邵延慧，張王斌，劉振亞，朱宗財，嚴海璘，李亞鵬，曹琦，但紅俠

(塔里木大學(xué)/塔里木大學(xué)南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

新疆南部塔河流域柳樹腐爛病病原菌的鑒定

邵延慧，張王斌，劉振亞，朱宗財，嚴海璘，李亞鵬，曹琦，但紅俠

(塔里木大學(xué)/塔里木大學(xué)南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

【目的】通過對病原菌形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)形狀觀察，結(jié)合分子生物技術(shù)ITS和β-tubulin序列分析，明確新疆南疆柳樹腐爛病菌種類和遺傳分化。【方法】采集柳樹腐爛病并獲得病菌純培養(yǎng)，對腐爛病菌分生孢子器進行縱橫切片并觀察記錄形態(tài)數(shù)據(jù)，將病原菌置于不同營養(yǎng)條件和環(huán)境條件下觀察記錄其培養(yǎng)形狀，采用ITS和β-tubulin序列分析方法結(jié)合，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。【結(jié)果】分子孢子器和分子孢子形態(tài)特征與金黃殼囊孢菌(C.chrysospermaPer.ex Fr.)一致；菌絲生長最適溫度20～30℃，最適pH值為5～6，最適碳氮源分別是葡萄糖和蛋白胨；經(jīng)β-tubulin序列分析，與殼囊孢屬不同種類的序列相似度為96%以上；在室內(nèi)離體接種條件下病原菌均能成功侵染其他5種樹木?！窘Y(jié)論】引起新疆南部塔河流域柳樹腐爛病原菌為金黃殼囊孢菌(C.chrysospermaper.exFr)，不同來源的病原菌存在一定的遺傳分化，在室內(nèi)可侵染楊樹、胡楊、棗樹、梨和蘋果，并可在胡楊和楊樹上產(chǎn)生分生孢子器。

柳樹腐爛病；形態(tài)特征；培養(yǎng)性狀；ITS；β-tubulin

0 引 言

【研究意義】新疆南部荒漠生態(tài)環(huán)境極為脆弱，防護林為綠洲農(nóng)業(yè)的種植提供了有效的保障[1]。近年來發(fā)現(xiàn)新疆主栽防護林柳樹腐爛病越發(fā)嚴重，已經(jīng)制約了新疆南部荒漠綠洲生態(tài)區(qū)特色果品的可持續(xù)發(fā)展[2-3]，對柳樹腐爛病菌進行鑒定，明確其種類和來源，對新疆南部荒漠綠洲生態(tài)區(qū)特色果園合理布局具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】邢紅亮等[4]研究表明核桃腐爛病菌能夠成功侵染楊樹、柳樹、蘋果樹、棗樹、胡楊、梨樹等多種樹木枝條，說明該病菌的寄主廣泛；桂騰茸等[5]對蘋果樹腐爛病菌的生物學(xué)特性及致病性進行了研究，腐爛病菌優(yōu)勢種是V.Ceraterapema，其種內(nèi)出現(xiàn)了明顯的菌群分化和致病力分化現(xiàn)象；王衛(wèi)雄[6]通過形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS、EF1-α以及β-tubulin三種基因序列分析，確定了甘肅省蘋果樹腐爛病菌分為2類；劉鈺嬌[7]通過rDNA-ITS基因序列分析，明確河北省蘋果樹腐爛病菌為Valsamali；唐俊煜[8]通過rDNA-ITS、EF1-α以及β-tubulin基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)楊樹、柳樹、棗樹等林木腐爛病菌全部由C.chrysosperma(有性型V.sordida)引起。【本研究切入點】國內(nèi)關(guān)于柳樹腐爛病的研究較少，相關(guān)研究多集中于經(jīng)濟效益較高的果樹，近些年關(guān)于柳樹腐爛病的研究多涉及該病害的防治及病害的發(fā)生規(guī)律等[9]。研究柳樹腐爛病菌進行鑒定以及培養(yǎng)性狀。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究柳樹腐爛病菌的鑒定、培養(yǎng)性狀及致病性，為柳樹腐爛病的防治以及果樹防護林樹種的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

從溫宿(N 41°16' 15.92"，E 80°17' 50.63")、第一師阿拉爾市(N 40°32' 35.98"，E 81°18' 0.69")、十二團(N 40°29' 46.95"，E 81°16' 1.15")和三團(N 40°22' 1.37"，E 80°3' 27.37")防護林選取柳樹腐爛病的發(fā)病枝條和樹皮4份，用采集刀刮取病皮( 含健康組織) 或用枝剪剪取病枝條，放于牛皮紙標本袋中備用。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離

用常規(guī)組織分離法獲得病原菌純培養(yǎng)[10]，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定

采用離體枝條接種法[11]，置于25℃下培養(yǎng)，每隔24 h觀察并記錄病斑擴展、產(chǎn)孢體形成情況。

1.2.3 子實體形態(tài)特征觀察

對從田間采集到病組織上的產(chǎn)孢體進行切片觀察，在顯微鏡(13395H2X )下觀察分生孢子器外部形態(tài)、腔室數(shù)量及縱橫切面形態(tài)特征并測量其大??；觀察分生孢子形態(tài)并測量孢子大小。

1.2.4 不同條件下病菌生長特性觀察

1.2.4.1 不同環(huán)境條件下病菌生長特性觀察

將供試菌株接于不同 pH 值(2、3、4、5、6、7、8、9、10 )和不同溫度(5、15、20、25、30、35和40℃)條件下的 PDA 平板上，置于 25℃，暗培養(yǎng)，每處理 3 個重復(fù)，每隔24 h測量菌落直徑，記錄菌落形態(tài)特征。

1.2.4.2 不同營養(yǎng)條件(C/N源)下菌絲生長特性觀察

以查彼克培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將供試菌株分別接于不同碳源(葡萄糖、麥芽糖、淀粉代替蔗糖和空白對照)、不同氮源(分別用等量( 0.13 g /L ) 的蛋白胨、甘氨酸、硝酸鉀代替硝酸鈉和空白對照)條件下，按照常規(guī)方法接種到培養(yǎng)基上，每皿接1個菌餅。每處理3次重復(fù)，25 ℃ 條件下培養(yǎng)，每隔24 h測量菌落直徑并記錄菌落的形態(tài)特征。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定

1.2.5.1 菌絲的培養(yǎng)和DNA提取

腐爛病菌菌絲的培養(yǎng)和基因組DNA的提取，參照王衛(wèi)雄[6]的方法進行。

1.2.5.2 基因片段的 PCR 擴增

病原菌ITS序列擴增的引物ITS1和ITS4以及擴增條件參照殷輝等[12]的方法進行；應(yīng)用引物Beta-F和Beta-R擴增β-tubulin序列，擴增條件均參照郭開發(fā)等[13]的方法進行。

將不同引物擴增的PCR產(chǎn)物送到華大基因科技有限公司進行測序。獲得序列后，登陸NCBI網(wǎng)站，進行BLAST同源性比對分析，同時下載同源性序列，選取PCR擴增的500 bp片段，使用MEGA5.02軟件以鄰接法建立進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實體形態(tài)特征

對采集四份病原菌進行分離和鑒定，表明其分生孢子均呈臘腸形，無色，單胞，具有13～20個數(shù)量不等的腔室，腔室大小不一，形狀不規(guī)則，共用腔室璧，僅一個孔口通向表皮外，大小為4.75 μm～5.89 μm×1.40 μm～3.21 μm。分生孢子橫切面大小為2 380.78 μm～1 000.40 μm×2 268.13 μm～890.10 μm，縱切面大小3 318.20 μm～708.08 μm×670.49 μm～338.07 μm。根據(jù)《植物病原真菌學(xué)》[14]的描述和范鑫磊[15]、張慶濤[16]的研究結(jié)果，柳樹腐爛病菌病原與金黃殼囊孢(C.chrysospermaPer.exFr.)相似度最高。圖1～3

圖1 分生孢子器橫切片

Fig.1 Pycnidium cross section

圖2 分生孢子器縱切片

Fig.2 Pycnidium longitudinal section

圖3 分生孢子

Fig.3 Conidia

2.2 不同條件下菌絲生長特性

2.2.1 不同溫度/pH對菌絲的長的影響

研究表明，從采集的四份柳樹發(fā)病枝條分離獲得柳樹腐爛病菌在5～15℃時是低溫抑制菌落的生長，35～40℃時是高溫抑制菌落的生長。在20～30℃時菌落生長較快，菌絲質(zhì)密且色素分泌較多，皿底呈淺褐色。在5～15℃、35～40℃時菌落的生長變化巨大且在兩個抑制生長的溫區(qū)菌落生長慢且產(chǎn)生色素少。圖4

研究表明，病菌在pH 2～10均可生長，最適pH為5～7，在pH為6時生長最快，而且產(chǎn)孢最多。在pH小于5區(qū)間和pH大于7區(qū)間病菌生長受到不同程度的抑制，說明柳樹腐爛病菌不適合在堿性條件下生長。圖4

圖4 溫度/pH對柳樹腐爛病菌菌落生長的影響

Fig.4 Effect of temperature/pH on the growth of rot pathogen of willow

2.2.2 碳源/氮源對菌絲生長的影響

研究表明，病菌對麥芽糖、淀粉利用率很低。在72 h內(nèi)觀察，不同碳源培養(yǎng)基上生長量存在差異，在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲顏色乳白、匍匐生長、分泌色素較多，生長最快且產(chǎn)孢快，菌落呈圓形輻射狀生長。以麥芽糖，淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌絲透明、匍匐生長、不分泌色素，產(chǎn)孢慢，菌落呈圓形輻射狀生長。在無碳條件下菌落生長速度較為緩慢，菌絲稀疏，菌落為無色透明狀，產(chǎn)孢慢，呈圓形輻射狀生長。由此說明以葡萄糖為最適碳源。

病菌在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上生長最好，起初菌絲透明，后變?yōu)槿榘咨屹橘肷L，產(chǎn)孢快，色素為淺褐色。在以硝酸鉀、甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基上菌絲透明，色素分泌較少，生長較慢，菌落呈匍匐狀生長，產(chǎn)孢慢。由此說明以蛋白胨為最適氮源。表1

表1 碳源/氮源下菌絲生長變化

Table 1 Effect of carbon/nitrogen sources on hyphae growth

碳源/氮源Carbon/nitrogensource菌落生長平均值Colonygrowthaverage(cm)24h48h72h淀粉/蛋白胨Starch/Peptone0 8/1 421 15/3 671 55/6 73葡萄糖/甘氨酸Glucose/Glycine0 8/0 81 52/1 22 42/2 48麥芽糖/硝酸鉀Maltose/Potassiumnitrate0 8/0 80 85/1 750 97/3 27CK(無碳/無氮)CK(Nocarbon/nonitrogen)0 8/0 80 83/00 88/1 2

2.3 DNA分子序列

利用ITS和β-tubulin兩個基因引物腐爛病菌進行PCR擴增，均可獲得明亮清晰的條帶，片段大小為540和500 bp，將所得的序列在GenBank中通過Blast比對，下載相似性較高的序列并與4株菌株，以phomopsissp序列作為外群，利用MEGA5.02軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。在基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，4株菌株與下載的序列聚在一支，說明4株菌株在ITS核苷酸序列上分化較小，ITS序列提供的信息位點不能區(qū)分供試病原菌的種間差異，因此無法將4株菌株鑒定到具體的種類；在基于β-tubulin序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株LI01與C.chrysosperma(KM034883、KF498689)、菌株LI02和LI03與C.chrysosperma(KM034885、JQ900372)、菌株LI04與C.chrysosperma(KF039741)聚在不同的分支，表明不同柳樹的腐爛病菌株存在一定的遺傳分化。圖5～7

圖5 柳樹腐爛病菌PCR擴增結(jié)果

Fig.5 PCR products of ITS、β-tubulin of C.chrysosperma

圖6 ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ)

Fig.6PhylogramusingITSsequencesdata

圖7 β-tubulin序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ)

Fig.7 Phylogram using β-tubulin sequences data

2.4病菌對新疆南部塔河流域主栽果樹和防護林樹木致病性

研究表明，將該病菌在25℃接種于6種寄主枝條，觀察其病斑的擴展速度與病斑顏色間的差異及是否產(chǎn)生分生孢子角。楊樹、胡楊最先出現(xiàn)病斑，胡楊的病斑擴展速度比楊樹的快，柳樹病斑的擴展速度較胡楊和楊樹緩慢；胡楊最先產(chǎn)孢，分生孢子角為橘黃色，楊樹枝條產(chǎn)孢晚于胡楊，分生孢子角為橘黃色，產(chǎn)孢時間略有差異，胡楊最快楊樹次之，柳樹最慢。蘋果樹、梨樹和棗樹均可產(chǎn)生病斑，但不產(chǎn)生分生孢子角。接種7 d后出現(xiàn)褐色、水漬狀病斑，隨后病斑向四周擴展，病斑部位表皮皺縮，病健交界明顯。12 d能病斑表面均能產(chǎn)生小黑點。表2

表2 柳樹腐爛病菌對不同寄主的致病性測定

Table 2 Measuring results of Willow valsa cankers rot pathogenicity of Fusarium moniliforme on different trees

寄主Namesoffruittrees致病性發(fā)病率(%)Diseaseincidence是否產(chǎn)孢Sporulation產(chǎn)孢時間Sporulationtime(d)孢子角顏色Cirruscolor柳樹Willow100是10橘黃色楊樹Poplar100是9橘黃色胡楊Populusdiversifolia100是8橘黃色棗樹Datetrees100否--梨樹Peartrees100否-蘋果樹Appletree100否--

注：-表示未產(chǎn)孢

Note： - Indicates that no produce spores

3 討 論

根據(jù)病原菌分生孢子器腔室形態(tài)、孔口數(shù)量和分生孢子等相對較穩(wěn)定的形態(tài)特征對供試菌株進行鑒定，研究結(jié)果與范鑫磊[15]和張慶濤[16]對金黃殼囊孢菌形態(tài)特征的研究結(jié)果相近；根據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)性狀也可以作為種類鑒定的輔助依據(jù)，因此，對供試菌株的培養(yǎng)性狀進行研究，其菌絲生長最適溫度20～30℃，最適pH值為5～6，最適碳氮源分別是葡萄糖和蛋白胨，研究結(jié)果與冀瑞卿等[17]對金黃殼囊孢菌的培養(yǎng)性狀結(jié)果一致。結(jié)合形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀，初步確定供試菌株可能是金黃殼囊孢菌或是相似種。

殼囊孢屬Cytospora種類較多，分布范圍廣，種間的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀具有很高的相似性，僅依靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)準確鑒定十分困難[13]。因此，研究結(jié)合ITS和β-tubulin序列片段對病原菌進行鑒定，通過ITS序列分析發(fā)現(xiàn)，供試菌株ITS序列與C.chrysosperma(KP114125、KP114129、KP114134、KP114124)、C.tritici(KF293771)、V.sordida(AB369506)、V.nivea(KF293929)序列高度相似，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果與之一致，因此，僅通過ITS序列片段無法將病原菌鑒定到具體的種類，說明在真菌分類中采用ITS序列片段進行分析時存在一定的局限性，在其序列片段上存在一定的保守區(qū)，難以區(qū)分殼囊屬種間復(fù)雜的差異性，因此在研究系統(tǒng)發(fā)育時需使用多基因分析法，才能使結(jié)果更加準確，所以使用β-tubulin序列對供試菌株進行分析，發(fā)現(xiàn)4株菌株與不同登陸號的C.chrysosperma高度相似，在系統(tǒng)發(fā)育樹也聚在不同的分支上，說明4株菌株親緣關(guān)系存在差異，這種差異與菌株的地理來源有一定的關(guān)系。

致病性的測定中發(fā)現(xiàn)，柳樹腐爛病接種在梨樹植條上只產(chǎn)生病斑而不產(chǎn)生產(chǎn)孢器，與唐俊煜[8]在柳樹植條上接種香梨腐爛病只產(chǎn)生病斑不產(chǎn)生產(chǎn)孢器，說明二者相互侵染的能力較弱，可以在梨園周圍種植柳樹作為防護林。

4 結(jié) 論

4.1 通過形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、結(jié)合分子生物學(xué)輔助鑒定方法，將柳樹腐爛病菌準確鑒定為金黃殼囊孢(C.chrysospermaPer.exFr.)，采自不同地點的病原菌之間存在一定的遺傳分化。

4.2 對供試菌株的培養(yǎng)性狀進行研究，研究結(jié)果為供試菌株菌絲生長最適溫度20～30℃，最適pH值為5～6，最適碳氮源分別是葡萄糖和蛋白胨。

4.3 柳樹腐爛病病原菌可使楊樹、胡楊發(fā)病嚴重；使棗樹、梨樹和蘋果樹發(fā)病但不產(chǎn)生分生孢子器。在生產(chǎn)實際中提倡在梨園、棗園和蘋果園周圍可以種植柳樹為防護林，在防護林的建設(shè)時盡量減少柳樹與胡楊和楊樹混栽。

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IdentificationofWillowValsaCankersPathogenintheTarimRiverBasininSouthernXinjiang

SHAO Yan-hui, ZHANG Wang-bin, LIU Zhen-ya, ZHU Zong-cai, YAN Hai-lin,LI Ya-peng, CAO Qi, DAN Hong-xia

(TarimUniversity/SouthernXinjiangKeyLaboratoryofIPMofTarimUniversity,AlarXinjiang843300,China)

【Objective】 Through the study on pathogenic bacteria culture morphology and shape observation, combined with analysis of molecular biology techniques ITS and β-tubulin sequence analysis, this project aims to make clear how many kinds of willow valsa cander pathogens there are and their genetic differentiation in southern Xinjiang.【Method】Willow valsa cankers pathogen was collected and pure culture of pathogen was obtained. The conidia of the pathogen of pathogenic bacteria were divided into longitudinal and vertical sections and the morphological data were observed. Using ITS and β--tubulin sequence analysis method, the phylogenetic tree was successfully constructed. The most optimum pathogen was studied after β-tubulin sequential analysis.【Result】The pycnidium and conidia characteristics were consistent with the reportedCytosporachrysosperma. The most optimum conditions for the growth of pathogenic bacteria were the temperature between 20℃-30 ℃, the PH was 5-6, and the suitable carbon and nitrogen sources were glucose and peptone, respectively. ITS and β-tubulin analysis showed the sequence was up to 96% identical withCytosporaspp.; Pathogenic bacteria could infect 5 kinds of trees successfully in the in vitro inoculation conditions.【Conclusion】Biological observation and molecular sequence analysis showed that the pathogen causing willow valsa cankers in Tarim River basin of southern Xinjiang isCytosporachrysosperma. There are some genetic differentiations among pathogens from different sources. These pathogens can infect poplar, populus euphratica, jujube tree, pear and apple, and produce conidia in populus euphratica and poplar inside the room.

the willow valsa cankers in Tarim River basin in southern Xinjiang; morphological character; culture characteristics; ITS；β-tubulin

ZHANG Wang-bin (1974- ), male, Chengcheng in Shanxi, Associate Professor, Master Instructor.research field: Plant pathology. (E-mail)zwbzky@163.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.014

2017-06-02

國家自然科學(xué)基金項目“新疆棗園林果樹木腐爛病菌遺傳多樣性及致病力分化研究”(31660034)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新項目(201610757006)

邵延慧(1992-)，女，碩士研究生，研究方向為果樹優(yōu)質(zhì)高效栽培生理，(E-mail)18399576075@163.com

張王斌(1974-)，男，陜西澄城人，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為植物病理學(xué)，(E-mail)zwbzky@163.com

S-43；S763.1

：A

：1001-4330(2017)08-1481-08

Supported by: National Natural Science Foundation of China "Genetic Diversity and Pathogenicity Differentiation in Rotting Jujube Trees in Xinjiang"(31660034)and National College Students Innovation Program (201610757006)