu，DINGYan-qin，DUBing-hai，etal．(2010).IdentificationandBiocontrolEffectsofAntagonisticBacteriumDS-1StrainAgainstFusariumoxysporumf.sp.cucumerinum[J]. ActaHorticulturaeSinica, 37 (4): 575-580.

[14]李國媛. 秸稈腐熟菌劑的細菌種群分析及其腐熟過程的動態(tài)研究[C].北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2007.

LIGuo-yuan. (2007). Study on Baeteria Communities of straw-decomposing inoculant and the dynamic change in the pcocess of fermentation[C].BEIJING:ChineseAcademyofAgriculturalSciences.

[15]汪茜，胡春錦，柯仿鋼,等. 生防菌株1404的鑒定及其對采后柑橘炭疽病的防治效果[J]. 微生物學(xué)報, 2010， 50 (9): 1 208-1 217.

WANGQian，HUChun-Jin，KEFang-gang，etal.(2010).Characterizationofabacterialbiocontrolstrain1404anditsefficacyincontrollingpostharvestcitrusanthracnose[J]. ActaMicrobiologicaSinica, 50 (9): 1,208-1,217.

[16] 權(quán)春善，王軍華，徐洪濤，等. 一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其發(fā)酵條件的初步研究[J]. 微生物學(xué)報， 2006， 46(1):7-12.

QUANChun-shan，WANGJun-hua，XUHong-tao，etal. (2006).IdentificationandcharacterizationofaBacillusamyloliquefacienswithhighantifungalactivity[J]. ActaMicrobiologicaSinica, 46(1):7-12.

[17] 李社增，鹿秀云，馬平，等. 防治棉花黃萎病的生防細菌NCD-2的田間效果評價及其鑒定[J].植物病理學(xué)報， 2005， 35(5): 451-455.

LIShe-zeng，LUXiu-yun，MAPing，etal. (2005).EvaluationofbiocontrolpotentialofabacterialstrainNCD2againstCottonVerticilliumwiltinfieldtrials[J]. Actaphytopathologicasinica, 35(5): 451-455.

IsolationandScreeningfor2StainsofAntagonisticBacteriaagainstAlternariasolaniofTomatoandStudyonAntagonisticEffect

YANG Rong1，YANG Wen-qi1，ZHANG Zheng2，ZHAN Fa-qiang1，HOU Min1，HOUXin-qiang1， BAOHui-fang1，WANG-Ning1，LONG Xuan-qi1

(1.InstituteofMicroorganismApplication,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.CollegeofLifeSciences&Technology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

【Objective】 Screening for bacteria againstAlternariasolaniotomato from rhizosphere of processing tomato.【Method】Isolating antagonistic bacteriafrom rhizosphere of processing tomatoby culture on medium plate, preliminary screening and second screening are carried on by paired culture, preliminary identification is based on morphological characteristic, phylogenetic analysis of 16S rDNA, antagonistic effect of fermentation broth against mycelium ofA.solaniis observed under microscope，relative control effect of fermentation brothof antagonistic bacteria is observed by pot incubation test.【Result】90trains of antagonisticbacteria have been isolated,from them, 3 strainsofbacteriahave been screened by preliminary screening while 2 strains by second screening with obvious antagonistic effect (J2-2, J2-4), and then the two stains were preliminary identified as allied species ofBacillusatrophaeusandBacillussubtilis, teratogenic effect of fermentation brothagainst pathogenic mycelium has been observed under microscope, the relative control effect of fermentation broth has been determined above 35% in pot incubation test.【Conclusion】The result shows that the two isolates with significant antagonistic effect toA.solanicould provide potential solution for biological control of early blighttomato.

Alternariasolani(tomato); isolation; screening; identification

LONG Xuan-qi(1969-)，，(E-mail)longxq_xj@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.016

2017-04-08

新疆維吾爾自治區(qū)科技成果轉(zhuǎn)化專項資金項目“設(shè)施農(nóng)業(yè)多價復(fù)合菌劑的示范推廣”(201554113)；新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項目“新疆加工番茄早疫病拮抗菌的分離與篩選”(xjnkq-2015027)

楊蓉(1981-)，女，新疆人，助理研究員，碩士，研究方向為土壤微生物，(E-mail)Lingxuan2519@126.com

龍宣杞(1969-)，女，四川人，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向為土壤微生物與微生態(tài)學(xué)，(E-mail)longxq_xj@sina.com

S188

：A

：1001-4330(2017)08-1496-09

Supported by: Special funds for the transformation of scientific and technological achievements of Xinjiang (201554113); Demonstration and Extension on Multiple Bacteria Preparation in Facility Agriculture；Academy of Agricultural Sciences Fund for Yong Scientists Fund (xjnkq-2015027) , Isolation and Screening of Antagonistic BacteriaagainstAlternariasolaniof Processing Tomato in Xinjiang.